Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

Published: December 23, 2010 doi: 10.3791/2315
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Immunology, James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville

Summary

وتصف هذه الورقة منهجية لتحديد استجابة الكيميائي من الكريات البيض ليغاندس محددة وتحديد التفاعلات بين مستقبلات سطح الخلية والبروتينات عصاري خلوي باستخدام تقنيات التصوير الخلية الحية.

Abstract

مستقبلات البروتين يقترن G - (GPCRs) تنتمي إلى عائلة البروتينات عبر الغشاء سبعة والتوسط في تنبيغ من خارج الخلية إشارات إلى استجابات الخلايا. GPCRs تحكم في وظائف مختلفة مثل البيولوجي الكيميائي ، جواني الافراج الكالسيوم ، وتنظيم الجينات بطريقة تعتمد يغند عبر heterotrimeric G - البروتينات 1-2. يجند ملزم يؤدي الى سلسلة من التغييرات متعلق بتكوين يؤدي إلى تفعيل heterotrimeric G - البروتينات التي تعدل مستويات الرسل ثانية مثل الأدينوزين الحلقي الأدينوساين (المخيم) ، اينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) والجلسرين diacyl (DG). بالتزامن مع تفعيل مستقبلات ملزم يجند يبادر أيضا سلسلة من الأحداث للتخفيف من مستقبلات الإشارات عبر عزل ، الحساسية و / أو الداخلي. عملية إزالة التحسس من GPCRs يحدث عن طريق الفسفرة بواسطة مستقبلات مستقبلات كاينيسات G - البروتين (GRKs) وملزمة لاحقة من arrestins β - 3. β - arrestins هي بروتينات عصاري خلوي ونقل من مكان لآخر لغشاء على تنشيط النوع من الاختزال ، ملزم لمستقبلات فسفرته (معظم الحالات) من خلال تسهيل استيعاب هناك مستقبلات 4-6.

Leukotriene ب 4 (LTB 4) هو جزيء الدهون الموالية للالتهابات مشتقة من حمض الأراكيدونيك المسار ويتوسط أعمالها عبر GPCRs ، LTB 4 مستقبلات 1 (BLT1 ؛ مستقبلة تقارب عالية) ومستقبلات LTB 4 2 (BLT2 ؛ مستقبلة تقارب منخفضة ) 7-9. وقد تبين أن 4 - BLT1 LTB الطريق إلى أن تكون حاسمة في الأمراض الالتهابية عدة من بينها ، والتهاب المفاصل والربو وتصلب الشرايين 10-17. توضح هذه الورقة على المنهجيات الموضوعة لرصد LTB 4 - الكريات البيض بفعل الهجرة وتفاعلات مع BLT1 arrestin - β ، وإزفاء مستقبلات في الخلايا الحية باستخدام تقنيات التصوير المجهري 18-19.

وقد تم عزل خلايا نخاع العظام الجذعية المستمدة من C57BL / 6 و الفئران مثقف كما هو موضح سابقا 20-21. وقد اختبرت هذه الخلايا في خلية حية أساليب التصوير لإثبات LTB 4 خلية بفعل الهجرة. وكان الموسومة BLT1 الإنسان مع بروتين فلوري الأحمر (BLT1 - RFP) في محطة C - β arrestin1 والموسومة مع بروتين الفلورية الخضراء (β - ARR - GFP) وtransfected على حد سواء في البلازميدات الجرذ قعد Leukomia (RBL - 2H3) خطوط الخلية 18-19. وتم رصد حركية التفاعل بين هذه البروتينات والتوطين باستخدام المجهر يعيش الفيديو الخلية. المنهجيات الحالية في ورقة تصف استخدام التقنيات المجهرية للتحقيق في الاستجابات الوظيفية للمستقبلات البروتين G - يقترن في الخلايا الحية. هذه الورقة توضح أيضا استخدام البرمجيات Metamorph لقياس كثافة مضان لتحديد حركية مستقبلات البروتين وتفاعلات عصاري خلوي.

Protocol

المنهجية

وصف مجهر

أجريت تجارب حية التصوير الخلية باستخدام برنامج التحصين الموسع TE - FM - الإسفار النظام المرفق إلى مجهر مقلوب نيكون الكسوف TE300. المجهر مجهزة مرحلة التسخين. ومرفق تبريد المفاجئة HQ الرقمية B / W CCD (روبر العلمية) والكاميرا الضوئية تصفية 10-2 LAMDA المغير (سوتر شركة الصك) إلى المجهر. يتم التحكم في الإثارة وانبعاث موجات التصفية مع عجلات والتي تسيطر عليها 02/10 لامبا تحكم عجلة التصفية ، ينبغي التعرض سوتر شركة صكوك الوقت 500 مللي تكون كافية لعرض أو طلب تقديم العروض GFP في الخلايا الحية. وتسيطر سيطرة الأجهزة واقتناء الصور بواسطة برنامج Metamorph. اختيار المرشحات للدراسة الحالية هي تصفية مجموعات S480/20x ، وS525/40m S565/25x ، S620/60m لGFP وRFP ، على التوالي ؛ EGFP / مزدوج مزدوج اللون DsRed والتكنولوجيا كروما. وهذا يمكن أن عجلة تصفية تستوعب ما يصل إلى ست مجموعات التصفية. ومرفق مع المجهر وقبل مرحلة وحدة تحكم Proscan مع العصا الفرح. يمكن السيطرة على كل هذه الأجهزة بواسطة برامج مرفقات Metamorph. ويرد أيضا المجهر مع Micromanipulators لعقد micropipettes.

ألف باء (4) قياس Leukotriene إخراج هجرة الخلايا شجيري

باستخدام المجهر الإعداد أعلاه وصفها ، طورنا أساليب ليجند التالية الموجهة الهجرة الخلية الجذعية في الوقت الحقيقي. وترد اثنين micromanipulators (Narishige) إلى المجهر. تم تسجيل الكيميائي من نخاع العظام المستمدة الماوس الخلايا الجذعية (BMDCs) نحو الانحدار LTB 4. هنا ، نحن وصف الطرق لاعداد الماصات الدقيقة باستخدام الدقيقة ماصة مجتذب ، تحميل يجند في الدقيقة ماصة ووضع التجربة الكيميائي في مرحلة ساخنة من المجهر لمراقبة الهجرة الاتجاه من الخلايا. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لاختبار فعالية chemoattractants متميزة في إحداث الهجرة ، فضلا عن تأثير مثبطات الكيميائي في الخلايا الحية. وقد وصفت عزلة BMDCs 21 من الماوس في منشورات عديدة من بينها 22 إن الرب.

1. إعداد BMDCs

  1. لوحة BMDCs (بعد زراعة لمدة 10 يوما) على طبق زلة لتغطية الجزء السفلي الفلوري والسماح لها أن تنمو لمدة 16 ساعة قبل التجربة.
  2. غسل الخلايا مع 3 مل من 1X PBS على الأقل 2 مرات (بإضافة 3 مل من 1X PBS لوحة والشفط خارج المخزن).
  3. إضافة 2 مل من لوحة 1XPBS. الخلايا على استعداد الآن للتجربة. إبقاء الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية قبل التجربة.

إعداد الدقيقة يجند ماصة المحملة :

  1. إصلاح الأنابيب الشعرية الزجاج (زجاج قياسية ، 0.75 مم × 0.4 مم ؛ 6 "، القط # 625500 ، AM الأنظمة ، INC) على مجتذب micropipette العمودي (Narishige الدولية في الولايات المتحدة ، وشركة).
  2. المحافظة على درجة الحرارة عند 52 درجة مئوية ، والسماح للزجاج في الذوبان ، ومزق لتشكيل نصائح حافة حادة.
  3. إصلاح ماصة على حامل الدقيقة ماصة.
  4. السلس حواف خشنة من ماصة الجزئي باستخدام مايكرو صياغة M - 900 (Narishige الدولية في الولايات المتحدة ، وشركة) من خلال مراقبة تحت المجهر.
  5. إعداد ما لا يقل عن 10-20 ماصات لكل تجربة. ملاحظة : يمكن أيضا أن يكون micropipettes شراؤها من الآلات الدقيقة العالم (TIP μ ، T1801TW1F).
  6. المطلوب اتخاذ تركيز (500 ميكرولتر من 100 نانومتر LTB 4 في التجربة الحالية) من 1 إلى يجند أنبوب effendorf مل والحفاظ على الحافة الصغيرة ماصة في الحل والسماح الحل للدخول في الدقيقة ماصة (تعبئة الخلفية).
  7. أخذ 1 مل من يجند والى الحقنة (1 سم مكعب توبركولين حقنة) وملء ببطء يجند باستخدام الصغرى ، تعبئة الإبرة (MF 28G - 5 ، الآلات الدقيقة العالم) في الدقيقة ماصة من أعلى.
  8. إرفاق الأنبوب ، الذي يناسب بإحكام إلى ماصة للماصة وأنبوب لإبرة (21 G 11 / 2) الملحق حقنة 1 مل ، وهي مليئة يجند.
  9. الآن ، نقل بدقة متناهية الصغر مملوءة يجند ماصة للمرحلة المجهر والإصلاح على المتلاعبين الجزئي.
  10. القليل من الضغط لجعل حقنة يجند تأكد من الافراج عن ببطء من غيض.
  11. جلب BMDCs مطلي غير ناضجة للمجهر والاحتفاظ بها على لوحة الساخنة (37 درجة مئوية) المرحلة.
  12. إزالة غطاء الطبق الفلوري.
  13. تركيز الخلايا باستخدام النفط العدسة الشيئية الغاطسة 60X.
  14. بعناية ، واسقاط يجند تحميل ماصة باستخدام 'مناور المختصر الخشنة MN - 188NE" لقربها من الخلايا.
  15. تركيز ماصة باستخدام 'Micromanipulator الجميلة هيدروليكي MN - 188 NE.
  16. الضغط قليلا من الحقنة للتأكد من أن يجند تنشر في الطبق.
  17. تعيين المعلمات الحصول على الصور للحصول على مشرق في المقدمة (10 مللي التعرض) في كل ثانية 15 لمدة 2 ساعة Metamorph باستخدام البرمجيات.
  18. إبقاء لمتابعة كل 30 دقيقة لالأسبوعيةogression الهجرة نحو يجند.
  19. إذا كانت مزدحمة في طرف الخلايا الماصة ، تغيير الموقع من طرف في لوحة لمواصلة الهجرة من التجربة.

باء قياس النوع من الاختزال (BLT1) والبروتين عصاري خلوي (β - arrestin) التفاعلات ، إزفاء في الخلايا الحية

1. إعداد التركيبات DNA البلازميد

وقد وصفت تفاصيل يبني DNA البلازميد في بيت جالا وآخرون (2005) 18.

2. ترنسفكأيشن البشرية BLT1 - RFP وβ - Arrestin GFP - 2H3 - RBL في خلايا

  1. الحفاظ على الجرذ قعد Leukomia (RBL - 2H3) خلايا (60 إلى 70 ٪ التقاء) عند 37 درجة مئوية في جو ترطيب الهواء بنسبة 95 ٪ ، 5 ٪ CO 2 والثقافات في وسائل الإعلام نمو أحادي الطبقة (FBS DMEM تستكمل مع 15 ٪ (2) ملي L - الجلوتامين ، 100 U / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) في قوارير T75.
  2. فصل الخلايا من صحن / قوارير باستخدام 6 مل من التربسين - EDTA (0.05 ٪ التربسين ، 0.53 ملي EDTA) واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في جو ترطيب الهواء بنسبة 95 ٪ ، 5 ٪ CO 2. يهز بلطف قوارير لرصد مدى مفرزة من الخلايا.
  3. إضافة 6 مل من وسائط النمو إلى قارورة تحتوي على 6 مل من التربسين - EDTA وجمع الخلايا من خلال خلطها بواسطة pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل الخلايا في أنابيب الصقر 15 مل.
  4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات واتخاذ 4 × 10 6 خلايا في 15 مل من أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق 480g وresuspend في 200 ميليلتر من وسائل الإعلام ترنسفكأيشن (DMEM ، و 20 ٪ FBS ، 50 HEPES ملم). إذا كنت تخطط لتنفيذ 3 transfections ، وإعداد الخلايا وسائل الإعلام tranfection تبعا لذلك زيادة عدد الخلايا وحجم ترنسفكأيشن المتوسطة.
  5. إعداد البلازميدات أن transfected في تركيزات لا يقل عن 1.5 ميكروغرام / ميكرولتر. نحن نستعد للالحمض النووي البلازميد باستخدام الحمض النووي QIAGEN ماكسي عدة البلازميد. إضافة الفردية أو كليهما السلطات الوطنية المعينة بلازميد ترميز للإنسان BLT1 - RFP (25 ميكروغرام) وβ - arrestin1 GFP (15 ميكروغرام) لcuvettes الكهربائي عقيمة ، (بيو راد # 16552088) ، الذي 0.4 الفجوة القطب سم.
  6. تأخذ 200 ميكرولتر من خلايا معلق أعلاه ووضعها في cuvettes تحتوي إما hBLT1 - RFP أو β - arrestin1 GFP أو كليهما معا ، ومزجها مع بلطف ماصة 1 مل العقيمة.
  7. مغادرة cuvettes أعلاه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  8. Electroporate الخلايا في الجينات بولسير الثاني مع الجهد 250 فولت و قدرة μF 500.
  9. بعد السماح للخلايا electroporation البقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  10. 1 مل من اتخاذ المتوسطة النمو المنتظم ومزجها مع خلايا electroporated في cuvettes.
  11. توزيع 300 ميكرولتر من هذا الخليط في أطباق زجاجية 35 ملم نسيج الثقافة القاع (طبق الفلوري ، الآلات الدقيقة الدولي) التي تحتوي على 2 مل من وسائط النمو المنتظم واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 في جو ترطيب الهواء 95 ٪ درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. السماح للخلايا التمسك قاع الطبق.
  12. استبدال وسائل الاعلام بعد 1 ساعة من الحضانة مع وسائل الاعلام النمو المنتظم والسماح لهم تنمو بمعدل 37 درجة مئوية في جو ترطيب الهواء بنسبة 95 ٪ ، 5 ٪ CO 2 حاضنة لل18-24 ساعة.

3. تعيش خلية التصوير

اقتناء الصور

  1. بعد 18-24 ساعة ، وغسل الخلايا 2 أو 3 مرات مع 2 مل من الفينول RPMI الدافئة التي تحتوي على الخطوط الحمراء HEPES 10 مم ، ودرجة الحموضة 7.55 (أضف 2 مل من وسائل الاعلام مباشرة إلى لوحة الدافئة ووسائل الإعلام نضح كرر 2 أو 3 مرات). إضافة 1.8 مل من الفينول RPMI الدافئة التي تحتوي على الخطوط الحمراء HEPES 10 مم.
  2. مكان الزجاج 30 ملم الأطباق الثقافة ساترة القاع التي تحتوي على خلايا RBL - 2H3 ، transfected مع hBLT1 - RFP وβ - arrestin1 - GFP على المسرح المجهر الساخنة (37 درجة مئوية).
  3. جمع الصور في خلية باستخدام التكبير 600x 60 X الهدف نيكون خطة آبو 60X/1.4 النفط فتحة عدسة رقمية الغمر (متاح في النظام المجهر لدينا).
  4. أحال وضع قطرة واحدة من الزيت على ينس 60 الهدف العاشر والتركيز على الخلايا العادية مع حقل الضوء الساطع من خلال لمس الجزء السفلي من اللوحة.
  5. لرصد البروتينات transfected مضان ، والتحول من حقل مشرق (الضوء المرسل) لتصفية مضان (RFP تصفية ، إذا كنت تريد أن ترى أو مستقبلات GFP ، إذا كنت تريد أن ترى β - arrestin1).
  6. اختيار الخلية مشرق وصحي ، والذي يعبر hBLT1 - RFP على سطح الخلية باستخدام RFP تصفية والتقاط الصورة.
  7. ثم تحول لتصفية GFP وتأكد من أن β - arrestin GFP - أعرب في السيتوبلازم والتقاط الصورة. ثم لون كل الصور الزائفة ، وقبل وقت التقاط الصور ساقطا الخلية الحية للتأكد من أن ينزف من خلال عدم اتخاذ الاستشعاع التي تحدث بين RFP وGFP.
  8. بمجرد اختيار صومعتك المقدمة ، تعيين المعلمات وفقا للغرض الخاص باستخدام البرمجيات (Metamorph البرمجيات في هذه الحالة).
  9. في التظاهرة الحالية ، ويتم الحصول على الصور بت sixteen مع جاءترا تعيين binning إلى 1 X 1 X 60 جنبا إلى جنب مع خطة نيكون الهدف آبو 60X/1.4 النفط فتحة عدسة رقمية الغمر.
  10. جمع الصور ومضان لRFP fluorochromes GFP في وقت واحد في 30 ثانية الفاصل الزمني (إذا كانت التفاعلات إزفاء / سريعة جدا ، يمكن لأحد أن يقلل من فترات زمنية) من عجلات هذه التصفية باستخدام البرمجيات التي تسيطر عليها Metamorph.
  11. ضبط الكاميرا لمرات التعرض لل1000 مللي ثانية وRFP GFP. (تعيين مرات التعرض محددة وفقا لكثافة من الفلورسنت وGFP RFP).
  12. جمع لأول مرة صور ليجند 1 دقيقة دون إضافة ، والتي هي بمثابة نقطة زمنية 0.
  13. إضافة ميكرولتر 200 من يجند (من الأسهم من 10 ميكرومتر إلى تركيز النهائي من 1 ميكرومتر) بعد 1 دقيقة من دون إزعاج لوحة / أو موقف الخلية.
  14. يتم جمع الصور مضان لمدة 60 دقيقة بعد إضافة يجند وتخزينها كصور TIFF مع النظام المتزايد من أسماء الملفات.
  15. يمكن جعل كل هذه الملفات كملفات المكدس مع الصور الفردية مضان / جنبا إلى جنب مع الطوابع الزمنية باستخدام البرمجيات.

عملية الصور والكمي لمضان من البروتينات والتوطين

  1. الحصول على الصور مع وسائل الاعلام عادي (أي الخلايا) مع المرشحات وRFP GFP الفلورسنت وحفظها كصور خلفية. استخدام هذه الصور لطرح الصور من البيانات الفعلية التي تم الحصول عليها أعلاه.
  2. إعداد كومة من الصور بشكل فردي للصور وRFP GFP.
  3. حدد / تعريف مختلف المناطق (السطحية مقابل عصاري خلوي) لقياس كثافة مضان من عطاءات وGFP (BLT1 وإزفاء β - arrestin)
  4. مؤامرة شدة مبلغ مضان بوصفها وظيفة من الزمن. وهذا الرسم البياني تقديم المعلومات حول حركية إزفاء من جزيء معين.

ممثل النتائج

ألف باء (4) قياس Leukotriene إخراج هجرة الخلايا شجيري

تم استخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول لتحديد الخلايا الجذعية الهجرة نحو باء leukotriene 4 (الشكل 1 والفيديو المرفق 1) 21. يمكننا تطبيق منهجية مماثلة لتحديد قدرة الكيميائي للخلايا ليجند سيما في الخلايا الحية.

الشكل 1
الرقم العظام الماوس 1. نخاع المستمدة شجيري خلية الهجرة نحو 100 نانومتر LTB 4.

الفيديو 1. خلية حية الهجرة نحو BMDCs LTB 4. انقر هنا لمشاهدة الفيديو .

باء قياس النوع من الاختزال (BLT1) والبروتين عصاري خلوي (β - arrestin) التفاعلات ، إزفاء في الخلايا الحية

عند الانتهاء من هذا الإجراء ، يمكن للمرء الحصول على المعلومات التالية في الأحداث يشير النوع من الاختزال.

  1. توطين النوع من الاختزال والبروتينات عصاري خلوي ونواة (الشكل 2).
  2. يجند التفاعل الناجم عن هذه العملية من السطح (BLT1 في هذه الحالة) مع البروتينات عصاري خلوي (β - arrestin في هذه الحالة) (الشكل 3).
  3. حركية واستيعاب مستقبلات β - إزفاء arrestin إلى الغشاء الداخلي تليها جنبا إلى جنب مع مستقبلات (الشكل 4) (جالا وآخرون 2005) 18.
  4. يمكن للمرء تحديد يجند تنشيط مستقبلات تعتمد على الوضع في الخلايا الحية (الفيديو المرفق 2) وتحديد الدوافع الحاسمة أو العمليات المشتركة في تنشيط مستقبلات (جالا وآخرون 2005) 18.

الشكل 2
الشكل 2. التعبير عن BLT1 - RFP (A) ، β - arrestin - GFP (B) ، pNuc CFP - (C) في RBL - 2H3 الخلايا. صورة ملونة تظهر مجتمعة في لوحة D.

الشكل 3
الشكل 3. إزفاء يجند الناجم عن ومستقبلات β arrestin. وترد مسح سطر من شدة الفلورسنت في الخلايا.

الشكل 4
الشكل 4. حركية واستيعاب مستقبلات β - إزفاء arrestin عند إضافة 1 ميكرومتر LTB 4. تم قياس كثافة مضان بوصفها وظيفة من الوقت في الغشاء والمواقع عصاري خلوي للخلية.

2 تصوير فيديو حية من خلايا معربا عن BLT1 - RFP وβ - arrestin GFP عليها إضافة 1 ميكرومتر LTB 4. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التصوير الخلية الحية هي أداة قوية للتدليل على وظيفة وتفاعلات بروتينات معينة كما يحدث في الوقت الحقيقي. الطرق الموضحة في هذه المخطوطة تظهر بوضوح أن LTB 4 يمكن أن تحدث الهجرة السريع للخلايا الجذعية. هذه الأساليب ليس فقط توسيع جوانب مهمة 4 LTB لأنواع الخلايا المتنوعة ، التي تسمح ليتم تطبيقها أساليب مشابهة لمجموعة متنوعة من chemokines الأخرى واختبار فعاليتها وكلاء الكيميائي على السكان فرعية مختلفة الكريات البيض. التصوير مضان في هذا النظام يسمح لرصد الأحداث يشير في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن تكون هذه الأساليب لدراسة موسعة للجمعية ضيق من الجزيئات في الجسم الحي عن طريق اتباع مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) باستخدام flurochromes المناسبة الجزيئات المعلمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI - 52381 ، CA138623 وكنتاكي أبحاث سرطان الرئة المجلس والدعم المؤسسي من جيمس غراهام مركز السرطان براون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. ATCC CRL-2256
Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) Invitrogen 11995
Phenol red free RPMI or DMEM Invitrogen 11835-030
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen 25030
Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) Invitrogen 15140
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300
HEPES (1M) Invitrogen 15630
35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) Bio-Rad 16552088
Gene Pulser II electroporater Bio-Rad
TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 Nikon Instruments
Metamorph Software Universal Imaging
Vertical Micro-pipette puller Narishige International
Micro-Forge M-900 Narishige International
Hadraulic Micromanipulator MO-188NE Narishige International
Coarse Manual Manipulator, MN-188NE Narishige International
cDNA constructs:
cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) Jala et al 2005
cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). Jala et al 2005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
  2. Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  4. Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
  5. Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
  6. Beta-arrest or. Nature. 383, 447-450 (1996).
  7. Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
  8. Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
  9. Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. Leukotriene B4 receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).
  10. Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
  11. Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
  12. Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
  13. Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
  14. Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
  15. Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
  16. Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
  18. Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
  19. Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
  20. Del Prete, A., A, Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
  21. Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
  22. Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).

Tags

علم المناعة ، العدد 46 ، لايف التصوير الخلية ، والانجذاب الكيميائي ، مستقبلات البروتين يقترن G - ، واستيعاب المستقبلة ، leukotriene ، B4 leukotriene مستقبلات B4 1
في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene<sub> 4</sub> الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time… More

Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with β-arrestin. J. Vis. Exp. (46), e2315, doi:10.3791/2315 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter