Summary
हम संक्रमित कोशिकाओं से उच्च शुद्धता herpesvirus nucleocapsid डीएनए अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन. अंतिम समाधान से कब्जा कर लिया डीएनए उच्च एकाग्रता और पवित्रता है, यह आदर्श उच्च throughput अनुक्रमण, उच्च विश्वस्तता पीसीआर प्रतिक्रियाओं, और transfections के लिए नए वायरल recombinants उत्पादन के लिए उपयुक्त बना.
Protocol
1. प्रथम दिवस: वायरल संक्रमण और Buffers की तैयारी
- ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के संक्रमण के लिए 5-10 (15 सेमी व्यास) व्यंजन तैयार करने के लिए, pseudorabies (PRV) वायरस या दाद के लिए वेरो कोशिकाओं के लिए जैसे पीके 15 कोशिकाओं सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी).
- जब कोशिकाओं को 95 - 100% मिला हुआ है, उन्हें संक्रमित के एक (MOI) 50-10. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक थाली थाली 4 प्रति मिलीलीटर की कुल मात्रा में वायरस स्टॉक का उपयोग टीका लगाना, तो 1 घंटे के लिए 37 पर प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस रॉक प्लेटें धीरे हर 15 मिनट में यह सुनिश्चित करने के लिए है कि सेल monolayer पूरी तरह से वायरस inoculum के द्वारा लेपित रहता है. इस बीच, अगले कदम के लिए मध्यम गर्म.
- संक्रमण के एक घंटे के बाद, प्लेटें से वायरल inoculum aspirate, गर्म माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 पर सेते ° humidified इनक्यूबेटर में 12-20 घंटे के लिए सी.
- LCM (देखें तालिका 1) buffers और डिग्री सेल्सियस के लिए पूरी तरह से मिश्रण 4 बजे रात में रॉक तैयार. वायरल डीएनए के resuspension के लिए tne तैयार (तालिका 2 देखें).
2. दूसरा दिन, चरण 1: सेल lysis और ultracentrifugation
- नेत्रहीन पुष्टि है कि कोशिकाओं के संक्रमण वर्दी cytopathic प्रभाव (CPE) का कारण है. संक्रमण जब तक सभी कोशिकाओं गोल है, लेकिन थाली से उठाया नहीं है प्रगति के लिए अनुमति दें.
- परिमार्जन मध्यम में संक्रमित कोशिकाओं, और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में कोशिकाओं और मध्यम गठबंधन. शंक्वाकार इस कदम के लिए आवश्यक ट्यूबों की संख्या से ऊपर 1.2 चरण में संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया व्यंजनों की संख्या पर निर्भर करेगा, जैसे एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब गोली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: 15 मिलीलीटर प्रत्येक वैकल्पिक माध्यम के 3 व्यंजन की एक अधिकतम. कुल्ला 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्लेटें और कोशिकाओं और मध्यम के साथ गठबंधन.
- अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और 2000 कमरे के तापमान पर रिश्तेदार centifugal बल (आरसीएफ) में 10 मिनट के लिए मध्यम, तो aspirate सतह पर तैरनेवाला और पीबीएस के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend. यदि एक वायरल संक्रमण से गोली 2.2 चरण में कई शंक्वाकार ट्यूबों में फैल गया था, इन इस कदम पर एक शंक्वाकार ट्यूब में recombined जा सकता है. Centrifugation और आकांक्षा दोहराएँ वैकल्पिक: इस गोली -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है और प्रोटोकॉल एक बाद में समय पर जारी रखा .
3. दूसरा दिन, चरण 2: ultracentrifugation
निम्नलिखित चरणों के दौरान सेल गोली और LCM बफ़र्स बर्फ पर जब भी संभव रखें.
- 0% ग्लिसरॉल β-mercaptoethanol जोड़ें - LCM बफर. Ultracentrifuge (3.9 कदम के लिए नीचे) ठंडा करने के लिए सेटिंग के द्वारा शुरू 4 डिग्री सेल्सियस और वैक्यूम मोड़ पर है.
- 0% ग्लिसरॉल के 5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend LCM बफर जब तक यह नहीं रह गया है clumpy. यदि आवश्यक हो, ट्यूब ऊपर तोड़ने के लिए किसी भी undissolved सेल गोली भंवर.
- 1.5 मिलीलीटर Freon (1,1,2-trichloro एक ,2,2 trifluoroethane) जोड़ने और सख्ती vortexing द्वारा निकालें. तुरंत आरसीएफ में 2000 डिग्री सेल्सियस 4 के एक के तापमान पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र एक विस्तृत बोर विंदुक टिप (इंटरफ़ेस परहेज) के साथ ऊपर परत ले लीजिए और एक नया ट्यूब वैकल्पिक हस्तांतरण: यदि गोली एक पतला ठोस है, तुम जल्दी से एक नया ट्यूब में ऊपर परत डाल सकते हैं.
- Freon निष्कर्षण दोहराएँ और फिर अपकेंद्रित्र.
- शीर्ष परत (~ 5 मिलीलीटर) लीजिए और एक नया polyallomer ultracentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण. LCM बफ़र्स - शेष दो ग्लिसरॉल β mercaptoethanol जोड़ें.
- LCM (मध्यम परत), और फिर 45% ग्लिसरॉल के 2.5 मिलीलीटर के साथ फिर से underlaying - - LCM (नीचे परत) polyallomer अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5% ग्लिसरॉल के 3 मिलीलीटर के साथ Freon निकालने (ऊपर परत) underlaying द्वारा एक ढाल तैयार. एक पतली विंदुक प्रयोग ट्यूब सामग्री की बाढ़ से बचने के.
- यदि आवश्यक हो, तो एक बराबर संतुलन LCM buffers की एक ही अनुपात का उपयोग ट्यूब तैयार करते हैं.
- Ultracentrifuge एक बाल्टी में ट्यूबों का स्थानांतरण. शीर्ष परत (~ एक बार में 50-100 μl) LCM बफर - बाल्टी धीरे अतिरिक्त 0% ग्लिसरॉल जोड़ने के द्वारा एक दूसरे की 0.1 ग्राम के भीतर शेष,.
- एक क्षैतिज या झूल बाल्टी रोटर के साथ एक ठंडा ultracentrifuge का प्रयोग, आरसीएफ 77,000 (जैसे एक SW41Ti रोटर के लिए 25,000 rpm) में 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 1 घंटे के लिए संतुलित नमूने स्पिन
- Ultracentrifugation के दौरान, एक गिलास हुक करने के लिए इथेनॉल वर्षण कदम (4.6 नीचे) पर फ्लोटिंग डीएनए पर कब्जा. एक गिलास पाश्चर pipet के दोनों सिरों को पकड़ो और एक लौ पर मध्यम वर्ग को निलंबित. जब कांच का एक खंड लगभग पिघला हुआ है, धीरे से खींच गिलास खिंचाव, धीरे यह मोड़ करने के लिए एक कसकर angled हुक (<90 डिग्री) बनाने, और तेजी से खींचने के लिए सील बंद अंत. यदि कांच हुक की नोक खुला है, लौ पर टिप पकड़ इतना है कि इसे बंद करने के लिए पर्याप्त ग्लास पिघला देता है.
- Ultracentrifugation के बाद, आप बीच में एक अंधेरे स्थान के साथ एक पतली अपारदर्शी गोली देखना चाहिए. ध्यान तरल ट्यूब से aspirate पक्षों के साथ drippings सहित, लेकिन ट्यूब के नीचे गोली से परहेज.
- कमरे के तापमान में 0.5 मिलीलीटर tne जोड़ें.
- चलो कम से कम 10 मिनट के लिए गोली बैठने के लिए गोली के जलयोजन की अनुमति हे.ptional: गोली भी tne में रातोंरात resuspend सकता है, अगर 4 में रखा डिग्री सेल्सियस
4. तीसरा दिन: डीएनए "भूत" वर्षा
- एक छोटे बोर विंदुक टिप (जैसे एक P200 विंदुक टिप) के साथ pipetting द्वारा गोली तोड़ . इस कदम पर कर्तन, क्योंकि वायरल डीएनए अभी भी इस बिंदु पर capsids में निहित है के बारे में चिंता मत करो. कमरे के तापमान पर वायरल गोली, capsids नष्ट युक्त ट्यूब निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें:
- 4.25 मिलीलीटर tne
- 0.25 मिलीलीटर 10% एसडीएस
- 2 मिलीग्राम proteinase कश्मीर
पर यहाँ से कर्तन के खबरदार, जैसे बड़े बोर pipettes का उपयोग करें और भंवर वायरल सामग्री नहीं
- Phenol के क्लोरोफॉर्म की 5 मिलीलीटर जोड़कर वायरल प्रोटीन निकालें और तुरंत inverting या vortexing एक रासायनिक पायस को बनाए रखने के लिए शुरू. 10 सेकंड के लिए मिश्रण है, तो 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2000 आरसीएफ में पायस अपकेंद्रित्र. एक विस्तृत बोर विंदुक टिप के साथ शीर्ष परत लीजिए, इंटरफ़ेस से परहेज है, और एक नया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण वैकल्पिक: का प्रयोग करें चरण इस चरण में लॉक जेल (PLG) ट्यूबों अंतरफलक से संक्रमण से बचने.
- दोहराएँ फिनोल - क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और फिर अपकेंद्रित्र.
- दूसरी phenol के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के बाद, एक 30 मिलीलीटर कांच कोरेक्स ट्यूब में ऊपर परत जमा और -20 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए ठंड ट्यूब, ख्याल है कि यह स्थिर नहीं करता है ले.
- बर्फ ठंड इथेनॉल 10 मिलीलीटर जोड़ें, ट्यूब (Parafilm एम के शीर्ष पर एक टुकड़ा खींच द्वारा उदाहरण के लिए) को कवर, और तुरंत मिश्रण पलटना . एक डीएनए "भूत" को दिखाई है, जो एक पतली रस्से का वेग के होते हैं के लिए देखो. उलटें ट्यूब धीरे आगे मिश्रण करने के लिए और कारण चिपचिपा डीएनए क्लस्टर के लिए एक साथ precipitates.
- एक गिलास हुक का प्रयोग करने के लिए डीएनए भूत (ओं) पर कब्जा. ध्यान डीएनए दाग के लिए अतिरिक्त तरल निकालने के लिए, तो हुक (नीचे टिप) एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जगह और की अनुमति के लिए सूखी. 0.25 जोड़ें - ते के 0.5 मिलीलीटर डीएनए भूत भंग. कम से कम एक घंटे के लिए आगे बढ़ना करने के लिए डीएनए के resuspension की अनुमति दें. 4 में स्टोर डीएनए वैकल्पिक सी. °: डीएनए उपज को अधिकतम करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कांच हुक बंद तोड़ने, तो कांच के टुकड़े बंद कि resuspension समय पर जारी कर सकते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
एक पर्याप्त MOI उच्च के साथ, कोशिकाओं जंगली प्रकार PRV उपभेदों के लिए ~ 18 घंटे के बाद संक्रमण (hpi) के भीतर पूरा CPE प्राप्त करने चाहिए और ~ जंगली प्रकार एचएसवी -1 उपभेदों (चित्रा 1) के लिए 24 hpi. एक बार संक्रमित कोशिका गोली काटा जाता है, शेष प्रोटोकॉल कदम एक लंबा दिन में पूरा हो सकता है या दो दिनों (चित्रा 2) से अधिक बाहर किए गए कर सकते हैं.
जब गिलास हुक की तैयारी के लिए डीएनए भूत कब्जा, यह महत्वपूर्ण है बनाने के हुक कोण 90 डिग्री से कम हो, इतना है कि बाद में यह एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (चित्रा 3) के आधार में फिट कर सकते हैं. इस हुक की नोक सील pipet अंदर डीएनए नुकसान से बचाता है है.
डीएनए भूत वर्षण कदम के दौरान फार्म और सफेद, रस्से का धागे (चित्रा 4) के रूप में दिखाई देगा. ये समग्र और एक दूसरे को और / या ग्लास करने के लिए डीएनए पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया हुक करने के लिए छड़ी. इस प्रकार एक ही गिलास हुक वर्षण समाधान के भीतर से डीएनए के कई धागे को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
| वांछित मात्रा पर आधारित स्तंभ चुनें: | 10 मिलीलीटर | 15 मिलीलीटर | 20 मिली | 40 मिलीलीटर |
| 1M KCL | 1.3 मिलीलीटर | 1.9 मिलीलीटर | 2.5 मिलीलीटर | 5 मिलीलीटर |
| 1M Tris (7.4 पीएच) | 300 μl | 450 μl | 600 μl | 1.2 मिलीलीटर |
| 1M 2 MgCl | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| 0.5 EDTA | 10 μl | 15 μl | 20 μl | 40 μl |
| NP40/IGEPAL | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| β-mercaptoethanol (प्रयोग करने से पहले तुरंत जोड़) | 4.3 μl | 6.5 μl | 8.6 μl | 17.2 μl |
| वांछित प्रतिशत ग्लिसरॉल (0, 5, या 45%) के लिए अनुपात का प्रयोग करें | ||||
| 0% ग्लिसरॉल | कोई नहीं | कोई नहीं | कोई नहीं | कोई नहीं |
| पानी | 8.3 मिलीलीटर | 12.5 मिलीलीटर | 16.7 मिलीलीटर | 33.4 मिलीलीटर |
| 5% ग्लिसरॉल | 0.5 मिलीलीटर | 0.8 मिलीलीटर | 1.0 मिलीलीटर | 2.0 मिलीलीटर |
| पानी | 7.8 मिलीलीटर | 11.7 मिलीलीटर | 15.7 मिलीलीटर | 31.4 मिलीलीटर |
| 45% छlycerol | 4.5 मिलीलीटर | 6.8 मिलीलीटर | 9.0 मिलीलीटर | 18.0 मिलीलीटर |
| पानी | 3.8 मिलीलीटर | 5.7 मिलीलीटर | 7.7 मिलीलीटर | 15.4 मिलीलीटर |
तालिका 1. LCM बफ़र्स की तैयारी के लिए व्यंजन विधि
| 50 मिलीलीटर मात्रा के लिए |
| 5 मिलीलीटर 1M NaCl |
| 2.5 मिलीलीटर 1M Tris, 7.5 पीएच |
| 1 मिलीलीटर 0.5 EDTA |
| 41.5 मिलीलीटर एच 2 हे |
तालिका 2. Tne (, 50 मिमी Tris, पीएच 7.5, 0.1 एम NaCl 10 मिमी EDTA) की तैयारी
| 1 एल की मात्रा के लिए |
| 0.2 छ KCl |
| 0.2 छ 2 के.एच. पीओ 4 |
| 8 छ NaCl |
| 1.15g ना 2 HPO 4 |
| एच 2 1L के लिए हे |
तालिका 3. पीबीएस (, 1.5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 137 मिमी NaCl, 8.1 मिमी ना 2 4 HPO, 2.7 मिमी KCl 7.0 पीएच) की तैयारी
चित्रा 1. PK15 कोशिकाओं (ए) पूर्व संक्रमण के संक्रमण के माध्यम से रास्ते के मध्य में (बी), और (सी) cytopathic प्रभाव (CPE) में संक्रमण के एक उच्च बहुलता के बाद ,.
चित्रा 2 प्रोटोकॉल का अवलोकन.
चित्रा 3. तीन कांच के प्रतिनिधि उदाहरण के लिए वायरल डीएनए भूत इकट्ठा किया हुक.
चित्रा 4 एक अच्छी तरह से बनाई और प्रचुर मात्रा में डीएनए "भूत" की प्रतिनिधि उदाहरण है .
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के भाग मूल BSL4 परिस्थितियों में वायरल डीएनए अलगाव के लिए विकसित किए गए, लेकिन यह गैर BSL स्थितियों के लिए समान रूप से अच्छी तरह से adapts 4 हम आमतौर पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अल्फा herpesviruses PRV और एचएसवी -1, जो डीएनए जीनोम से डीएनए को अलग. capsid और एक लिपिड लिफाफा से घिरा proteinaceous में संलग्न 7,8 हालांकि यह संभावना है सीधे अन्य बड़े डीएनए वायरस के लिए अनुकूलनीय बीटा और गामा herpesviruses और adenoviruses सहित. इसी प्रकार extractions आमतौर पर आरएनए वायरस के लिए कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया 9.
शुद्धि के कई तरीके है कि शामिल हैं से इस डीएनए तैयार करने की संभावना के परिणाम की मजबूती. प्रारंभिक Freon extractions denature लिपिड झिल्ली, सेल घटकों को अलग करने और भी लिपिड लिफाफा और बाहरी आवरण प्रोटीन है कि herpesvirus capsids चारों ओर जारी. इस ultracentrifugation, जहां भारी वायरल गोली nucleocapsids दो ढाल तकिये के माध्यम से, प्रभावी रूप से उन्हें सबसे अन्य सेलुलर घटकों से अलग द्वारा पीछा किया जाता है. इन capsids resuspended हैं, और वायरल nucleocapsid डीएनए proteinase कश्मीर और डिटर्जेंट के साथ capsids rupturing द्वारा जारी की है. दो phenol के क्लोरोफॉर्म extractions पूरी तरह nucleocapsid घटकों और किसी भी शेष सेलुलर प्रोटीन हटायें. अंत में, बड़े समाधान में वायरल डीएनए जीनोम की तेज़ी लवण के carryover या कण contaminants को कम कर देता है.
यह वायरल nucleocapsid डीएनए को अलग करने की प्रक्रिया में प्रचुर मात्रा में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उच्च शुद्धता सामग्री प्रदान करता है. एकाधिक निष्कर्षण और centrifugation कदम के संयोजन सरल निकासी एकल प्रोटोकॉल है कि 10 डीएनए के साथ और अधिक सेलुलर मलबे या अपमानित प्रोटीन उत्पादों छोड़ इस प्रोटोकॉल से अलग है. प्रोटीन contaminants वायरल डीएनए का भंडारण स्थिरता कम है, और कोशिकाओं में अभिकर्मक क्षमता को कम कर सकते हैं. सेलुलर डीएनए contaminants के नकारात्मक प्रभाव पीसीआर प्रतिक्रियाओं और उच्च throughput अनुक्रमण प्रोटोकॉल 1 इस प्रोटोकॉल के डीएनए उपज भी अधिक है, यह अच्छी तरह से प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) विश्लेषण और सोख्ता दक्षिणी. 5,11 एक nucleocapsid तैयारी के लिए अनुकूल बनाने के लिए पर्याप्त प्रदान करता है. इन विश्लेषण के सभी के लिए सामग्री.
संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की मात्रा वायरल डीएनए के अंतिम उपज प्रभावों. जंगली प्रकार के एक विकास दर, पीके 15 कोशिकाओं (एक 15 सेमी व्यास पकवान लगभग 8 x 10 6 कोशिकाओं रखती) के 5-10 व्यंजन के इनपुट के साथ PRV उपभेदों के लिए आमतौर पर वायरल डीएनए के 250-500 μg पैदावार. संक्रामक virions की कम उपज के साथ वायरल म्यूटेंट के लिए, इनपुट सामग्री उर्ध्व तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए. व्यंजन के इनपुट संख्या दोहरीकरण लगभग उपज दोगुना होगा, और यहाँ वर्णित अभिकर्मकों एक ही मात्रा के साथ संसाधित किया जा सकता है. इस बिंदु से परे इनपुट बढ़ाने के लिए, हम दो समानांतर हैंडलिंग धाराओं (जैसे दो सेल छर्रों और दो निष्कर्षण ट्यूब) में 3.13 कदम के माध्यम से इनपुट सामग्री को अलग करने की सलाह देते हैं. एक ही वायरल तनाव के दो ultracentrifugation छर्रों इस resuspension कदम पर एक ट्यूब में जोड़ा जा सकता है. यदि डीएनए सफाई प्रक्रिया के अंत में एक भूत के रूप में विफल रहता है, प्राथमिक समस्या निवारण दृष्टिकोण के लिए कक्षों की इनपुट मात्रा है, जो डीएनए उपज बढ़ाने के लिए और उसके वर्षण सुधार होगा वृद्धि हुई है.
अन्य शर्तें भी भूत गठन की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यह जब वायरल nucleocapsids प्रचुर मात्रा में हैं एक बिंदु पर संक्रमण के समय फसल के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन ज्यादातर intracellular या सेल जुड़े हैं. मध्यम करने के लिए जारी virions इस प्रक्रिया द्वारा कब्जा नहीं होगा, और इसलिए कोशिकाओं को संक्रमण में बहुत देर से (उदाहरण के लिए जब CPE बिंदु जहां कोशिकाओं को पकवान से अलग करने के लिए प्रगति की है) से कटाई संभावित डीएनए उपज और भूत गठन कम हो जाएगा. यह भी महत्वपूर्ण है पूरी तरह से LCM बफर में काटा सेल गोली (3.2 चरण) को भंग करने के लिए निम्नलिखित निष्कर्षण कदम का पूरा फायदा ले, इस resuspension अधिक समय और देखभाल की आवश्यकता है अगर सेल गोली पिछले कदम पर जमे हुए किया गया है. माइनर प्रक्रियात्मक विवरण डीएनए उपज के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित करते हैं. जबकि चरण 3 और 4 ठंडा समाधान का उपयोग करने और बर्फ पर सभी ट्यूबों रखने के बिना किया जा सकता है, डीएनए ghosting की सफलता की दर बहुत अधिक है जब अभिकर्मकों ठंड रखा जाता है. इसी प्रकार, समय पर समाधान में गिरावट आती है, और इसलिए यह LCM का समाधान करने के लिए जोड़ने के तुरंत पहले उपयोग अपने को कम करने की क्षमता का अनुकूलन, प्रोटीन व्यवधान में सुधार और डीएनए उपज और भूत गठन बढ़ाने में β mercaptoethanol की स्थिरता. इन विवरण के लिए सावधान ध्यान उच्च गुणवत्ता वायरल डीएनए के उत्पादन में सुधार होगा.
क्योंकि वायरल डीएनए चिपचिपा है, जिसके परिणामस्वरूप समाधान विषम जा सकता है. कांच हुक से resuspension के लिए और अधिक समय की अनुमति दे उपयोगी डीएनए उपज बढ़ जाती है और समाधान की एकरूपता में सुधार. मानक spectrophotometryडीएनए उपज और पवित्रता quantitate इस्तेमाल किया जा सकता है. डीएनए fluorimetry डीएनए उपज का और भी अधिक सटीक उपाय (जैसे Invitrogen PicoGreen dsDNA दाग) उपलब्ध कराता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक ग्रेग स्मिथ, लीज़ा Pomeranz, मैट Lyman, MARLIES Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, और ठीक ट्यूनिंग इस प्रोटोकॉल में Enquist प्रयोगशाला के सदस्यों के योगदान की सराहना करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–thane) | Fisher Scientific | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
References
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