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1. Considérations clonage
- Oligonucléotides préparés commercialement représentant le TMD d'intérêt flanqué Nhel et des sites de restriction BamHI et 5'-phosphorylés peuvent être ligaturés dans pTox7 (modifié dans notre laboratoire par insertion d'une paire de base directement après le site de restriction BamHI 14) (figure 3) digéré séquentiellement avec BamHI et Nhel. Un oligonucléotide exemple est illustré ci-dessous:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
La séquence TMD devrait être de 12 à 24 résidus (courtes séquences seront probablement allongée par des résidus hydrophobes vecteur codé). Afin d'étudier l'interface, quatre variantes de la conception TMD doivent être créés là où les insertions de résidus séquentiels et concomitants de résidus suppressions entraîner la rotation de la relative au TMD ToxR. 15,16 Enfin, la concentration d'arabinose doit être variée entre 0,001 et 0,01% (p / v) d'identifier les différences de concentration où maximale β-galactosidase signaux entre les différentes séquences de TMD sont observées; tests différents niveaux d'expression est recommandé d'identifier les conditions dans lesquelles des affinités différentes peuvent être distinguées meilleurs. En plus de l'arabinose et des antibiotiques, 0,4 mM d'IPTG peut être utilisé pour améliorer les différences d'affinités entre les différents TMD. La mesure doit être effectuée ToxR au moins en quatre exemplaires. Toute la procédure doit être répétée au moins trois fois avec différentes transformations plasmide.
2. Croissance de cultures bactériennes
- Doucement le dégel FHK12 cellules compétentes (200 pi) sur la glace et le transfert dans un tube de culture de 15 ml. Ajouter l'ADN plasmidique (200 ng) et incuber les cellules sur la glace pendant 30 min.
- Choc thermique des cellules par incubation pendant 90 s à 42 ° C, suivie d'une incubation sur la glace pendant 2 min.
- Ajouter SOC médias (800 pi) et incuber les échantillons à 37 ° C avec agitation (300 rpm) pendant une heure
- Inoculer 5 ml avec du milieu LB chloramphénicol (30 pg / ml) et de l'arabinose (0,0025% p / v) avec 50 ul du mélange de transformation dans des tubes de 15 ml de culture en trois exemplaires. Incuber les échantillons à 37 ° C avec agitation (300 rpm) pendant 20 h. (Alternativement 5 ul de la culture peut être utilisée pour inoculer 100 pi de milieu dans une plaque de 96 puits. Cette méthode est utile lorsqu'il s'agit de grands nombres d'échantillons, bien que les erreurs seront légèrement plus élevés. Afin d'éviter l'évaporation, ce qui entraînerait à l'erreur, remplir les puits ultrapériphériques avec les médias, mais ne pas les utiliser pour des échantillons. Enfin, double-envelopper le joint entre le couvercle et la plaque avec du parafilm).
3. Mesure de la β-galactosidase
- Préchauffer le lecteur de plaques à 28 ° C.
- Transférer le Z-buffer dans un réservoir avec une grande pointe de la pipette, en veillant à ne prendre jusqu'à la partie supérieure (aqueuse) couche. Transférer 100 ul d'Z-buffer/chloroform fraîchement préparés dans les puits d'une plaque de 96 puits. Transférer 5 ul de chaque culture dans les puits de la plaque en quatre exemplaires. Omettre la culture à partir de quatre puits qui servira de vide.
- Mesurer la DO 595 de la plaque afin de déterminer la densité cellulaire.
- Ajouter 50 ul d'Z-buffer/SDS à tous les puits de la plaque. Agiter la plaque dans le lecteur de plaques pendant 10 minutes pour lyser les cellules. Assurez-vous que les suspensions cellulaires sont claires après lyse et répétez l'étape secouer si nécessaire. Lyse incomplète suggère la Z-buffer/chloroform n'a pas été fraîchement préparés.
- Ajouter 50 ul fraîchement préparés Z-buffer/ONPG à tous les puits et retourner la plaque pour le lecteur de plaque et de mesurer OD 405 toutes les 30 s pendant 20 min.
- Calculer β-galactosidase en utilisant l'équation suivante (n'oubliez pas de soustraire le vide). Le ratio de 405 OD / min devrait être calculé en utilisant tous les points de données dans la DO 405 entre 0.0 et 1.0 en utilisant un ajustement du modèle linéaire.
Miller unités diffèrent parfois quand enregistrées sur plusieurs jours. Par conséquent, une construction de référence comme AMP devrait être mesuré dans chaque essai. Ses valeurs peuvent être utilisées pour la normalisation des valeurs ToxR.
4. Contrôle pour l'expression protéique
- Effectuer Western blot pour vérifier l'expression des protéines, même entre les constructions. Mélanger 50 pl de la cultures en triple et centrifuger (2000 rpm, 4 min) dans une microcentrifugeuse. Eliminer le surnageant par pipetage et resuspendre le culot dans 2 résiduelle de tampon de chargement x échantillon.
- Charge 7,5 ul sur un gel de la norme de 8% et de réaliser les électrophorèses à 125 V pendant 1 heure 5 min. Après le transfert, incuber avec des anti-MBP HRP-anticorps conjugué et de visualiser, la protéine chimère est observée à environ 70 kDa avec certains produits de dégradation parfois vu environ 48 kDa. MBP endogène est également observée à 45 kDa (voir Figure 5).
5. Contrôle d'insertion membranaire correcte
Une lignée cellulaire déficiente en protéine de liaison du maltose est utilisé pour évaluer insertion membranaire correcte de la construction chimérique TMD. Lorsqu'il est cultivé sur un milieu minimal avec des maltose comme seule source de carbone, que les cellules exprimant une membrane intégrale produit d'expression avec le maltose binding protein correctement localisé dans le périplasme sont capables de croître.
- Transformez PD28 cellules (comme décrit pour FHK12 cellules) et inoculer 2 ml de milieu LB. Cultiver les cellules à 37 ° C avec agitation (300 rpm) pendant la nuit.
- Pellet les cellules par centrifugation à 3500 rpm, 10 min, 4 ° C et laver à la remise en suspension dans du PBS (2 ml) par pipetage doux avec un gros pourboire ou vortex doux. Pellet les cellules (comme ci-dessus), laver avec du PBS pour une deuxième fois, granulés et finalement remettre en suspension dans du PBS (1 ml).
- Utilisez 25 ul de cellules en suspension pour inoculer 5 ml de milieu minimum en trois exemplaires et incuber à 37 ° C avec agitation (300 rpm). Prenez OD 595 lectures entre 15-25 h, environ toutes les 2 heures en transférant 200 ul de chaque échantillon dans une plaque de 96 puits et de la lecture en utilisant le lecteur de plaques.
6. Les résultats représentatifs:
Un exemple de l'utilisation du dosage de journaliste transcriptionnelle ToxR d'analyser la propension oligomérisation des domaines transmembranaires dans la figure 4. Auparavant, nous avons étudié l'oligomérisation des domaines transmembranaires de la membrane multispanning intégrante de membrane latente protéines protein-1 (LMP-1) par diverses techniques, y compris ToxR 14 domaine transmembranaire cinq (TM5) a été montré à exposer une forte propension à oligomériser.; Cela est démontré par les unités de Miller élevés, comparables à du contrôle positif, GPA, une séquence bien établie dimérisation. Une mutation délétère dans TM5, D150A, réduit la capacité de la séquence à oligomériser. LMP-1 TM1 ne modifie pas significativement oligomériser et présente un signal d'unité très faible Miller, juste au-dessus du signal pour le blanc, non-transformé FHK12 cellules.
Cartoon Figure 1. Illustrant le dosage journaliste ToxR. Domaine transmembranaire (TMD) entraîné des résultats d'oligomérisation dans la dimérisation de ToxR et l'activation de la transcription de LacZ. Le produit du gène de LacZ, β-galactosidase peut être quantifiée comme une mesure de la propension d'un TMD pour oligomériser.
Figure 2. Le clivage hydrolytique d'ONPG par la β-galactosidase résultats dans la production de l'espèce absorbant la lumière o-nitrophénolate (ONP).
Figure 3. Carte du plasmide pToxR7.
Figure 4. Représentant ToxR test journaliste de la transcription d'analyser la propension oligomérisation de la membrane protein-1 latente domaines transmembranaires. 5 domaine transmembranaire (TM5) oligomérise fortement, alors que 1 domaine transmembranaire (TM1) ne présente qu'une faible interaction. D150A mutation dans TM5 réduit considérablement sa capacité à oligomériser. GPA est inclus comme une séquence de contrôle positif pour la dimérisation forte. Blank représente non transformées FHK12 cellules.
Figure 5. Western blot pour l'expression des protéines.
Figure 6. PD28 test complémentation pour contrôler insertion membranaire correcte pour le périplasme. Contrôle négatif représente une construction déficiente en protéine de liaison du maltose.