Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

Résumé

Ce protocole définit un moyen d'étiqueter et de tracer le destin de petits groupes de cellules du poisson zèbre en utilisant UV-uncaging de fluorescéine en cage, suivi par l'ensemble de montage immunomarquage pour amplifier le signal de la fluorescéine Uncaged.

Résumé

Un problème central dans la biologie du développement est de déduire l'origine de la myriade de types de cellules présentes dans les vertébrés à mesure qu'ils surviennent à partir de précurseurs indifférenciés. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodes d'étiquetage lignée, tels que l'étiquetage DiI ¹ et l'injection sous pression d'enzymes traçable ² à déterminer le destin des cellules à des stades ultérieurs de développement dans des systèmes modèles. Les cartes sort d'abord dans le poisson zèbre (Danio rerio) ont été assemblés par injection iontophorétique de colorants fluorescents, tels que la rhodamine dextrane, dans des cellules individuelles dans des régions discrètes de l'embryon et le traçage le sort de la cellule marquée au cours du temps ^3-5. Bien qu'ils soient efficaces, ces méthodes sont techniquement exigeantes et nécessitent un équipement spécialisé ne trouve pas couramment dans les laboratoires de poisson zèbre. Récemment, photoconvertable protéines fluorescentes, comme Eos et Kaede, qui irréversiblement passer du vert au rouge lorsque la fluorescence est exposé aux ultraviolets, voient une utilisation accrue chez le poisson zèbre ^6-8. La clarté optique de l'embryon de poisson zèbre et la facilité relative de la transgénèse ont fait de ces outils particulièrement attrayant pour l'étiquetage lignée et d'observer la migration des cellules in vivo ^7. Malgré leur utilité, ces protéines ont quelques inconvénients par rapport aux colorants médiée par des méthodes d'étiquetage lignée. La plupart des cruciale est la difficulté que nous avons trouvés dans l'obtention de 3-D haute résolution pendant photoconversion de ces protéines. Dans cette perspective, peut-être la meilleure combinaison de résolution et de facilité d'utilisation pour l'étiquetage de la lignée dans le poisson-zèbre se sert de cage fluorescéine dextrane, un colorant fluorescent qui est lié à un groupe de trempe qui masque ses ⁹ fluorescence. La teinture peut alors être "Uncaged" (publié par le groupe de la trempe) dans une cellule spécifique en utilisant la lumière UV d'une lampe laser ou le mercure, permettant la visualisation de sa fluorescence ou immunodétection. Contrairement aux méthodes d'iontophorèse, la fluorescéine cage peut être injecté à des appareils d'injection standard et Uncaged avec un microscope à épifluorescence équipé d'un trou d'épingle ^10. En outre, les anticorps contre la fluorescéine ne détecter que le formulaire en liberté, et l'épitope de fixation ainsi survit ^11. Enfin, la fluorescéine en cage peuvent être activées à très haute résolution en 3-D, en particulier si la microscopie à deux photons est utilisée ^12,13. Ce protocole décrit une méthode d'étiquetage par la lignée de fluorescéine en cage et uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluorescéine est détectée simultanément avec les autres épitopes telles que la GFP en marquant avec des anticorps.

Protocole

1. Synthèse de la cage fluorescéine dextrane

1. Mesurer 3,5 à 4 mg de aminodextrane et ajouter dans le tube Invitrogen fournis teintées contenant 1 mg de CMNB-cage SE fluorescéine. Dans nos mains ce ratio donne une moyenne de chargement de ~ 2,5 molécules de colorant par le dextran.
2. Ajouter 500 ul de 0,1 M Na ₂ B ₄ O ₇ tampons (borate de sodium) dans le tube.
3. Cap et le vortex pendant 30 secondes pour dissoudre le aminodextrane et la fluorescéine en cage.
4. Laissez réagir toute la nuit sur un mélangeur vortex.
5. Dévissez la fermeture de fond sur une colonne spin Zeba et desserrer le bouchon. ....

Discussion

Tel que décrit, ce protocole fournit une méthode relativement rapide lignée étiquetage du poisson zèbre qui est construit sur les techniques couramment utilisées de microinjection, microscopie, et immunofluorescence. Nous avons trouvé que le laser uncaging d'être le moyen le plus efficace et rentable de uncage fluorescéine de manière localisée. Cette méthode pourrait être utilisée pour étiqueter la lignée avec les terminaux expérimentale aussi tard que 4 dpf. Cependant, comme les cellules se divisent, la concentrati.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CMNB-fluorescéine SE piégée	Invitrogen	C20050
Aminodextrane, 10 kDa	Invitrogen	D1860
Colonnes de désalinisation Zeba à rotation	Pierce, Thermo Scientific	89889
anticorps anti-fluorescéine de chèvre	Invitrogen	A11095
anticorps Alexa Fluor 633 de âne anti-chèvre	Invitrogen	A21082
boîtes de Pétri 35 mm x 10 mm	BD Biosciences	351008
microscope composé droit équipé d'un objectif à immersion dans l'eau 40x	Leica Microsystems	DM6000B
Système d'illumination laser manuel MicroPoint	Photonic Instruments
Phénylthiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Protéinase K	Roche Group	03115836991
fil plastique	Tout fournisseur
agarose	Research Products International Corp.	A20090
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Savant SPD131DDA
Agitateur vortex	VWR international	Vortex Genie 2
injecteur sous pression	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3