Une méthode est décrite pour la préparation d'une matrice tridimensionnelle composée de collagène de type I et de fibroblastes humains primaires. Ce gel organotypique constitue un substrat utile pour évaluer la migration cellulaire invasive, car il imite les caractéristiques fondamentales du stroma tissulaire et se prête à de nombreuses formes de microscopie.
Article de méthode
Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional
Dans cet article
Résumé
Résumé
La migration cellulaire est fondamentale pour de nombreux aspects de la biologie, notamment le développement, la cicatrisation des plaies, les réponses cellulaires du système immunitaire et la métastase des cellules tumorales. La migration a été étudiée sur des lamelles en verre afin de rendre les dynamiques cellulaires accessibles à l'analyse par microscopie optique. Toutefois, il est désormais établi que de nombreux aspects de la migration cellulaire dépendent de caractéristiques de l'environnement local, telles que son élasticité, sa composition en protéines et sa taille de pore, qui ne sont pas fidèlement reproduits par des substrats rigides bidimensionnels comme le verre ou le plastique 1. En outre, les interactions avec d'autres types cellulaires, notamment les fibroblastes du stroma 2 et les cellules immunitaires 3, se sont révélées jouer un rôle crucial dans la promotion de l'invasion des cellules cancéreuses. L'analyse au niveau moléculaire a de plus en plus montré que les dynamiques moléculaires, y compris la réponse au traitement médicamenteux, de cellules identiques diffèrent significativement lorsqu'elles sont comparées in vitro et in vivo 4.
Idéalement, il serait préférable d'étudier la migration cellulaire dans son contexte naturel au sein d'organismes vivants, mais cela n'est pas toujours possible. Des systèmes intermédiaires de culture tissulaire, tels que la matrice dérivée de cellules, le matrigel, la culture organotypique (décrite ici), les explants tissulaires, les organoïdes et les xénogreffes, constituent donc des intermédiaires expérimentaux importants. Ces systèmes reproduisent certains aspects d'un environnement in vivo, mais se prêtent mieux aux manipulations expérimentales, comme l'utilisation de lignées cellulaires stablement transfectées, les régimes de traitement par médicaments, ou l'imagerie à long terme et haute résolution. De tels systèmes intermédiaires sont particulièrement utiles comme modèles préliminaires pour valider des sondes et établir les paramètres nécessaires à l'imagerie de la réponse dynamique des cellules et des marqueurs fluorescents, avant d'entreprendre des expériences d'imagerie in vivo 5. En ce sens, ils peuvent jouer un rôle important dans la réduction du recours à des expériences sur des animaux vivants.
Protocole
1. Établissement de cultures de fibroblastes à partir d'explants de peau
- Des biopsies prélevées par poinçonnage de 4 mm sur l'avant-bras humain sont placées dans du MEM supplémenté avec 100 unités / ml de pénicilline, 100 μg / ml de streptomycine et 0,25 μg / ml de Fungizone.
- Retirer tout tissu adipeux sous-cutané et hacher finement la biopsie en petits morceaux en faisant osciller une lame de scalpel n°24 contre le fond de la boîte de Pétri.
- Placer la purée tissulaire dans un flacon de culture de 25 cm2 contenant le milieu de croissance pour fibroblastes primaires (MEM supplémenté avec 10 % de FCS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 μg / ml de streptomycine et 25 μg / ml de Fungizone), en ajoutant du milieu jusqu'à recouvrir la surface du flacon sans que la profondeur de liquide ne permette au tissu de flotter.
- Après 3 jours d'incubation à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, ajouter 3 ml de milieu de croissance pour fibroblastes primaires.
- Après 3 jours supplémentaires d'incubation, remplacer le milieu par du milieu frais pour fibroblastes primaires, ou, si les cellules sont presque confluentes, les repiquer au 1:4 dans du milieu frais. (La Fungizone peut être omise à partir de ce stade).
2. Stade I - Préparation de collagène I à partir de queues de rat
Remarque : Protocole pour environ 12 à 14 queues de rats adolescents (fraîches ou congelées)
- Préparer la queue de rat en la lavant avec de l'éthanol à 70 % et en retirant les tendons comme suit :
- Enlever la peau de la queue de rat en faisant une incision au milieu de la queue du haut vers le bas à l’aide d’un scalpel, puis en pelant le long de la queue.
- Détacher le tendon du noyau de la région proximale de la queue.
- Retirer le tendon vers la région distale de la queue en évitant la gaine, à l’aide de pinces dentées.
- Extraire 1 g de tendon par 250 ml d’acide acétique 0,5 M en agitant à 4 °C pendant 48 h.
- Centrifuger l’extrait (7 500 × g) pendant 30 min et jeter le culot.
- Ajouter un volume égal de NaCl à 10 % (p/v) au surnageant, et agiter pendant 30 à 60 min.
- Centrifuger (10 000 × g) pendant 30 min, jeter le surnageant, puis redissoudre le précipité dans de l’acide acétique 0,25 M selon un rapport d’environ 1:1, en agitant pendant 24 h à 4 °C.
- Dialyser la solution de collagène contre 6 à 8 changements de 6 L d’acide acétique environ 17,5 mM (1 ml d’acide acétique glacial par litre d’eau froide, changer 2 fois par jour).
- Centrifuger le collagène dialysé à 30 000 × g pendant 1,5 h.
- Retirer le surnageant et le placer dans un flacon stérile.
- Ajuster la concentration en collagène I à environ 2 mg/ml à l’aide d’acide acétique 0,5 mM à 4 °C.
3. Stade II - Mise en place de la matrice 3D avec des fibroblastes inclus (laisser rétracter pendant 8 jours).
- Assemblez le mélange en utilisant des réactifs froids à 4°C dans un flacon prérefroidi. Garder le collagène I sur glace.
- Pour un flacon T75 flacon de fibroblastes primaires confluentes (˜ nombre de cellules 1 x 106) utilisation :
- 25 ml de collagène de queue de rat (concentration d'environ 2 mg/ml)
- 3 ml de MEM 10x
- 0,22 M NaOH : ajouter d'abord 2 ml, puis ajouter goutte à goutte sous agitation jusqu'à ce que le collagène devienne orange,
- mais pas rose (généralement jusqu'à 3 ml). p environH = 7.2.
- Remarque : Il est important de veiller à ce que le milieu/gel reste neutre ou légèrement acide, car les fibroblastes ne contractent pas le gel lorsqu'ils sont exposés à des conditions même légèrement alcalines.
- Traitez les fibroblastes à la trypsine, centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes et retirez le surnageant.
- Pendant la centrifugation de 5 min ci-dessus : préparer 12 boîtes plastiques de 35 mm - on obtient normalement 12 boîtes à partir d'un flacon de mélange fibroblastes/collagène.
- Resuspendre les fibroblastes dans 3 ml de SFC et ajouter immédiatement au mélange de collagène en remuant.
- Plaquez environ 2,5 ml de collagène/fibroblastes par boîte aussi rapidement que possible. Essayez d'éviter les bulles et la prise du collagène.
- Laisser le collagène prendre à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à l'air ambiant pendant 10 min.
- Ajouter 1 ml de milieu de croissance pour fibroblastes (DMEM + 10 % de SFC).
- Détacher la matrice de collagène/fibroblastes des parois de la boîte à l’aide d’une pipette.
- Le lendemain : ajouter 1 ml de milieu de croissance pour fibroblastes (DMEM + 10 % de FCS).
- Changer le milieu tous les deux jours. Laisser le matériau de collage/fibroblastes se contracter pendant environ 8 jours, jusqu'à ce qu'il s'adapte dans une plaque de 24 puits (contraction d'un diamètre d'environ 3,5 cm à 1,5 cm, voir Figure 1).
Remarque : la concentration en collagène doit être ajustée en fonction de l'application. Plus la solution de collagène est diluée, plus elle sera contractée rapidement par les fibroblastes. De légères différences de vitesse de contraction seront observées avec différentes lots de collagène à concentration identique. De même, différents cultures de fibroblastes contracteront les gels de collagène à des vitesses différentes, et plus la quantité de fibroblastes est élevée, plus la vitesse de contraction sera rapide. La concentration en collagène et la densité des fibroblastes peuvent donc être ajustées afin de modifier la vitesse de contraction ainsi que la densité finale du gel de collagène.
4. Stade II - Ensemencement des cellules d'intérêt au-dessus de la matrice
Remarque : stériliser toutes les pinces et l'équipement avec de l'éthanol avant utilisation.
- À l’aide de pinces contondantes, déplacer délicatement la matrice contractée dans une plaque de 24 puits. Veiller à ce qu’elle ne se replie pas.
- Préparer une suspension de cellules d’intérêt à environ 4 x 104 /ml et ensemencer 1 ml (après trypsination, centrifuger les cellules pour éliminer la trypsine) au-dessus de la matrice. Le nombre exact de cellules nécessaire variera selon le type cellulaire utilisé. Le milieu cellulaire doit être le milieu de croissance normal pour les cellules d’intérêt.
- Laisser les cellules croître jusqu’à confluence au-dessus de la matrice, environ 3 à 5 jours.
5. Stade III - Transfert de la matrice vers une grille pour l'invasion (environ 0-21 jours)
- Découper des grilles en acier inoxydable pour former un trépied et stériliser par autoclavage avant utilisation (voir Figure 2).
- Placer la grille stérile dans une boîte de 6 cm, ajouter le milieu de croissance jusqu'à un niveau supérieur à celui de la grille (environ 10,5 ml). Placer la matrice sur la grille et aspirer délicatement le milieu afin que le fond de la matrice soit en contact avec le milieu sans être submergé. Ce dispositif est appelé interface air/liquide, qui crée un gradient favorisant l'invasion. Changer le milieu tous les deux jours (voir Figure 2).
- Des images en contexte de cellules vivantes, utilisant des cellules fluorescentes, peuvent être obtenues à ce stade ou précédemment. Le collagène I contracté ou fibrillaire peut être visualisé par génération de seconde harmonique (SHG, voir Figure 3). En utilisant une excitation multiphoton combinée à une détection en champ large, nous observons que la SHG permet d'imaginer jusqu'à au moins 100 μm de profondeur dans la matrice, tandis que les cellules exprimant une GFP cytoplasmique peuvent être imagées à une profondeur d'au moins 200 μm.
Remarque : en ce qui concerne la quantification de l'invasion, le jour où les matrices sont placées sur les grilles correspond au jour 0. Le placement sur les grilles crée un gradient de milieu de culture cellulaire qui favorise l'invasion dans la matrice. Les échantillons peuvent être observés au cours des 1 à 21 jours suivants (ou plus) afin d'évaluer des processus biologiques tels que l'invasion, la prolifération, la survie ou la différenciation (voir la liste des références).
6. Stade IV - Fixation
- Ajouter 5 ml de PFA à 4 % dans un tube Falcon.
- Transférer la matrice sur une surface plane. Couper la matrice en deux avec un scalpel propre et neuf (car vous allez colorer la section transversale), soulever la matrice avec le scalpel et la transférer dans du PFA à 4 %, puis fixer toute la nuit.
- Les matrices organotypiques sont désormais prêtes à être colorées avec l'anticorps ou le colorant de choix (voir Figure 3).
7. Résultats représentatifs :
Figure 1 Exemple de collagène de type I contracté par les fibroblastes. Mélange de fibroblastes et de collagène de queue de rat détaché de la boîte de Pétri et laissé à se contracter pendant 6 à 8 jours.
Figure 2 Progression du test organotypique. A, schéma de la configuration et de la progression du test organotypique. B, Exemple de matrice de collagène/fibroblastes déposée sur une grille stérile en acier inoxydable afin de créer une interface air/liquide.
Figure 3 Applications du test organotypique. A, B cellules non invasives et invasives de carcinome adénocarcinome ductal du pancréas (PDAC) envahissant progressivement la matrice organotypique. C, equivalent cutané vivant montrant un épiderme stratifié sur un composant dermique contracté par des fibroblastes et riche en collagène. D, cellules de mélanome C8161 envahissant un équivalent dermique contracté par des fibroblastes et riche en collagène. E, cellules invasives de PDAC (vert) interagissant et s'insinuant parmi des fibroblastes (rouge) au sein de la matrice organotypique. F, cellules invasives de PDAC (vert) interagissant avec une matrice extracellulaire environnante en cours de dégradation (violet), visualisée à l'aide de la génération de second harmonique basée sur la microscopie multiphoton.
Discussion
Nous présentons ici une méthode de production d'une matrice tridimensionnelle adaptée à l'étude de la migration cellulaire invasive 6-8. La matrice est constituée de fibrilles de collagène de type 1, qui sont contractées sur une période de plusieurs jours par des fibroblastes épidermiques humains primaires. Le collagène est préparé par extraction acide, et non par digestion enzymatique, ce qui préserve la réactivité des extrémités des peptides et favorise le réticulation des fibrilles de collagène en agrégats plus gros lors de la neutralisation des conditions tampon 9. Cela donne un gel reconstitué qui imite plus fidèlement les caractéristiques du collagène in vivo et a des conséquences importantes sur les propriétés invasives des cellules cultivées dans ces gels. Peu importe que la matière première soit fraîche ou congelée, mais l'utilisation de queues de rats adolescents est essentielle, car le réticulation du collagène est plus labile chez les animaux jeunes. Le collagène I provenant d'animaux jeunes est donc plus facile à extraire et se reconstitue avec une fidélité accrue.
La matrice de collagène peut être fixée et colorée avec des anticorps dirigés contre les cellules tumorales invasives ou les fibroblastes du stroma 2,10 et est très utile pour tester l'efficacité de médicaments susceptibles d'inhiber l'invasion 5,6.
Bien que ce protocole suggère l'utilisation de fibroblastes cutanés humains primaires, il est possible d'utiliser des fibroblastes primaires provenant d'autres types de tissus, selon le type de tissu étudié. Il est également envisageable d'établir des cultures en utilisant des fibroblastes immortalisés, y compris des cellules qui ont été transfectées de manière stable avec des conjugués de protéines fluorescentes. Ainsi, les cellules stromales et tumorales peuvent être marquées afin de visualiser les interactions entre cellules durant l'invasion 11.
Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à déclarer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| MEM 10x | GIBCO, par Life Technologies | 21430 | - |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 367176-500G | Préparer un stock à 0,22 M dans l'eau |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | - |
| Plaques de 35 mm | Falcon BD | 353001 | Pour l'étape 3.4 |
| Plaques de 60 mm | Falcon BD | 353004 | Pour l'étape 5.2 |
| Pinces à ressort, émoussées | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | E003/02 | Dentelées, non lisses |
| Parafomaldehyde à 16 % | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluer à 4 % dans du PBS avant utilisation |
| Grilles pour cd-1, taille 40 mesh | Sigma-Aldrich | S07707-5EA | Grilles en acier inoxydable, 5 par paquet |
| Tubulure de dialyse | Medicell International | 7607 2295 | 12 - 14 kD |
| PBS | Oxford Labware | BR0014G | - |
| Acide acétique | Sigma-Aldrich | 242853 | - |
| Plaque 24 puits | Falcon BD | 353047 | Pour l'étape 4.1 |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | - |
Références
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion. Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).
- Patsialou, A. Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor. Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).
- Serrels, A. Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development. Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
- Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. 4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors. Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).
- Fusenig, N. E. Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).
- Nystrom, M. L. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205, 468-475 (2005).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).
- Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation. Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).
Réimpressions et autorisations
