Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B

Résumé

Un système efficace de structure et de l'analyse fonctionnelle d'un gène dans une Ex vivo Culture des lymphocytes B spléniques est décrite. Cette méthode tire parti de la production recombinante dans un aide-rétroviraux gratuits, ligne de conditionnement de cellules écotrophique. Stable, héréditaires expression d'un gène d'intérêt au sein des lymphocytes primaires est réalisée conduisant à la génération d'anticorps de surface sur les cellules B subissant la commutation isotypique.

Résumé

L'expression des gènes transgéniques dans les cellules eucaryotes est un puissant démarche de génétique inverse dans lequel un gène d'intérêt est exprimé sous le contrôle d'un système d'expression hétérologue pour faciliter l'analyse du phénotype résultant. Cette approche peut être utilisée pour exprimer un gène qui n'est pas normalement trouvé dans l'organisme, d'exprimer une forme mutante d'un produit du gène, ou de sur-expriment une forme dominante-négative du produit du gène. Il est particulièrement utile dans l'étude du système hématopoïétique, où la régulation transcriptionnelle est un mécanisme de contrôle majeur dans le développement et la différenciation des cellules B ^1, a examiné en ^2-4.

Génétique de la souris est un outil puissant pour l'étude des gènes humains et des maladies. Une analyse comparative de la souris et le génome humain révèle conservation de la synténie dans plus de 90% du génome ^5. En outre, la plupart des technologies utilisées dans les modèles de souris est applicable à l'étude des gènes humains, par exemple, les perturbations des gènes et de remplacement allélique ⁶ . Toutefois, la création d'une souris transgénique nécessite beaucoup de ressources de nature à la fois financière et technique. Plusieurs projets ont commencé à compiler les bibliothèques d'assommer souches de souris (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) ou de la mutagenèse induite souches (RIKEN), qui nécessitent de vastes efforts et de collaboration ^7. Par conséquent, il est souhaitable d'étudier d'abord le phénotype d'un gène désiré dans un modèle de culture cellulaire de cellules primaires avant de passer à un modèle de souris.

L'ADN rétroviral s'intègre dans l'ADN de l'hôte, de préférence au sein ou à proximité des unités de transcription ou îlots CpG, résultant en stable et héritable l'expression du gène d'intérêt emballé, tout en évitant le silencing transcriptionnel ^{8 9.} Les gènes sont ensuite transcrits sous le contrôle d'un promoteur à haute efficacité antirétrovirale, résultant en un rendement élevé de la transcription et la production de protéines. Par conséquent, l'expression rétroviral peut être utilisé avec les cellules qui sont difficiles à transfecter, fourni les cellules sont dans un état actif lors de la mitose. Parce que les gènes de structure du virus sont contenus dans la lignée cellulaire d'emballage, les vecteurs d'expression utilisée pour cloner le gène d'intérêt ne contiennent pas de gènes de structure du virus, ce qui élimine la possibilité à la fois de révertants virale et augmente la sécurité de travailler avec des surnageants viraux car aucune virions infectieux sont produits ^10.

Nous présentons ici un protocole pour la production recombinante rétroviraux et l'infection ultérieure des cellules B spléniques. Après isolement, les cellules cultivées rate sont stimulées par Th. lymphokines dérivées et anti-CD40, ce qui induit un éclatement de la prolifération cellulaire et la différenciation B ^11. Ce protocole est idéal pour l'étude des événements survenus en fin de développement des cellules B et la différenciation, les cellules B sont isolées de la rate initiales suivantes évènements hématopoïétiques, mais avant la stimulation antigénique à induire la différenciation plasmocytaire.

Protocole

1. Splénique B-Lymphocyte isolement et de stimulation

1. Récolter les rates de souris déficientes ^AID-12 entre 2-3 mois d'âge. L'isolement de la rate est effectué dans des conditions stériles et les organes sont temporairement conservés dans une solution saline de tampon phosphate froid (PBS) contenant 15% de sérum fœtal bovin (FBS).
2. La rate est ensuite transférée à une hotte stérile et la culture de tissus homogénéisés dans 5 ml de PBS additionné de 2,5% de FBS. Transférer le broyat dans un tube de 15 ml faucon.
3. Centrifuger l'échantillon de tissu homogénéisé la rate à 1000rpm pendant 10 minutes à 4 ° C pour culotter les cellule....

Discussion

Transduction rétrovirale de cellules B spléniques comme décrit ici et comme le montre la figure 1 est une approche génétique qui est utile dans l'étude des lymphocytes B en raison de nombreux événements de développement dans lymphopoesis sont contrôlés par la régulation transcriptionnelle ^{1, 2.} Dans les derniers stades de la maturation des cellules B, déclenchant via CD40L est essentiel pour l'induction de la croissance des cellules B, l'entrée dans le cycle cellulaire et la proli.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SFC	Atlanta Biologicals	S11550
RPMI	Invitrogen	22400
PBS	Invitrogen	20012
tampon de lyse des globules rouges (GR)	Sigma-Aldrich	R7757
billes CD43	Miltenyi Biotec
Milieu complet pour cellules B	Divers	Composants variés	RPMI, 15 % SFC, 1 % d'acides aminés non essentiels, 1 % de pyruvate de sodium, 1 % de HEPES, 1 % de Pen-Strep, 50μM β-mercapto–éthanol
IL-4
Anti-CD40	BD Biosciences	553787
polybrene	Sigma-Aldrich	107689
chlorure de quinacrine (sel de chlorhydrate)	Sigma-Aldrich	C6628	Utilisé à 100 mM
cellules Ph–nix Eco (murines)	Orbigen	RVC-10002
PE-Cy5-α-souris-CD45R (B220)	eBioscience	15-0452-81
PE-α-souris-IgG1	BD Biosciences	A85-1