Article de méthode

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l'aide In Utero L'électroporation

DOI :

10.3791/2957

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23 juin 2011

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hotchkiss Brain Institute, Alberta Children’s Hospital Research Institute, University of Calgary , 2Department of Medical Genetics, Alberta Children’s Hospital Research Institute, Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary

Dans cet article

Résumé

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Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Résumé

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La capacité de manipuler l'expression des gènes est la pierre angulaire de la journée embryologie moderne expérimentale, ce qui conduit à l'élucidation des multiples voies de développement. Plusieurs puissants et bien établis technologies transgéniques sont disponibles pour manipuler les niveaux de l'expression des gènes chez la souris, permettant la génération des deux perte et le gain de fonction des modèles. Cependant, la génération de souris transgéniques est à la fois coûteux et fastidieux. D'autres méthodes de manipulation génétique ont donc été largement sollicités. In utero électroporation est une méthode de transfert de gènes dans les embryons de souris 1,2 que nous avons réussi à adapter 3,4 vivre. Il est largement basé sur le succès de l'électroporation in ovo dans les technologies qui sont couramment utilisés dans chiches 5. Brièvement, l'ADN est injecté dans les ventricules du cerveau ouverte développement et l'application d'un courant électrique provoque la formation de pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l'absorption de l'ADN dans la cellule. Dans nos mains, les embryons peuvent être efficacement électroporées dès le jour embryonnaire (E) 11,5, tandis que le ciblage des jeunes embryons exigerait une guidée par échographie protocole de micro-injection, comme décrit précédemment 6. Inversement, E15.5 est la dernière étape, nous pouvons facilement électroporation, en raison de l'apparition de la pariétale et la différenciation des os frontal, ce qui entrave la microinjection dans le cerveau. En revanche, la rétine est accessible par la fin de l'embryogenèse. Les embryons peuvent être recueillies à aucun moment pendant toute la période embryonnaire ou postnatale précoce. L'injection d'un journaliste de la construction facilite l'identification des cellules transfectées.

À ce jour, électroporation in utero a été plus largement utilisé pour l'analyse du développement du néocortex 1,2,3,4. Des études plus récentes ont ciblé la rétine et le thalamus embryonnaire 7,8,9 10,11,12. Ici, nous présentons une modification dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être facilement adaptée pour cibler les différents domaines du système nerveux central embryonnaire. Nous fournir la preuve que en utilisant cette technique, nous pouvons cibler le télencéphale embryonnaire, diencéphale et la rétine. Les résultats représentatifs sont présentés, montrant d'abord l'utilisation de cette technique pour introduire des constructions d'expression d'ADN dans les ventricules latéraux, nous permettant de suivre la maturation progénitrices, la différenciation et la migration dans le télencéphale embryonnaire. Nous montrons également que cette technique peut être utilisée pour cibler l'ADN dans les territoires environnants diencéphalique le ventricule 3 ème, permettant les routes migratoires de différencier les neurones en noyaux diencéphalique à surveiller. Enfin, nous montrons que l'utilisation de micromanipulateurs nous permet d'introduire précisément constructions d'ADN dans les zones cibles légères, y compris l'espace sous-rétinien, nous permettant d'analyser les effets de la manipulation de l'expression des gènes sur le développement de la rétine.

Protocole

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1. Mise en place

  1. Set-up zone chirurgicale, comme indiqué dans la Fig. 1A, A '. Les éléments clés de la mise en place comprennent une Eppendorf FemtoJet microinjecteur, micromanipulateur Narishige avec porte-aiguille, steromicroscope Leica, système d'éclairage à fibres optiques, ECM 830 Système Place électroporation vague avec des électrodes, un coussin chauffant et d'un vaporisateur pour l'isoflurane anesthésique.
  2. Nettoyer tous les outils avec un nettoyeur à ultrasons à l'aide Bransonic Metriclean2 solution à faible moussant pour sonication outils chirurgicaux. Stériliser par autoclavage des outils. Outils stérilisés sont ensuite conservés dans G....

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Discussion

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In utero électroporation peut être utilisée pour analyser une grande variété de processus de développement. Par exemple, la transfection de gènes rapporteurs tels que la GFP, mCherry ou la phosphatase alcaline peut être utilisé pour effectuer le traçage et la lignée des expériences de la migration neuronale. Alternativement, la recombinase Cre peut être transitoirement exprimé d'éliminer sélectivement un allèle floxés dans un espace et / ou temporellement contrôlée manière. Par ailleurs, shRNA ou dominant n.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Eva Hadzimova, Pierre Mattar et Christopher Kovach pour leur travail initial dans l'établissement en matière de technologie d'électroporation in utero dans le laboratoire de CS. Ce travail a été financé par un Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) subvention (44 094 MOP) et Fighting Blindness IRSC / Fondation (FFB) Subvention d'équipe émergente (00933-000) pour CS et une enfance de l'Alberta Hospital Research Foundation Grant à DMK. RD a été soutenue par une bourse des IRSC Hope Canada, RC est soutenu par une bourse d'études FFB et LML a été soutenu par une subvention de formation des IRSC en gén....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom de réactif Société Numéro de catalogue Catégorie
Ciseaux fins Beaux-Sciences Tools Inc 14078-10 Outils chirurgicale
Ciseaux Iris, incurvé Beaux-Sciences Tools Inc 14061-10 Outils chirurgicale
Olsen Hegar-Porte-aiguille Ex-Délicate Beaux-Sciences Tools Inc 12002-12 Outils chirurgicale
Anneau forceps, 9mm Beaux-Sciences Tools Inc 11103-09 Outils chirurgicale
Eye vinaigrette Pince Beaux-Sciences Tools Inc 11051-10 Outils chirurgicale
Dumont # 7 DMX Pince Beaux-Sciences Tools Inc 11271-30 Outils chirurgicale
Dumont # 5 DMX Pince Beaux-Sciences Tools Inc 11251-30 Outils chirurgicale
Tissue-pince Adson Beaux-Sciences Tools Inc 11027-12 Outils chirurgicale
Applicateur clip Reflex Instrument de précision du monde 500343 Outils chirurgicale
Cuillère perforée, 15 mm de diamètre Beaux-Sciences Tools Inc 10370-18 Outils chirurgicale
Décapant Autoclip Mikron 427637 Outils chirurgicale
Black Silk tressé Suture Ethicon Inc K871 Outils chirurgicale
Reflex Peau Fermeture clips inox plaies acier Instruments de précision du monde 500346 Outils chirurgicale
ECM 830 Système Place électroporation vague VWR-Canlab 58018-004 Instruments
Brucelles w / Variable Gap Round 2 électrodes 5mm plaque de platine Protech International Inc CUY650P5 Instruments
Brucelles w / Variable Gap Round 2 électrodes 7mm plaque de platine Protech International Inc CUY650P7 Instruments
Eppendorf FemtoJet microinjecteur VWR Canlab CA62111-488 Instruments
Pédale de commande pour les Eppendorf FemtoJet microinjecteur VWR Canlab CAACCESS (divers) Instruments
Bransonic Modèle nettoyeur à ultrasons 1510R-SRD VWR Canlab CA33995-534 du CPN-952-118 Instruments
Sutter P97 micropipette Puller Sutter Instrument, Carsen Group Inc P-97 Instruments
Micropipettes - borosilicaté avec filament OD: 1mm, ID: 0,78 mm, longueur 10 cm Instrument Sutter BF100-78-10 Instruments
3-Axis Manipulateur grossier Carl Zeiss Canada Inc M-152 Instruments
Dispositif de maintien magnétique pour micromanipulateur Instruments de précision du monde M1 Instruments
Plaque de base en acier pour micromanipulateur Instruments de précision du monde 5052 Instruments
Titulaire Micropipette World PrInstruments écision MPH3 Instruments
Micropipette Poignée Instruments de précision du monde 5444 Instruments
Stéréomicroscope Leica MZ6 Instruments
Vaporisateur pour l'isoflurane anesthésie Porter Instruments Company MODÈLE 100-F Instruments
Metriclean2 solution à faible moussant pour sonication outils chirurgicaux Metrex Research Corporation 10-8100 Réactifs chirurgicale
Gentamicine 40mg/ml dans 0,2 g de méthylène jet d'antibiotiques bleue après la suture Sigma-Aldrich G1264 Réactifs chirurgicale
Germex pour stériliser des instruments chirurgicaux Vétoquinol DIN 00141569 # Réactifs chirurgicale
Pommade ophtalmique BNP Vétoquinol DIN 00516414 # Réactifs chirurgicale
Nair ® Distribué par Church & Dwight Co., Inc disponibles dans le commerce Réactifs chirurgicale
Stanhexidine nettoyant la peau 4% p / v Laboratoires Omega Inc 01938983 Réactifs chirurgicale
La buprénorphine (Temgésic) antalgique Schering-Plough 531-535 Réactifs chirurgicale
Sulfamides "25" sulfaméthazine antibiotique oral Professional Veterinary Laboratories DIN 00308218 # Réactifs chirurgicale
Solution de Ringer lactate Corporation Baxter # 0061085 DIN Réactifs chirurgicale
Saline - chlorure de sodium à 0,9% B-Braun Medical Inc DIN 01924303 # Réactifs chirurgicale
Anesthésique par inhalation - L'isoflurane USP Partenaires Pharmaceutiques du Canada Inc DIN 02237518 # Réactifs chirurgicale
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Réactifs chirurgicale

Références

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  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  2. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in ....

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Mots-clés

SNC embryonnaireinjection d ADNimpulsions lectriquesprog niteurs neurauxmicroscopie par immunofluorescenceciblage du t lenc phaleciblage du dienc phaleespace sous r tinien

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