Nous allons démontrer la configuration et l'analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d'un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.
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Article de méthode
Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Quantitative PCR en temps réel (QPCR) a émergé comme un outil précis et précieux dans le profilage des niveaux d'expression génique. Un de ses nombreux avantages est une limite inférieure de détection par rapport à d'autres méthodes de profilage de l'expression des gènes en utilisant de petites quantités d'entrée pour chaque dosage. Automatisé de configuration qPCR a amélioré ce domaine en permettant une plus grande reproductibilité. Sa mise en pratique et rapide permet d'expériences à haut débit, permettant le profilage de nombreux gènes différents simultanément dans chaque expérience. Cette méthode avec des contrôles plaque interne réduit également les variables expérimentales communes à d'autres techniques. Nous avons récemment développé un test de PCR quantitative pour le profilage de la pré-microARN (pré-miARN) en utilisant un ensemble de 186 paires d'amorces. Les microARN sont apparus comme une nouvelle classe de petits ARN non-codants avec la capacité de réguler les cibles ARNm nombreuses au niveau post-transcriptionnel. Ces petits ARN sont d'abord transcrit par l'ARN polymérase II comme un miARN primaires (PRI-miARN) transcription, qui est ensuite clivé dans le miARN précurseur (pré-miARN). Pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme où Dicer clive la boucle en épingle à cheveux à céder miARN matures. L'augmentation des niveaux de miARN peuvent être observées à la fois le précurseur et le niveau miARN matures et de profilage de ces deux formes peuvent être utiles. Il existe plusieurs dosages disponibles commercialement pour miARN matures, mais leur coût élevé peut dissuader les chercheurs de cette technique de profilage. Ici, nous discutons d'un bon rapport coût-efficacité, la fiabilité, la méthode qPCR SYBR à base de profilage de pré-miARN. Les changements dans les niveaux de pré-miARN sont souvent le reflet des changements miARN mature et peut être un indicateur utile de l'expression du miARN mature. Toutefois, le profilage simultané des deux pré-miARN et miARN mature peut être optimale, car ils peuvent apporter des informations non redondantes et de donner un aperçu du traitement de microARN. Par ailleurs, la technique décrite ici peut être étendu pour englober le profilage des ensembles d'autres bibliothèques pour les voies spécifiques ou des agents pathogènes.
Protocole
Les tableaux qPCR profilage pré-miARN peuvent être mis en place comme entièrement automatisée avec un robot Tecan Freedom EVO (A) ou à la main avec la pipette multicanaux matrice électronique (B).
1) Préparer le mélange maître, plaques apprêt et échantillons.
- Plaques amorce contenant 186 paires d'amorces au format 96 puits (un total de 2 plaques) à 12h05 doit être stocké à -80 ° C. Plaques décongeler à température ambiante, vortex et centrifuger brièvement avant utilisation.
- Pour préparer le mélange maître, dégeler SYBR Green PCR 2x Mélanger à température ambiante. Chaque réaction utilise master mix 8ul avec un apprêt....
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Discussion
QPCR est un test très sensible qui peuvent être utilisés pour comparer les niveaux d'expression génique entre les échantillons dans une étude, ainsi que pour déterminer la positivité dans le cas des virus. L'avantage d'utiliser des tableaux qPCR est la capacité d'exécuter de nombreuses amorces (dans notre cas, 186 paires d'amorces) pour chaque échantillon dans un court laps de temps. L'utilisation d'un robot de pipetage tels que l'Evo Tecan Freedom, le montant de temps requis pour mettre .......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH DE018304, R01DE018281. KT est soutenu par T32 GM07092-34 et par une subvention à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill de Howard Hughes Medical Institute (HHMI) à travers la Méditerranée en Grad Initiative. PC T32 est soutenu par CA009156.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Pipette multipipette électronique Matrix | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (ou tout multipipette Thermo Scientific comparable pouvant pipeter les volumes décrits ci-dessus) |
| Boutons filtrants Matrix Integrity, stériles | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (ou bouton comparable pour le multipipette utilisé) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Instrument Lightcycler 480 II | Roche Group | 05015243001 | version 384 puits |
| Plaque multipuits Lightcycler 480 384, blanche | Roche Group | 04729749001 | |
| Feuille de scellage LightCycler 480 | Roche Group | 04729757001 | |
| Logiciel d'analyse multiplaque LightCycler 480 | Roche Group | 05075122001 | |
| Décontaminant Eliminase | Decon Laboratories | 04-355-31 |
Références
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated....
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Réimpressions et autorisations
