Une méthode pour la détermination de l'activité kinase acétate est décrite. Ce test utilise une réaction directe pour déterminer l'activité enzymatique et la cinétique de l'acétate kinase dans le sens de l'acétate de former avec différents accepteurs phosphoryle. Par ailleurs, cette méthode peut être utilisée pour doser les autres phosphates d'acétyle ou l'acétyl-CoA d'enzymes utilisant.
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Article de méthode
Détection directe de l'activité Acétate de formation de l'acétate kinase Enzyme
Dans cet article
Résumé
Résumé
Acétate kinase, un membre de l'acétate et le sucre kinase-Hsp70-actine superfamille enzymatique (ASKHA) 1-5, est responsable de la phosphorylation réversible de l'acétate d'acétyl phosphate de l'ATP en utilisant comme substrat. Acétate kinases sont omniprésents dans les bactéries, dans un genre d'Archaea, et sont également présents dans les microbes de l'Eukarya 6. L'acétate kinase plus bien caractérisé est celui de la thermophila productrices de méthane archaeon Methanosarcina 7-14. Un acétate kinase, qui ne peut utiliser PP i, mais pas dans le sens de l'ATP acétyl phosphate formant a été isolé de E. histolytica, l'agent causal de la dysenterie amibienne, et a jusqu'ici seulement été trouvé dans ce genre 15,16.
Dans le sens de la formation de phosphate acétyle, l'activité kinase de l'acétate est généralement mesurée en utilisant le dosage hydroxamate, d'abord décrit par Lipmann17-20, un essai de couplage dans lesquels la conversion de l'ATP en ADP est couplée à l'oxydation du NADH en NAD + par la pyruvate kinase enzymes et de la lactate déshydrogénase 21,22, ou un dosage mesurant la libération de phosphate inorganique après la réaction du produit de phosphate d'acétyle avec de l'hydroxylamine 23. Activité dans le sens opposé, de l'acétate de formation direction est mesurée par le couplage formation d'ATP à partir d'ADP à la réduction du NADP + en NADPH par les enzymes hexokinase et glucose-6-phosphate déshydrogénase 24.
Nous décrivons ici une méthode pour la détection de l'activité kinase d'acétate dans le sens de la formation d'acétate qui ne nécessite pas d'enzymes de couplage, mais est plutôt basé sur la détermination directe de la consommation de phosphate acétyle. Après la réaction enzymatique, restant de phosphate acétyle est converti en un complexe ferrique hydroxamate qui peuvent être mesurées par spectrophotométrie, comme pour le dosage hydroxamate. Ainsi, contrairement à l'èreAndard test couplé à cette direction qui est tributaire de la production d'ATP à partir d'ADP, ce dosage direct peut être utilisé pour les kinases acétate qui produisent de l'ATP ou PP i.
Protocole
Le schéma d'ensemble de ce protocole est présenté dans la figure 1.
1. Préparation de la solution pour les courbes d'étalonnage et dosages
- Préparer 100 ml d'une 2 mol / L solution d'hydroxylamine-HCl. Peser 13,9 g de chlorhydrate d'hydroxylamine (MW 69.49 g / mol) et dissoudre dans environ 50 ml d'eau distillée-eau déminéralisée (FD 2 O). Ajuster le pH à 7,0 à l'aide des pastilles d'hydroxyde de potassium ou une solution concentrée. Amener le volume final de 100 ml. La solution peut être conservée à température ambiante pendant jusqu'à 30 jours ou moins 4 ° C pendant jusqu'à 90 jours.
- Préparer 100 ml de chl....
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Discussion
La détection de phosphate acétyle dans ce dosage est tributaire d'une concentration suffisante de chlorhydrate d'hydroxylamine et de la concentration et l'acidité de la solution de chlorure ferrique. Altération du volume d'essai, il faudra reconsidérer ces deux composantes. Les réactions enzymatiques décrites ici ont été réalisées à 37 ° C à la résiliation d'hydroxylamine réalisée à 60 ° C pendant 5 minutes. Cette température élevée est essentielle pour permettre la conversion rapide du phosphate res.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la NSF # 0920274 prix et de la Caroline du Sud Experiment Station Project (SC-1700340) pour KSS. Ce document est n ° Contribution Technique 5929 de la Station de Clemson University Experiment.
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Matériaux
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Phosphate de Acétyl | Sigma-Aldrich | 01409 | Sel de lithium (97%) |
| Phosphate monosodique (déshydratent) | ThermoFisher | S381 | |
| Phosphate de sodium dibasique (anhydre) | ThermoFisher | S374 | |
| Le chlorure de magnésium (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Le chlorure ferrique (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| L'acide trichloracétique | ThermoFisher | A324 | |
| Chlorhydrate d'hydroxylamine | ThermoFisher | H330 | |
L'adénosine 5'-diphosphate sel de sodium | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| BIOMATE III Spectrophotomètre | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV / VIS spectrophotomètre |
Références
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A.
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