Constriction chronique du nerf sciatique et les essais hypersensibilité à la douleur chez le rat

Summary

Grâce à la simplicité de la chirurgie et le résultat robuste du comportement, de constriction chronique du nerf sciatique est l'un des modèles animaux pré-éminents de la douleur neuropathique. Dans les 24 heures suivant la chirurgie, hypersensibilité à la douleur est établi et peut être mesurée quantitativement l'aide d'un von Frey esthésiomètre (essais mécaniques) et le compteur analgésie plantaire (essai thermique).

Abstract

Douleur neuropathique chronique, résultant de dommages au système nerveux central ou périphérique, est une condition fréquente et invalidante, affectant 7-18% de la population ^1,2. Les symptômes comprennent spontanée (picotements, sensation de brûlure, des chocs électriques comme) la douleur, dysesthésie, paresthésie, allodynie (douleur résultant de normalement non douloureuses stimuli) et l'hyperalgésie (une réponse accrue aux stimuli douloureux). Les symptômes sensoriels sont co-morbide avec des troubles du comportement, comme l'insomnie et la dépression. Pour étudier la douleur neuropathique chronique des modèles animaux mimant plusieurs lésion du nerf périphérique ont été développés, l'un des plus couramment utilisé est Bennett et Xie (1988) du nerf sciatique unilatérale de constriction blessure chronique (ICC) ³ (Figure 1). Nous présentons ici une méthode pour effectuer des CCI et hypersensibilité à la douleur des tests.

CCI est réalisée sous anesthésie, avec le nerf sciatique d'un côté exposé en faisant le plusincision parents, et couper à travers le tissu conjonctif entre les fessiers et superficiel biceps fémoral muscles. Quatre ligatures intestinale chromiques sont liés de façon lâche autour du nerf sciatique à intervalles de 1 mm, à un peu boucher, mais pas arrêter le flux sanguin epineural. La plaie est refermée avec des sutures dans le muscle et les agrafes dans la peau. L'animal est ensuite autorisé à récupérer d'une chirurgie pendant 24 heures avant le test hypersensibilité à la douleur commence.

Pour les tests comportementaux, les rats sont placés dans l'appareil d'essai et sont autorisés à s'habituer à la procédure de test. La zone testée est la surface mi-plantaire de la patte arrière (Figure 2), qui s'inscrit dans la distribution du nerf sciatique. Seuil de retrait mécanique est évaluée par les deux pattes de derrière mécaniquement stimuler blessés et saufs en utilisant une électronique dynamique plantaire von Frey esthésiomètre ou manuel von Frey poils ^4. Le seuil de retrait mécanique est la pression maximale exercée(En grammes) qui déclenche retrait de la patte. Pour la mesure de temps de latence de retrait thermique, la première fois par Hargreaves et al (1988), la patte arrière est exposée à un faisceau de chaleur rayonnante à travers une surface de verre transparente à l'aide d'un compteur plantaire analgésie ^5,6. Le temps de latence de retrait de la relance de la chaleur est comptabilisé comme du temps de retrait de la patte dans les deux pattes de derrière blessés et saufs. Après l'ICC, seuil de retrait mécanique, ainsi que la latence de retrait thermique dans la patte blessée sont à la fois considérablement réduit, par rapport à des mesures de référence et la patte indemne (figure 3). Le modèle CCI de lésion du nerf périphérique associée à des tests hypersensibilité à la douleur constitue un système modèle pour étudier l'efficacité d'agents thérapeutiques potentiels pour modifier la douleur neuropathique chronique. Dans notre laboratoire, nous utilisons CCI aux côtés de la sensibilité thermique et mécanique des pattes postérieures pour enquêter sur le rôle des interactions neuro-immunes dans la pathogenèseet le traitement de la douleur neuropathique.

Protocol

1. Constriction du nerf sciatique chronique

Des techniques aseptiques devraient être utilisées pour la procédure chirurgicale. Désinfecter la surface de travail chirurgical avec de l'éthanol 70% et se préparer à l'avance des instruments stériles (par exemple, des ciseaux fins, pinces, et rétracteurs), les gazes, des agrafes et des prélèvements à l'autoclave. Pour de multiples interventions chirurgicales, nettoyer et instruments restériliser d'éthanol à 70% ou un stérilisateur à sec cordon entre les rats. Un masque chirurgical, chapeau cheveux et des gants stériles devraient être portés.

Pour la constriction du nerf, de préparer la suture intestinale chromique en le coupant en petits morceaux d'environ 3 cm de longueur immergés dans une solution saline stérile, pour éviter le dessèchement. Pour refermer la plaie, utilisez disponibles dans le commerce sutures de soie stériles.

1. Anesthésier le rat dans une chambre d'induction en utilisant 5% d'isoflurane en O _2, puis elle émet 2% l'isoflurane en O ₂ par l'intermédiaire d'une coutume fait un masque facial, et de surveiller l'animal anesthésié au cours de la procédure. Communes anesthésiques alternatives sont inhalées halothane ou de sodium par voie intrapéritonéale du pentobarbital. La kétamine, comme un antagoniste des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), devrait être évitée puisque ces récepteurs jouent un rôle important dans le développement de la douleur neuropathique.
2. Rasez la patte postérieure gauche du rat. Ensuite, placez l'animal sur un tapis chauffant thermo-régulée à 37 ° C et d'appliquer une pommade ophtalmique lubrifiante pour les yeux.
3. Stériliser la zone rasée avec trois applications de remplacement de l'alcool isopropylique à 70% et une solution d'iode.
4. Avec le rat couché sur sa poitrine / thorax, élever la jambe gauche de derrière et maintenir en position avec le femor à 90 ° par rapport à la colonne vertébrale à l'aide de ruban-cache sur le pied.
5. Faire une incision dans la peau parallèlement, mais de 3-4 mm en dessous de la femor, et libérer la peau des muscles entourant l'incision en coupant à travers le tissu conjonctif.
6. Avec des ciseaux émoussés, coupées à travers le tissu conjonctif entre les fessiers superficiel et les bicepsmuscles crural.
7. Utiliser un écarteur à creuser l'écart entre les deux muscles, ce qui permet une visualisation claire du nerf sciatique.
8. Utilisation de courbes atraumatiques pince et micro-ciseaux, doucement libre environ 10 mm du nerf sciatique (à proximité de la trifurcation sciatique) à partir du tissu conjonctif environnant.
9. Sous le microscope et une bonne source de lumière, attachez quatre ligatures (intestin chromique 4.0, Ethicon, États-Unis) avec un double nœud, 1 mm d'intervalle, à proximité de la trifurcation du nerf sciatique. Pour chaque ligature, commencer avec une seule boucle lâche, puis saisissez les deux extrémités à proximité de la boucle et serrer jusqu'à ce que la boucle est à peine serré et la ligature ne glisse pas le long du nerf. Pour maintenir la boucle dans sa position correcte, placer une deuxième boucle sur le dessus de la première à terminer le nœud. Enfin, couper les bouts de la ligature d'environ 1mm. Constriction du nerf devrait être minime, et immédiatement arrêté si une secousse brève est observée, pour empêcher l'arrestation d'edébit sanguin e epineural. Au cours de serrer les ligatures conduit à axotomie, et autotomie (auto-mutilation), les deux effets secondaires indésirables qui empêchent succès les tests hypersensibilité à la douleur.
10. Utilisez des sutures (Mersilk 5.0, Ethicon) pour fermer la couche musculaire et des agrafes (Autoclip, 9 mm) pour fixer la peau. Ensuite, utilisez une solution d'iode (Riodine) pour stériliser la plaie.
11. Observez le rat étroitement au cours de la période de récupération d'anesthésie, et lui permettre de récupérer dans une cage séparée avec lit le papier à plat (pas la litière des animaux d'élevage norme), afin d'éviter l'animal inconscient d'étouffement.
    Avant de donner des enquêteurs analgésie post-opératoire doit tenir compte du fait cela peut interférer avec les tests hypersensibilité à la douleur. En fait, il existe des preuves que l'application locale d'anesthésique, la lidocaïne, au moment du traumatisme peut altérer le développement de la douleur neuropathique, et de diminuer le degré de l'hyperalgésie dans les semaines précédentes ^7. Pour plus de détails sur ce mAtter voir revue par Bennett et al ^8.

2. Les mesures de comportements de la douleur

1. Des manipulations quotidiennes des rats pendant plusieurs jours avant de commencer l'expérience est recommandé afin d'habituer les rats à leur gestionnaire, réduire le stress et le risque de mordre.
2. Avant les tests de comportement, les rats ont besoin d'être habitué à la procédure de test et le compartiment des animaux. L'environnement du test devrait rester au calme et bien contrôlée, avec la température et hygrométrie constantes, et réalisé à la même époque de la journée chaque session de test.
3. Hypersensibilité à la douleur des tests doivent être effectués plusieurs fois avant de l'ICC (base) et à différents moments après l'ICC, comme vous le souhaitez.

3. Seuil de retrait mécanique

1. Le jour du test, les rats placer dans la cage des tests de maille élevée étages 15-30 minutes avant de mesurer les seuils de retrait, ce qui permet la cage d'exploration et de Grooactivités ming de cesser et de rats de devenir détendu et immobile.
2. En utilisant une dynamique plantaire von Frey esthésiomètre (Ugo Basile, Italie), la position de l'unité de contact-stimulateur avec le filament directement sous la surface mi-plantaire de la patte arrière, en évitant le treillis métallique, et appuyez sur la touche de démarrage. Ce lève le filament à stimuler mécaniquement la surface plantaire de la patte arrière avec une force croissante.

Manuelles von poils Frey sont une série de filaments de diamètre croissant qui sont calibrés pour induire une force spécifique lorsqu'elle est appliquée sur la peau. Ils peuvent être utilisés comme une alternative à un esthésiomètre électronique plantaire dynamique von Frey pour la mesure du seuil de retrait de la patte, comme décrit précédemment ^4. Il ya également plusieurs autres fabricants de von électronique esthésiomètres Frey (p. ex IITC, Etats-Unis et Somedic, Suède).

3. Enregistrez le seuil de retrait mécanique de hindpa fois blessé et saufsws, dans un ordre contrebalancé. Ce dispositif applique une pression sur la patte et de la réaction de retrait le système enregistre et affiche automatiquement la force maximale appliquée (en grammes). Si une réponse ambiguë se produit (c.-à-dans le cas de la marche ou de toilettage), répétez le stimulus et enregistrer le seuil à nouveau. Lécher ou en secouant de la stimulation suivante patte arrière est un signe de comportement associé à la douleur.
4. Répétez la stimulation mécanique 3 fois avec un intervalle d'environ 5 min entre les stimuli, enregistrer les seuils, puis calculer la moyenne des seuils de retrait de la patte.

4. Latence de retrait thermique

L'intensité de chaleur infra-rouge (IR) de l'instrument d'essai plantaire doit être ajustée avant de commencer l'expérience. Dans notre laboratoire, nous ajustons l'intensité IR de donner un temps de latence moyen de patte de retrait d'environ 10 secondes chez les rats naïfs, et nous avons mis le temps de latence de coupure à 20 secondes pour éviter d'endommager les tissusl'âge en cas d'échec pour supprimer une patte.

1. Le jour du test, les rats placer dans la cage de verre tests étages 15-30 minutes avant de mesurer la latence, permettant l'exploration cage et le toilettage des activités de cesser et les rats de devenir détendu et immobile.
2. L'utilisation d'un instrument de l'analgésie thermique plantaire (Ugo Basile, Italie), la position de la source infrarouge directement sous la surface mi-plantaire de la patte arrière, et appuyez sur la touche de démarrage. Cette situation expose la surface plantaire de la patte arrière d'un faisceau de chaleur rayonnante à travers une surface en verre transparent. Il ya aussi d'autres fabricants de thermiques instruments analgésie plantaires (p. ex IITC, Etats-Unis et Stoelting, Etats-Unis).
3. Noter le temps de latence de retrait à partir de pattes de derrière à la fois blessés et saufs, dans un ordre contrebalancé. Ce dispositif enregistre automatiquement le temps nécessaire (en secondes) depuis le début de la stimulation thermique pour le retrait de la patte de la source de chaleur. Si une réponse ambiguë se produit (c.-à-dans le cas de ambulation ou de la toilette), répétez le stimulus et enregistrer le temps de latence à nouveau. Lécher ou en secouant de la stimulation suivante patte arrière est un signe de comportement associé à la douleur.
4. Répétez la stimulation de la chaleur au moins 3 fois avec un intervalle d'environ 5 min entre les stimuli, enregistrer les temps de latence, puis calculer la moyenne des temps de latence retrait de la patte.

4. Les résultats représentatifs

Un exemple de seuil de retrait mécanique et de la latence de retrait thermique dans les pattes ipsilatéral (blessé) et controlatéral (indemne) de rats Wistar est montré avant (de référence) et 2-12 jours après l'ICC à la figure 3A, et la figure 3B. De ces chiffres, il peut être vu que de l'ICC entraîne une réduction significative dans les deux seuils de retrait mécaniques et thermiques latences de retrait de la patte postérieure ipsilatérale, indiquant la présence d'hypersensibilité à la douleur mécanique et thermique, les deux caractéristiques de la douleur neuropathique chronique .

Figure 1. Un schéma illustrant le positionnement des ligatures dans le modèle ICC. Ce modèle animal de la douleur neuropathique implique le placement de quatre lâches chromique-intestinale ligatures sur le nerf sciatique, à mi-cuisse. Il en résulte qu'une partie blesser des afférents allant de l'hypersensibilité à la douleur pied et postérieure de la patte arrière.

Figure 2. Schéma de la zone patte arrière utilisé pour le test de douleur. La surface à mi-plantaire juste derrière les coussinets plantaires, comme indiqué par le cercle rouge en pointillés, est utilisé pour le test de douleur. Cette zone est innervé principalement par les branches terminales du nerf sciatique. Le talon et coussinets doivent être évités en raison de la sensibilité cutanée différentielle.

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Hypersensibilité à la douleur la figure 3. À la suite de constriction chronique du nerf sciatique chez le rat. Après l'ICC, il ya une réduction significative du seuil de retrait de la patte à des stimuli mécaniques (A) et la latence de retrait de patte à des stimuli thermiques (B) en la personne lésée (ipsilatéral) patte arrière par rapport à la non blessé (controlatéral) patte arrière (P <0,01 mesures répétées 2 ANOVA). Les données montrent moyenne ± SEM, n = 7 rats Wistar.

Discussion

CCI est largement utilisé modèle de périphérique des lésions nerveuses de la douleur neuropathique chronique. Il est relativement simple à réaliser, et produit hypersensibilité à la douleur robuste et stable pour au moins un mois après une blessure. Après l'ICC, les rats présentent une posture anormale de la patte arrière lésée (orteils maintenues ensemble et flexion plantaire et la patte éversée), ainsi que répété en secouant, de gardiennage et le léchage de la patte arrière lésée suggérant la présence de la douleu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif / équipements	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Intestin chromique	Ethicon	G-211	Épaisseur de 4-0
L'isoflurane	Delvet Pty Ltd, Seven Hills, NSW	n / a
Mersilk	Ethicon	W-580	5-0 épaisseur
Autoclip	Becton Dickinson	427631	9 mm acier inoxydable
Riodine	Orion	R1000802F	1% p / v d'iode
Thermique instrument analgésie plantaire	Ugo Basile	37370
Dynamique esthésiomètre plantaire	Ugo Basilee	37400