Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l'agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l'électrophysiologie et d'imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d'étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l'aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.

Résumé

Les stimuli visuels sont détectés et transporté sur une large plage dynamique des intensités de lumière et les variations de fréquence par des neurones spécialisés dans la rétine des vertébrés. Deux classes de neurones rétiniens, les photorécepteurs et les cellules bipolaires, accomplir ceci en utilisant un ruban de type zones actives, qui permettent la libération des neurotransmetteurs soutenue et à haut débit sur de longues périodes. SUR-type mixte bipolaire cellule (Mo) de terminaux dans la rétine des poissons rouges, qui dépolarise à des stimuli lumineux et recevoir tige mixtes et l'entrée des photorécepteurs cônes, sont appropriés pour l'étude de ruban de type synapses tant en raison de leur grande taille (~ 10-12 um de diamètre) et à leurs nombreuses latéraux et réciproque connexions synaptiques avec les dendrites des cellules amacrines. L'accès direct aux terminaux Mb cellule bipolaire en tranches le poisson rouge de la rétine avec la technique de patch-clamp permet la mesure de Ca ^{2 +} présynaptiques courants, les changements de capacitance de membrane, et la rétro-inhibition réciproque synaptique médiée par le GABA <sub> A et récepteurs GABA _C exprimée sur les bornes. Présynaptiques mesures capacitance membranaire de l'exocytose permettent d'étudier la plasticité à court terme de la libération des neurotransmetteurs excitateurs ^14,15. De plus, la plasticité à court terme et à long terme de la libération du neurotransmetteur inhibiteur des cellules amacrines peut aussi être étudiée par les enregistrements de la rétro-inhibition réciproque arrivant au terminal Mb ^21. Plus de courtes périodes de temps (par exemple, ~ 10 s), la rétro-inhibition GABAergique réciproque de cellules amacrines subit double choc de dépression à travers l'épuisement des vésicules piscine GABA ^11. La dynamique de microcircuits synaptique rétinienne dans la couche plexiforme interne de la rétine peut donc être étudiées directement.

La technique du cerveau-tranche a été introduit plus de 40 ans mais est encore très utile pour les enquêtes sur les propriétés électriques des neurones, à la fois au corps cellulaire unique, simple ou dendrite axone, et microcircuit niveau synaptique ^19. Les tissus qui sont trop petits pour être collé directement sur ​​la chambre de tranchage sont souvent les premiers embarqués dans l'agar (ou placé sur un papier filtre), puis en tranches ^{20, 23, 18, ​​9.} Dans cette vidéo, nous employons la technique agar pré-enrobage en utilisant la rétine des poissons rouges. Certaines des bornes géantes cellules bipolaires dans nos tranches de la rétine poissons rouges sont axotomisés (axone-cut) pendant la procédure de découpage. Cela nous permet d'isoler seule terminaison nerveuse présynaptique entrées, parce que l'enregistrement à partir de terminaux axotomisés exclut les signaux à partir du compartiment soma-dendritique. Alternativement, on peut également enregistrer à partir intactes les cellules bipolaires Mb, en enregistrant à partir de terminaux attachés à axones qui n'ont pas été coupés lors de la procédure de trancher. Globalement, l'utilisation de ce protocole expérimental d'aide dans les études de la physiologie synaptique rétinienne, microcircuit analyse fonctionnelle, et la transmission synaptique dans les synapses de ruban.

Protocole

1. Solutions internes et externes

1. Préparer la solution de tranchage (calcium) de solution mère 10x et ajouter MgCl _2, CaCl _2, et le D-glucose quotidien. La solution finale se compose de 1x (en mM): NaCl 119, KCl 2,5, 3,2 MgCl _2, CaCl ₂ 0,25, 12 D-glucose, 0,2 acide L-ascorbique, 12 HEPES. Régler le pH à 7.4 (avec NaOH), et ajuster l'osmolarité de 260 mOsm (en utilisant H ₂ O et de la solution stock de 10x).
2. Peser 3% à faible température gélifiant agar (Agarose de type VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) et mélanger avec le tranchage solution. Chauffer la solution d'agar contenant dans un micro-....

Discussion

Une étape cruciale et difficile dans notre protocole est le transfert de la pièce de la rétine dans la solution d'agar (protocole 3.4). Il est nécessaire de retirer délicatement le corps vitré et la solution tranche résiduelle de la pièce de la rétine et le transférer sans distorsion ou de flexion. Afin d'accomplir cela, nous utilisons une petite spatule (21-401-25B, Fisherbrand) avec une pointe recourbée pour former une angle de 90 °, avec une pince la pointe inclinée (11251-35, Outils Fine Sci.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Basse température gélifiant agar	Sigma	A0701	Agarose de type VII-A
Patch pipette	Instruments de précision du monde	1B150F-4	Paroi épaisse (1,5 mm de diamètre extérieur) en verre borosilicate
Extracteur vertical	Narishige	PP830
Cire dentaire	Cavex
Ciseaux de printemps	Outils Fine Science	15003-08
Coudée à 45 ° pince à pointe fine	Outils Fine Science	11251-35
Lame de rasoir	Personna		À double tranchant, nettoyés avec de l'éthanol 70% et H 2 O
Tube cylindrique	Fisherbrand	03 à 338-1B	Flacons en polyéthylène de 2,5 ml
Hyaluronidase	Sigma	H6254
Vibratome trancheuse	Leica	VT1000S ou VT1200S
Microscope droit	Olympus	BX51WI
60x eau objectif à immersion	Olympus	LUMPlanFl	NA 0.90
La caméra CCD	Sony	XC-75
Caméra de contrôleur	Hamamatsu	C2400
Moniteur	Sony		13 "moniteur noir et blanc
Filtre seringue	Nalgene		0,2 um
Micromanipulateur	Instrument Sutter	MPC-200
Amplificateur lock-in	HEKA		EPC-9/10 amplificateurs ont un logiciel d'émulation
Spinning microscope confocal à disque laser	Yokogawa	CSU-X1	Imagerie des cellules vivantes, après l'enregistrement patch clamp de cellules entières
Slidebook logiciels	Intelligent Imaging Instruments (3i)		Imagerie d'acquisition de données et d'analyse
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148
Solution tampon de phosphate	IGBCO	70013
Glisser Superfrost	Fisher Scientific		Lame de verre
Des agents anti-décoloration	Biomeda corp.
Confocale à balayage laser Microscope	Carl Zeiss	LSM 710	L'imagerie de tissus fixés
Spatule	Fisherbrand	21 à 401-25B
Manuel verticales trancheuse	Narishige	ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1	Invitrogen	O-6806	Ca 2 + colorant sensible fluorescents
Alexa Fluor 555 hydrazide	Invitrogen	Un 20501MP-	Colorant fluorescent