Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

Summary

La prédiction de l'utilisation du corécepteur du VIH-1 est nécessaire pour l'administration d'une nouvelle classe de médicaments anti-rétroviraux, les antagonistes du corécepteur soit. Elle peut être effectuée par analyse de la séquence de l' Env Gène et l'interprétation ultérieure par un système d'interprétation basé sur Internet (geno2pheno _{[Corécepteur]}).

Abstract

Le maraviroc (MVC) est le premier médicament homologué antirétroviral de la classe des antagonistes des corécepteurs. Il se lie à l'hôte corécepteur CCR5, qui est utilisé par la majorité des souches de VIH pour infecter les cellules humaines immunitaires (Fig. 1). D'autres isolats de HIV utiliser un corécepteur différente, le CXCR4. Lequel récepteur est utilisé, est déterminée dans le virus de la protéine Env (Fig. 2). Selon le corécepteur utilisé, les virus sont classés comme R5 ou X4, respectivement. MVC se lie au récepteur CCR5 inhiber l'entrée du virus R5 dans la cellule cible. Au cours de l'évolution de la maladie, les virus X4 peuvent émerger et dépasser les virus R5. Détermination de l'usage du corécepteur (aussi appelée tropisme) est donc obligatoire avant l'administration de MVC, comme exigé par l'EMA et de la FDA.

Les études d'efficacité MVC MOTIVER, MERIT et 1029 ont été réalisées avec le test Trofile de monogramme, San Francisco, USA Ceci est un essai de haute qualité basé sur sophisticated essais recombinés. L'acceptation de ce test de routine quotidienne est plutôt faible en dehors des Etats-Unis, puisque les médecins européens ont plutôt tendance à travailler avec des laboratoires experts décentralisés, qui fournissent également des tests de résistance concomitante. Ces laboratoires ont fait l'objet de plusieurs évaluations d'assurance de la qualité, la dernière a été présentée en 2011 ^1.

Depuis plusieurs années, nous avons effectué des déterminations tropisme basée sur l'analyse de la séquence env du VIH-V3 région du gène (V3) ^2. Cette région comporte suffisamment d'informations pour effectuer une prédiction fiable. La détermination du génotype de l'utilisation de corécepteur présente des avantages tels que: réduction du temps de chiffre d'affaires (équivalent à des tests de résistance), une réduction des coûts, la possibilité d'adapter les résultats aux besoins des patients et la possibilité d'analyser des échantillons cliniques avec une charge virale très faible, voire indétectable (VL ), d'autant plus que le nombre d'échantillons analysés avec CV <1000 copies / ulenviron augmenté au cours des dernières années (figure 3).

Les principales étapes de test de tropisme (Fig. 4) montre cette vidéo:

1. Prélèvement d'un échantillon de sang
2. L'isolement de l'ARN du VIH dans le plasma et / ou l'ADN proviral du VIH de cellules mononucléées sanguines
3. L'amplification de la région env
4. L'amplification de la région V3
5. Réaction de séquence de l'amplicon V3
6. Purification des échantillons de séquençage
7. Le séquençage des échantillons purifiés
8. Édition de séquence
9. Séquençage l'interprétation des données et de prévision tropisme

Protocol

Le protocole est résumé dans la figure. 4.

1. Prélèvement d'échantillons sanguins

1. Recueillez au moins 3 ml de sang dans des tubes EDTA sur le site clinique.
2. Les échantillons peuvent être conservés jusqu'à une semaine à 4 ° C.
3. Envoyer les échantillons de sang EDTA dès que possible au laboratoire par courrier ordinaire.

2. L'isolement de l'ARN du VIH et / ou l'ADN

1. Obtenir l'ARN viral et / ou de l'ADN à partir de sang total 1000 pi, du sérum ou du plasma, en utilisant la MagNA Pure isolation compacte kit Nucleic Acid I I et le système MagNA pur compact.
2. Éluer l'ARN ou l'ADN obtenu dans 50 pl de tampon TE. En variante, d'autres acides nucléiques procédures de purification peuvent être utilisées.

3. L'amplification de la région env

Amplifier la région env (Figs. 2 et 4) à partir de plasma supporte ARN ou d'ADN proviral. A 1245 pb au long du produit, comprenant la majorité de la protéine Env (nt 6556-7811 according à HXB2) est généré.

1. Échantillons d'ARN par RT-PCR: réaction
   1. L'ARN viral présente une structure très complexe secondaire (Fig. 4) qui peuvent entraver la réaction de RT. Pour éviter ce problème, incuber 10 ul d'ARN à 65 ° C pendant 10 minutes (déjà dans le tube de PCR et dans la machine PCR), puis réduire la température à 50 ° C.
   2. Ajouter 40 ul de la PCR Master Mix, y compris les amorces Env-F et-R Env.
      
      Master Mix pour la RT-PCR In-House-système:
      

      	volume / réaction (pl)	concentration finale
      RNase H 2 O	14,4
      Tampon 5x (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	10	1x
      5x Q-Solution	10	1x
      dNTP Mix (10 mM chacun)	2	400 pM de chaque dNTP
      Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 M)	0,3	0,6 uM
      RNase Inhibitor (RNasin)	1	5 unités / réaction

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 selon HXB2)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   3. Exécuter la réaction de RT à 50 ° C pendant 30 minutes.
   4. Exécuter la première PCR comme suit:
      
      

      95 ° C, 15 min	1 x
      95 ° C, 30 sec 50 ° C, 30 sec 72 ° C, 2 min
      95 ° C, 30 sec 56 ° C, 30 sec 72 ° C, 2 min	38 x
      72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

      1 x
2. Échantillons d'ADN: réaction PCR
   
   Pour les échantillons d'ADN proviral, aucune réaction initiale RT est nécessaire, et la réaction de PCR peut démarrer directement.
   1. Ajouter 40 pl de PCR Master Mix à 10 pl de l'ADN PROVIAL.
      
      
      Master Mix PCR pour In-House-système:
      

      	volume / réaction (pl)	concentration finale
      RNase H 2 O	15,4
      Tampon 5x (ADN polymérase HotStarTaq)	10	1x
      5x Q-Solution	10	1x
      dNTP Mix (10 mM chacun)	2	400 pM de chaque dNTP
      Enzym-Mix (ADN polymérase HotStarTaq)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 M)	0,3	0,6 uM

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   2. Exécutez les conditions de PCR comme décrit précédemment pour les échantillons d'ARN (étape 3.1.4).

4. L'amplification de la région V3: PCR nichée

1. Pour la PCR nichée, utilisez 5 pl de la première réaction de PCR (sans analyse précédente en gel d'agarose) comme matrice et ajouter 95 ul de Mas PCRMélanger ter.
   
   Master Mix pour Nested-PCR In-House

   	volume / réaction (pl)	concentration finale
   H 2 O	61,9
   Tampon PCR 10x	10	1x
   5x Q-Solution	20	1x
   dNTP Mix (10 mM chacun)	2	200 uM de chaque dNTP
   Primer Env-2F (100 M)	0,3	0,6 uM
   Primer Env-2R (100 M)	0,3	0,6 uM
   ADN polymérase HotStarTaq	0,5	2,5 unités / réaction

   
   
   Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)
   
   
2. Exécutez la PCR comme suit:

   93 ° C, 15 min	1 x
   95 ° C, 30 sec 50 ° C, 30 sec 72 ° C, 90 sec	1 x
   95 ° C, 30 sec 56 ° C, 30 sec 72 ° C, 90 sec	43 x
   72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

3. Analyser le produit de PCR sur un gel d'agarose 1% (Figure 4). Le produit attendu est 902 pb de long.
4. Purification des échantillons de séquençage.
   1. Purifier le produit PCR avec le kit Qiagen PCR Purification Kit, en utilisant le protocole, des solutions et des micro-colonnes fournies par le fournisseur. Éluer dans 30-100 pi de tampon PE, en fonction de l'intensité des bandes.
   2. Alternativement, les échantillons peuvent être purifiés en utilisant l'exonucléaseI et rapide AP (Thermo phosphatase alcaline). À cette fin, ajouter 6 pi Exo-AP Mix à 15 ul produit de PCR et incuber 15 minutes à 37 ° C.

      580 ul H 2 O

      66 ul rapide AP

      13,4 ul Exo I

5. Réaction de séquence de l'amplicon V3

1. La réaction consiste en une séquence de réaction de PCR en utilisant seulement l'une des amorces suivantes:
   
   Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980)
   Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371)
   Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
   Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
   Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
   Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
   Amorces de premier choix sont les suivants: Env-2, Env-6 ou Env-7, Env-11
2. Utilisez 1 pl de l'amplicon V3 purifié comme modèle et ajouter 9 pl de PCR master mix.
   
   Séquençage Mix Master:

   4 mix séquence ul (VIH génotypage Kit)

   4 pl H 2 O

   1 Primer ul (100 pmol / pl)

3. Exécuter la séquence réactionnelle suivante:

   96 ° C, 10 sec
   50 ° C, 10 sec	36 x
   60 ° C, 45 sec
   4 ° C ∞

6. Purification des échantillons de séquençage

Purifier les séquences using Sephadex G-50 superfine.

1. Remplissez le nombre approprié de puits dans le "chargeur colonne" de Sephadex G-50 superfine. Transférer le Sephadex pour la MAHVN4510 plaque filtrante en retournant.
2. Ajouter 300 ul Milli-Q H ₂ O dans chaque puits de la plaque de filtration et incuber pendant au moins 3 heures à 2-8 ° C.
3. Centrifuger les plaques pendant 5 min à 910Xg et 4-15 ° C. Jeter l'effluent à travers.
4. Ajouter 10 ul de H ₂ O à la séquence du produit et ensuite la séquence pipette sur la plaque de Sephadex gonflé.
5. Pour obtenir le produit purifié, centrifuger la plaque pendant 5 min. à 910Xg et 4-15 ° C et récupérer le flux continu.

7. Le séquençage des échantillons purifiés sur le séquenceur ABI Prism XL 3130

1. Avant chaque course, changer le tampon et vérifier le volume du polymère (POP7). Si nécessaire, remplacez le flacon polymère ancienne par une nouvelle.
2. Utiliser les conditions d'exécution sauvegardées, y compris un temps d'injection de 18 secondes.
3. Dans cette machine, la collecte des données de signal d'une course de 16 échantillons de séquence dure environ 60 min (36 cm capillaire) ou 150 min (50 cm capillaire).

8. Édition de séquence

1. Utilisez le programme (ADN-Star) Lasergene d'aligner et d'éditer les séquences (fig. 5). D'autres programmes d'édition de séquence peut être utilisé. Utilisez un "consensus V3-B" et la séquence consensus env en tant que références.
2. Lasergene crée une séquence consensus de l'échantillon analysé à l'aide de toutes les données brutes disponibles et les stocker en tant que fichier FASTA. Le fichier FASTA est un fichier texte qui comprend un en-tête avec le nom de l'échantillon et la séquence de nucléotides.

9. Séquençage l'interprétation des données et de prévision tropisme

1. Séquençage d'interprétation des données est effectuée par le système d'interprétation basé sur le Web geno2pheno _{[corécepteur]} ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Pour la prévision tropisme, les paramètres du FPR différents peuvent être sélectionnés. Le réglage par défaut est selon les recommandations thérapeutiques germano-autrichienne. Pour FPR ≥ 20%, le virus est classé comme lorsque R5 FPR ≥ 20% et X4 FPR <12,5%.
2. Téléchargez le fichier FASTA dans le serveur. Ce serveur convertit la séquence de nucléotides en acides aminés, il s'aligne avec la séquence B-V3 consensus et produit une classification sous-type. En outre, il génère une prédiction de l'utilisation du corécepteur (Fig. 4) exprimée en taux de faux positifs (FPR).

10. Les résultats représentatifs

Le geno2pheno _{[corécepteur]} sortie montre une interprétation progressive du tropisme. En fonction de la probabilité de l'utilisation du corécepteur, le texte d'interprétation et couleur de fond varie du vert (FPR <20%), ce qui suggère une administration sécuritaire pour MVC, au jaune, suggérant un possible risque faible et enfin au rouge. Le rouge est la couleur suggèretion de ne pas prescrire MVC. En outre, le serveur génère un rapport pdf qui peut être imprimé, rempli avec le patient et les données de l'échantillon, et envoyé au médecin. Des exemples de geno2pheno sortie _{[corécepteur]} sont représentés sur la Fig. 6.

Comprenne qui pourra. 1. Schéma de la réplication du VIH. Virion doit se lier aux récepteurs CD4 cellulaire que et soit le CCR5 ou CXCR4 comme corécepteur. Le corécepteur CCR5 peut être bloqué par des antagonistes du CCR5 maraviroc (MVC comme, Celsentri, Selzentry). Après la fusion des membranes virales et cellulaires, la nucléocapside virale est libérée dans le cytoplasme. La nucléocapside se démonte et le complexe ARN viral est libéré dans le cytoplasme. La transcriptase inverse virale (RT) transcrit l'ARN génomique en ADN proviral, qui est ensuite transporté vers le noyau et intégré dans le génome de l'hôte par l'intégrase du VIH. Polymérases ARN cellulaire transcribe génomique virale et ARN messagers du génome proviral. Les protéines virales sont produites dans le cytoplasme et transportées à la surface de la cellule. Le bourgeon particules virales immatures, comme non infectieux des virions à partir des cellules. La protéase du VIH clive les protéines produisent des particules infectieuses. L'inhibition de l'une des étapes conduit à une interruption du cycle de réplication.

Les médicaments antirétroviraux et l'étape de réplication qui ils inhibent sont marqués en rouge.

L'ARN viral et l'ADN proviral (matériau utilisé pour l'analyse tropisme ou résistance) sont marquées en vert.

Figure 2. Génome proviral du VIH. La particule de VIH est construit avec différentes protéines structurales et des maisons de diverses enzymes et de protéines à la fois d'origine virale et cellulaire. La figure montrents la localisation des gènes dans le génome viral. La surface protéines gp120 et gp41 constituent des pointes sur la surface du virion et communiquer avec la cellule humaine pour réaliser la fusion membranaire. Dans la partie inférieure de la figure, les produits d'amplification PCR et les amorces utilisées dans notre protocole sont affichés.

Figure 3. Proportion de patients ayant une charge virale faible (VL) des mesures analysées pour la résistance aux médicaments ou la détermination de tropisme à l'Institut de Virologie, Université de Cologne (Allemagne).

Figure 4. Diagramme d'ensemble de l'expérience .. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Séquence d'édition avec Lasergene. L'amplicon V3 est séquencée avec au moins une amorce avant et une marche arrière. Lasergene alignes les «ABI». Fichiers obtenus à partir du séquenceur avec des séquences de référence du «Consensus V3-B" et env. Lasergene crée une séquence consensus à l'aide de toutes les données de rangées disponibles. Les séquences de référence peut être marqué (et sont ensuite affichés en gris) de sorte qu'elles ne contribuent pas à la séquence consensus de l'échantillon.

Figure 6. Rapports de prévision tropisme générés par le geno2pheno _{[corécepteur]} tool.The rapports sont générés sous forme de fichiers pdf qui peuvent être enregistrés et complétés dans l'ordinateur. Des données supplémentaires telles noms patient nous, la date de prélèvement de sang, etc, peuvent être inclus manuellement à l'aide d'un programme pdf writer. Observations spécifiques peuvent également être ajoutés. The Les données sont exclusivement sur ​​l'ordinateur de l'utilisateur et non sur le serveur geno2pheno _{[corécepteur].} S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La séquence V3 permet une prédiction fiable tropisme viral, comme indiqué dans les études cliniques ^3-9. En fait, la détermination génotypique est envisagé dans les directives européennes et germano-autrichienne ^10.

Comparativement à l'essai phénotypique, non seulement le temps de rotation plus courte (équivalent à des tests de résistance), mais aussi les coûts. En outre, un avantage majeur du test génotypique est que les résultats sont classés en tant FPR et ne peut donc être adapté aux besoins des patients. Résultats Trofile, d'autre part, sont tout simplement des rapports R5 ou X4, et l'accès aux données brutes n'est pas donné.

À l'heure actuelle, les directives européennes suggèrent un FPR cut-off de 20 à ^10%, tandis que les lignes directrices austro-allemandes permettent d'adapter le FPR coupure spécifiquement aux besoins de chaque patient ^11. Dans cette ligne, pour les patients avec un large éventail d'options de médicaments antirétroviraux, plus FPR seuils (> 20%) sont recommterminé. En revanche, pour lourdement prétraités patients atteints de peu d'options thérapeutiques, le bas du FPR seuils (> 5%) peuvent être utilisés. Ce type d'orientation thérapeutique est actuellement en cours par la résistance à tester INTI, INNTI, les IP, et l'INIS, où les médicaments partiellement actifs peuvent être inclus dans le traitement des patients atteints réduction des options thérapeutiques. En outre, avec un nombre croissant de changements de thérapie génotypiquement-guidés, la clinique pertinente FPR seuils sont continuellement ajustés par un panel de bioinformaticiens, des virologistes et des cliniciens.

Un autre avantage important des tests génotypiques de tropisme est la possibilité d'analyser des échantillons cliniques avec une charge virale très faible, voire indétectable (VL). Dans ce cas, lorsque l'ARN plasmatique n'est pas amplifiable, l'ADN proviral peut être séquencés et utilisés pour des prévisions fiables ^9,12. Fait à noter, le nombre de patients ayant une charge virale basse ou indétectable a fortement augmenté au cours des dernières années. À ce jour, le Trofil de test ne permet que l'analyse des échantillons provenant de patients atteints de LV <1000 copies / ml. Cependant, des études préliminaires ont montré que l'ADN proviral peut être aussi adecuate d'être testé par Trofile ^13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MagNA Pure Compact Kit Nucleic Acid Isolation I	Roche Diagnostics	04 802 993 001
MagNA Pure System Compact	Roche Diagnostics	03731146001
T3000 Thermocycleur	Biometra	050-723
One Step RT-PCR Kit	Qiagen	210215
HotStarTaq Mix Master Kit	Qiagen	203445
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Exonucléase I (Exo I)	Fermentas	EN0582
Fastap thermosensible phosphatase alcaline	Fermentas	EF0651
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 Superfine	GE Healthcare	17-0041-01
ABI Prism 3130 XL séquenceur capillaire	Applied Biosystems	3130XL