La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de l'AMPc en cage ou en cage Ca pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs.
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Article de méthode
Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels
Dans cet article
Résumé
Résumé
La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs 1. Caged composés sont des molécules composées physiologiquement inactive par une cage chimique qui peut être rompu par un éclair de lumière ultraviolette. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de composés en cage pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs. Le processus de transduction olfactive (Figure 1) se déroule dans les cils olfactifs des neurones sensoriels, où se liant aux récepteurs odorants conduit à l'augmentation de l'AMPc qui ouvre des nucléotides cycliques-dépendants (CNG) des canaux 2. D'entrée de Ca par les canaux CNG active les canaux Cl Ca-activé. Nous montrons comment dissocier les neurones de l'épithélium olfactif de souris 3 et comment activer les canaux CNG ou Ca-Cl activé les canaux par photolyse de l'AMPc en cage en cage 4 ou 5 Ca </ Sup>. Nous utilisons une lampe flash 6,7 à appliquer clignote ultraviolets pour la région ciliaire à uncage AMPc ou Ca alors de patch-clamp enregistrements sont prises pour mesurer le courant dans la cellule entière voltage-clamp de configuration 8-11.
Protocole
1. Instrumentation
- Pour mesurer la réponse des neurones sensoriels olfactifs à la photolyse de composés piégés, nous utilisons une lampe flash combinée à un système classique d’enregistrement en enregistrement par électrode à aspiration comprenant : un amplificateur pour enregistrement par électrode à aspiration, une électrode d’enregistrement et une électrode de référence reliées à la tête d’amplification, un convertisseur analogique-numérique, un ordinateur, un logiciel d’acquisition de données, des micromanipulateurs, un microscope à épifluorescence, un système de perfusion, une table anti-vibrations et une cage de Faraday (Figure 2).
- Pour produire un éclat lumineux intense d’ultraviolets (UV), nous utilisons une lampe flash au xénon (unité flash JML-C2 de Rapp OptoElectronic, Figure 3A) qui fonctionne en déchargeant un condensateur à haute tension à travers un tube flash à arc court rempli de gaz xénon6-7. L’éclat lumineux peut être déclenché manuellement ou par l’ordinateur, à l’aide du même logiciel qui contrôle l’acquisition électrophysiologique.
- Un filtre passe-bas UV optimisé pour les applications de dépiégeage (270-390 nm) est inséré dans une fente de sortie de la lampe flash, et une fibre optique en quartz est connectée au microscope (voir 1.5).
- L’intensité de l’éclat lumineux, et donc l’ampleur de la photolyse, peut être modifiée en ajustant certains paramètres :
tension ou capacité6. En effet, l’intensité lumineuse est liée à l’énergie stockée dans le condensateur et dépend de la valeur de la capacité et de la tension à ses bornes, selon la relation classique 0,5 CV2. Trois valeurs de capacité peuvent être sélectionnées sur le panneau avant de notre lampe flash (C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF ou C3 = 3000 μF), et la tension peut varier entre 100 et 385 volts (Figure 3A), produisant une énergie stockée comprise entre 5 et 220 J. La durée de l’éclat varie de 0,5 à 1 ms à mi-largeur maximale et dépend de la valeur de capacité sélectionnée. Avant de sélectionner une capacité différente ou de réduire la tension, il est nécessaire de décharger le condensateur en choisissant le mode de décharge sur le panneau avant de la lampe flash (Figure 3A).
Toutefois, l’énergie lumineuse n’est pas simplement proportionnelle à l’énergie stockée, pour de multiples raisons liées à la physique des décharges gazeuses et aux pertes non linéaires dans le circuit lorsque l’énergie électrique augmente6. Pour mesurer l’énergie associée à un éclat lumineux, un joulemètre, tel que le JM10 fourni par RappOptoElectronics, peut être utilisé. Noter que l’énergie en sortie du guide lumineux en quartz, avec filtre UV en place, est comprise entre 1 et 15 mJ par éclat, comme indiqué dans le guide utilisateur de l’unité flash de Rapp OptoElectronic.
Un ensemble photodiode (Figure 3B) est fourni avec l’unité lampe flash et peut être utilisé pour estimer les variations d’intensité lumineuse en fonction de C et V. En effet, la sortie de la photodiode est proportionnelle à l’intensité lumineuse. Suivant les instructions du guide utilisateur, le guide lumineux est connecté à l’entrée de l’ensemble photodiode, tandis que la sortie est reliée à un oscilloscope. La Figure 3C montre la tension de crête de sortie de la photodiode en réponse à des éclats lumineux pour les trois valeurs de capacité C1, C2 ou C3 disponibles sur notre unité lampe flash, en fonction de la tension appliquée. Ces valeurs changent à mesure que la lampe flash vieillit. Il est recommandé d’utiliser régulièrement la photodiode pour vérifier la détérioration de la lampe flash.
Plutôt que de modifier la capacité et/ou la tension sur le panneau avant, un contrôle plus précis et plus rapide de l’intensité lumineuse est obtenu en insérant des filtres neutres dans une deuxième fente de filtre de la lampe flash (Figure 3A). Cette approche est plus rapide, et en outre, la durée de l’éclat, qui dépend de la valeur de capacité sélectionnée, n’est pas modifiée. En utilisant des filtres neutres dont la transmission varie de 100 % à 0,1 %, l’intensité de l’éclat peut être rapidement ajustée sur une large gamme. - L’éclat lumineux est dirigé vers le neurone, cultivé sur des boîtiers à fond en verre, à l’aide d’un guide lumineux en fibre optique en quartz (Figure 2). Le guide lumineux est connecté à l’adaptateur d’épifluorescence du microscope inversé. Un cube de filtres modifié, sans filtre d’excitation, dirige le faisceau UV vers le neurone par un miroir dichroïque.
- La lumière est focalisée à travers un objectif à immersion à l’huile de 100x. La zone couverte par l’éclat est visualisée en insérant le guide lumineux dans un éclairage fournissant une source continue de lumière visible. L’image (représentée en jaune dans la vidéo) est visualisée sur un écran via une caméra CCD connectée au microscope. Le contour de la zone éclairée est dessiné sur l’écran afin de localiser la zone d’éclat UV pour les expériences. Avant d’appliquer l’éclat UV, la région ciliaire du neurone est positionnée dans la zone dessinée sur l’écran.
- La dimension du spot de lumière UV est contrôlée par le grossissement de l’objectif, le diamètre du guide lumineux et la position du guide lumineux à l’arrière du microscope. Nous utilisons un objectif à immersion à l’huile de grossissement 100x. Le diamètre du spot circulaire est mesuré en dirigeant la lumière d’un éclairage sur une lame micrométrique placée sur la platine du microscope. Le diamètre du spot dans notre configuration est d’environ 16, 33, 50 ou 105 μm pour un guide lumineux de diamètre respectivement de 200, 400, 600 ou 1250 μm.
2. Préparation des solutions
Disséction
- Solution de Ringer : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM pyruvate de sodium (pH 7,4 ajusté avec NaOH 1 M).
- Solution d'arrêt : solution de Ringer contenant 0,1 mg/ml de BSA, 0,3 mg/ml de leucine aminopeptidase (leupeptin) et 0,02 mg/ml de DNaseI.
- Solution de Ringer sans cations divalents : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glucose, 1 mM pyruvate de sodium (pH 7,4 avec NaOH 1 M). Ajouter 200 μM de cystéine et 2 U/ml de papain pour la dissociation enzymatique.
Remarque : Stériliser les solutions par filtration avant la dissection.
Solutions pour l’enregistrement en configuration patch-clamp
Solutions extracellulaires
- Solution de Ringer extracellulaire : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM pyruvate de sodium (pH 7,4 ajusté avec NaOH 1 M).
- Solution de Ringer à faible teneur en Ca : 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM pyruvate de sodium (pH 7,4 ajusté avec NaOH 1 M).
Solutions intracellulaires
Préparez et utilisez toujours les solutions de composés piégés à la lumière tamisée afin d'éviter la dégradation des composés piégés par la lumière ambiante. Protégez les récipients de la lumière en utilisant du papier d'aluminium.
AMPc piégé :
- Préparer une solution intracellulaire contenant 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP et 0,1 mM NaGTP (pH 7,4 ajusté avec KOH 1 M).
- Préparer une solution mère en dissolvant du cAMP piégé (BCMCM-cAMP4) dans du DMSO à 50 mM. Réaliser des aliquotes de 5 μl. Conserver jusqu'à un an à -20°C.
- Dissoudre une aliquote de la solution mère de cAMP piégé dans la solution intracellulaire afin d'obtenir une concentration finale de 50 μM de cAMP piégé. Mélanger à l'aide d'un vortex.
- Prélever des aliquotes de 1 ml de la solution intracellulaire contenant le cAMP piégé. Conserver jusqu'à deux mois à -20°C avant utilisation.
Ca piégé :
Nous préparons des solutions intracellulaires contenant du DMNP-EDTA 3 mM5 chargé à 50 % avec 1,5 mM de Ca.
- Préparer une solution intracellulaire contenant 140 mM KCl (ou CsCl), 10 mM HEPES (pH 7,4 ajusté avec 1 M KOH ou CsOH).
- Ouvrir un flacon de 5 mg de DMNP-EDTA. Ajouter 52,8 µl d'une solution standard de chlorure de calcium à 0,1 M et 1 ml de solution intracellulaire. Mélanger à l’aide d’un vortex.
- Pour éviter la libération du calcium piégé par la lumière ambiante, transférer la solution dans un tube protégé de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Ajouter la solution intracellulaire pour atteindre un volume final de 3,5 ml. Mélanger à l’aide d’un vortex. Préparer des aliquotes d’environ 1 ml de la solution intracellulaire contenant le calcium piégé et conserver jusqu’à deux mois à -20 °C en attendant son utilisation.
Remarques : Pendant les expériences, protégez les solutions de composés piégés de la lumière à l’aide de papier d’aluminium et conservez-les sur de la glace. Filtrez stérilement la solution intracellulaire.
3. Dissociation de neurones sensoriels olfactifs de souris
Les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices italiennes relatives à l'utilisation des animaux de laboratoire (Décret législatif 27/01/1992, n° 116) et aux directives de l'Union européenne sur la recherche animale (n° 86/609/CEE).
- Préparer trois boîtes à fond de verre revêtues de concanavaline-A à 10 mg/ml et de poly-L-lysine à 10 mg/ml.
- Pour préparer la dissection, préparer 1 ml de solution de Ringer sans divalents. Remplir deux boîtes de Pétri de 50 mm recouvertes de Sylgard avec la solution de Ringer et les placer sur de la glace. Refroidir également un mélange de papaine-cystéine, 0,5 ml de la solution d'arrêt, et une seringue munie d'un filtre de 0,22 μm contenant environ 10 ml de solution de Ringer.
- Sacrifier une souris par asphyxie au CO2, suivie d'une décapitation. Retirer la peau recouvrant le crâne, inciser le long des lignes de la mâchoire et placer la tête dans une boîte de Pétri recouverte de Sylgard.
- Placer la boîte sous un stéréomicroscope. À l’aide d’un scalpel, diviser sagittalement la tête selon la ligne médiane. Tourner la moitié de la tête avec le côté médial vers le haut. Retirer soigneusement le septum afin d’exposer les cornets (voir aussi Cygnar et al., 201013).
- À l’aide de pinces n°3 et d’un scalpel, retirer les cornets tapissés d’épithélium olfactif. Transférer dans une boîte de Pétri recouverte de Sylgard.
- À l’aide de pinces superfines n°55, séparer les fragments d’épithélium olfactif des parties attachées des cornets. Les transférer dans un tube contenant 1 ml de solution de Ringer sans divalents. Ajouter le mélange de papaine et de cystéine. À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, hacher finement les épithéliums et incuber à température ambiante pendant 3 minutes. Hacher à nouveau délicatement avec les ciseaux microchirurgicaux et attendre 5 minutes supplémentaires.
- À l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme, transférer dans un tube contenant 0,5 ml de la solution d’arrêt.
- Centrifuger à 300 g (1500 tr/min) pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et ajouter environ 1 ml de solution de Ringer filtrée. Trifurquer délicatement à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme.
- Déposer environ 0,3 ml de la solution contenant les cellules au centre des trois boîtes à fond de verre. Laisser les cellules se déposer pendant environ une heure à +4 °C. Ajouter la solution de Ringer.
4. Enregistrement
- Préparez des pipettes de patch à partir de capillaires en borosilicate afin d'obtenir des résistances de 3 à 7 MΩ lorsqu'elles sont remplies avec la solution intracellulaire.
- Placez une boîte en verre à fond plat contenant les neurones sensoriels olfactifs dissociés sur la platine du microscope inversé. Perfusez avec la solution de Ringer.
- Protégez une seringue contenant la solution intracellulaire avec des composés piégés de la lumière en l'enveloppant de papier d'aluminium et maintenez-la au réfrigérateur. Travaillez à la lumière tamisée afin d'éviter la dégradation des composés piégés par la lumière ambiante.
- Recherchez un neurone sensoriel olfactif isolé possédant des cils intacts à un grossissement de 100x. Déplacez la platine du microscope pour positionner la région ciliaire à l'intérieur du cercle dessiné sur l'écran afin de localiser la zone prédéfinie d'impulsion UV.
- Remplissez une pipette de patch avec la solution intracellulaire contenant le composé piégé à l'aide d'une aiguille souple. Éliminez les bulles à l'extrémité de la pipette. Insérez la pipette dans le porte-pipette de la tête d'enregistrement de l'amplificateur de patch-clamp. Approchez le soma du neurone à l'aide du micromanipulateur et appliquez une aspiration douce pour obtenir un scellement gigaohm. Réglez la tension à -60 mV et appliquez une aspiration supplémentaire pour atteindre le mode cellule entière en utilisant les techniques standards de patch-clamp12.
- Attendez au moins deux minutes pour permettre la diffusion du composé piégé dans les cils.
- Sur l'ordinateur, démarrez un protocole de stimulation et enregistrez la réponse. Utilisez un filtre passe-bas à 1 kHz et numérisez à une fréquence d'échantillonnage d'au moins 2 kHz.
- Un protocole de stimulation typique maintient la tension à une valeur constante et déclenche l'émission d'un flash UV provenant de la lampe flash pour la photolyse du composé piégé dans la région ciliaire.
5. Résultats représentatifs :
Vous devriez être en mesure de produire une photoactivation locale de l'AMPc piégé ou du Ca piégé dans la région ciliaire d'un neurone sensoriel olfactif isolé et d'enregistrer la réponse en courant en configuration de blocage voltage en tout-ou-rien.
La figure 4 montre un courant entrant typique provoqué par un éclair UV induisant la photolyse du cAMP piégé, enregistré à une tension de -60 mV en présence d'une solution de Ringer extracellulaire à faible concentration en Ca. Dans ces conditions, le courant entrant est dû à l'entrée de Na⁺ par les canaux CNG. La phase croissante du courant était rapide et a été ajustée par une fonction exponentielle simple avec une constante de temps de 3,4 ms.
Les figures 5A-B montrent les réponses d'un autre neurone sensoriel olfactif en milieu à faible concentration en Ca et dans une solution de Ringer contenant 1 mM de Ca. La phase ascendante du courant à -60 mV devient nettement plus lente et multiphasique (figures 5 A-B). Ceci est dû à l'action du Ca pénétrant dans les cils par les canaux CNG et activant un courant secondaire de Cl10. La composante cationique précoce du courant, résultant de l'activation des canaux CNG, est plus faible dans la solution de Ringer à 1 mM de Ca que dans la solution à faible teneur en Ca, en raison du blocage provoqué par les ions Ca qui traversent les canaux et réduisent ainsi le courant total.
Une autre façon de réduire l'augmentation du Ca dans les cils consiste à fixer le neurone à +60 mV (Figure 5 C-D). La phase ascendante de la réponse due à la libération de cAMP à +60 mV était bien décrite par une exponentielle simple avec une constante de temps de 6,7 ms, indiquant la présence d'une seule composante de courant.
En libérant par photoactivation le Ca à l'intérieur des cils d'un neurone sensoriel olfactif, vous devriez être en mesure de mesurer un courant montant rapidement. Ce courant est porté par des ions Cl⁻. La figure 6 A montre des courants entrants à -50 mV induits par la libération photochimique du Ca piégé en réponse à des impulsions UV d'intensités différentes. La phase de montée des courants de Cl⁻ activés par le Ca a été correctement décrite par une exponentielle simple, avec des constantes de temps variant entre 3,8 et 5 ms (figure 6 B).
Figure 1. Transduction olfactive dans les cils des neurones sensoriels olfactifs. Les molécules odorantes se lient aux récepteurs d'odeurs (OR), activant une protéine G qui, à son tour, active l'adénylyl cyclase (ACIII), entraînant une augmentation intracellulaire de l'AMPc. L'AMPc ouvre les canaux activés par les nucléotides cycliques (CNG), permettant l'entrée des ions Na et Ca. L'augmentation du calcium intracellulaire active les canaux chlorure sensibles au Ca. De l'AMPc piégé ou du Ca piégé peuvent être introduits dans les cils par diffusion à travers une micropipette en configuration « patch ». Un éclat de lumière UV provoque la photolyse du composé piégé (modifié, avec autorisation, d'après Pifferi et al. 20062).
Figure 2. Système d'enregistrement en configuration patch-clamp et de photolyse par éclairs. Les composants du montage comprennent un amplificateur patch-clamp, un ordinateur, un convertisseur analogique-numérique, un microscope à épifluorescence, une lampe à éclairs au xénon, une caméra CCD et un moniteur. Les lignes bleues et violettes indiquent respectivement le trajet de la lumière visible et de la lumière UV.
Figure 3. Lampe à éclairs au xénon. (A) Source lumineuse utilisée pour la photolyse par éclairs de composés piégés. (B) Module photodiode utilisé pour évaluer l'intensité de l'impulsion lumineuse. (C) Le guide de lumière provenant de la lampe à éclairs a été connecté à l'entrée de la photodiode et la sortie a été visualisée sur un oscilloscope. L'une des trois valeurs de capacité disponibles (C1, C2 ou C3) a été sélectionnée à l'aide du commutateur sur le panneau avant de la lampe à éclairs, et la tension a été modifiée en tournant le bouton situé sur le panneau avant. La tension de sortie de la photodiode, en réponse à différentes intensités d'éclairs, a été tracée en fonction de la tension appliquée pour chaque valeur de capacité : C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF ou C3 = 3000 μF. Un guide de lumière de 600 μm de diamètre a été utilisé.
Figure 4. Enregistrement en mode patch-clamp en réponse à la photolyse du cAMP piégé dans une solution extracellulaire pauvre en Ca. (A) Réponse du courant en mode cellule entière induite dans un neurone sensoriel olfactif isolé par la photolyse du cAMP piégé localisé au niveau des cils. Un flash UV a été délivré au moment indiqué par la flèche. Le potentiel de maintien était de -60 mV. (B) La phase croissante du courant était bien ajustée par une fonction exponentielle simple (ligne pointillée) avec une constante de temps de 3,4 ms.
Figure 5. Réponses en courant induites par la photolyse du cAMP piégé dans des solutions à faible concentration en Ca et dans la solution de Ringer. (A) Un neurone sensoriel olfactif a été placé dans une solution de Ringer contenant 1 mM de Ca ou dans une solution à faible concentration en Ca, à un potentiel de maintien de -60 mV. Un flash UV a été délivré au moment indiqué par la flèche. (B) Les réponses en courant tracées à une échelle de temps agrandie montraient une phase de montée multiphasique dans la solution de Ringer, tandis que la phase de montée était bien ajustée par une fonction exponentielle unique (ligne pointillée), avec une constante de temps de 3,5 ms pour la réponse enregistrée dans la solution à faible concentration en Ca. (C) Réponses en courant provenant du même neurone montré en (A), placé dans la solution de Ringer à un potentiel de maintien de -60 mV et +60 mV. (D) Les réponses en courant tracées à une échelle de temps agrandie présentaient une phase de montée multiphasique à -60 mV, alors qu'à +60 mV, la phase de montée était bien décrite par une exponentielle unique de constante de temps 6,7 ms (ligne pointillée).
Figure 6. Réponses à la photolyse du Ca piégé. (A) Courants en mode cellule entière induits par la photolyse du Ca piégé à -50 mV. Des impulsions UV ont été délivrées au moment indiqué par la flèche. L'intensité des impulsions a été modulée à l'aide de filtres à densité neutre. (B) Une échelle de temps agrandie montre l'augmentation rapide du courant après la libération photo-induite du Ca. Les courants étaient bien ajustés par une fonction exponentielle simple (lignes pointillées), avec des constantes de temps de 5, 4,8, 3,8 ms. (Reproduit, avec autorisation, de Boccaccio & Menini, 200710).
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Discussion
Photolyse de composés en cage combiné avec des enregistrements de patch-clamp est une technique utile pour obtenir des sauts rapides et locales de la concentration de molécules actives physiologiquement à l'intérieur et l'extérieur des cellules. Plusieurs types de composés1 cage ont été synthétisés, et cette technique peut être appliquée à divers types de cellules, y compris les cellules en culture exprimant les canaux ioniques qui peuvent être activées ou modulée par photolyse de certains des composés disponibl...
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Équipement | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Adapter Module lampe flash au microscope | Rapp optoélectroniques | FlashCube 70 | |
| Air de table | TMC | Micro-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Logiciel d'acquisition de données | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Logiciel d'analyse de données | WaveMetrics | Igor | |
| Miroir pour module adaptateur | Rapp optoélectroniques | M70/100 | |
| Porte-électrode | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday cage | Custom made | ||
| Cube de filtre | Olympus | U-UTH | Filtre d'excitation enlevés |
| Lampe flash | Rapp optoélectroniques | JML-C2 | |
| Pince Dumont # 55 | Instruments de précision du monde | 14099 | |
| Capillaires en verre | Instruments de précision du monde | PG10165-4 | |
| Plat à fond de verre | Instruments de précision du monde | FD35-100 | |
| Illuminateur | Olympus | Highlight 3100 | |
| Microscope inversé | Olympus | IX70 | |
| Micromanipulateurs | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige | PP-830 | |
| Moniteur | HesaVision | MTB-01 | |
| Les filtres neutres | Omega Optical | varie | |
| Objectif 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Soit Zeiss ou Olympus |
| Objectif 100X | Olympus | UPLFLN 100XOI2 | Soit Zeiss ou Olympus |
| Optique UV shortpass filtre | Rapp optoélectroniques | SP400 | |
| Amplificateur de patch-clamp | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Assemblée diode photo | Rapp optoélectroniques | PDA | |
| Quartz guide de lumière | Rapp optoélectroniques | varie | Nous utilisons 600 um de diamètre |
| Fil d'Argent | Instruments de précision du monde | AGT1025 | |
| Argent-chaussée granulés | Warner instruments | 64-1309 | |
| Xénon lampe à arc | Rapp optoélectroniques | XBL JML |
| Réactif | Société | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| BCMCM-cage AMPc | BioLog | B016 |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 0,1 M solution standard | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cystéine | Sigma | C9768 |
| Concanavaline A de type V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Le glucose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptine | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| La papaïne | Sigma | P3125 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Références
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- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
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- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
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- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
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- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
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Réimpressions et autorisations
