Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l'aide d'adénovirus dérivés Systems

Résumé

Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l'infection des cellules, ce qui améliore l'efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Ce protocole basé sur l'utilisation d'un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l'unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).

Résumé

Parvovirus des rongeurs (PV) comme chez le rat H-1PV et MVM, sont de petits icosaédrique, simple brin virus à ADN,. Leur génome comprend deux promoteurs P4 et P38 qui régulent l'expression des protéines non structurales (NS1 et NS2) et (capside VP1 et VP2), respectivement ^1. Ils attirent un grand intérêt en tant qu'agents anticancéreux pour leurs capacités oncolytiques et oncosuppressive tout en étant non-pathogènes pour l'homme ^2. NS1 est l'effecteur majeure du ³ cytotoxicité virale. Afin de renforcer davantage leurs activités naturelles antinéoplasiques, dérivés de ces vecteurs ont été générées par le remplacement du gène codant pour les protéines de la capside d'un transgène thérapeutique (par exemple un polypeptide cytotoxique, cytokine, une chimiokine tumeur du gène, suppresseur etc) ^4. Les parvovirus recombinants (recPVs) vecteur conserve les séquences NS1 / 2 de codage et les télomères du génome qui sont nécessaires PV pour l'amplification d'ADN viral et l'emballage. La production derecPVs se produit uniquement dans les cellules productrices (générale HEK293T), par co-transfection des cellules avec un second vecteur (pCMV-VP) exprimant le gène codant pour les protéines VP (fig. 1) ^4. Les vecteurs recPV générés de cette manière sont défectif pour la réplication. Bien que recPVs prouvé posséder une intensification des activités oncotoxic à l'égard des virus parentaux à partir de laquelle ils ont été générés, leur production reste un défi majeur et entrave fortement l'utilisation de ces agents dans la lutte contre le cancer des applications cliniques.

On a constaté que l'introduction d'un vecteur d'annonce-5 dérivée contenant l'E2a, E4 (orf6) et les gènes d'ARN VA (par exemple plasmide pXX6) dans HEK293T amélioré la production de recPVs de plus de 10 fois par rapport à d'autres protocoles en cours d'utilisation. Partant de ce constat, nous avons construit un roman Ad-VP-helper qui contient les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production recPVs ainsi que la parvovirnous VP gène unité ^5. L'utilisation d'Ad-VP-helper, permet la production de recom-PV en utilisant un protocole qui repose entièrement sur ​​les mesures infection virale (par opposition à la transfection de plasmide), ce qui rend possible l'utilisation de lignées cellulaires qui sont difficiles à transfecter (par exemple NB324K) ( Fig. 2). Nous présentons une méthode qui améliore considérablement la quantité de virus recombinant produit, réduisant à la fois le temps de production et les coûts, sans affecter la qualité du produit final ^5. En outre, la production à grande échelle de recPV (dans les cellules en suspension et les bioréacteurs) est maintenant envisageable.

Protocole

Notez que d'un laboratoire avec un niveau de biosécurité 2 est nécessaire pour la production de parvovirus recombinants (recPV).

Le protocole est subdivisé en deux parties principales. La première partie (production de recPV par transfection) est nécessaire pour produire la quantité minimale de recPVs qui sert d'inoculum dans la deuxième partie du protocole (production de recPVs via l'infection). Une fois une petite quantité de recPVs est produite, la première partie du protocole peut être omis, et le parvovirus recombinant peut être amplifié que par l'intermédiaire d'infection fournissant le gène codant pour les protéines de capside du p....

Discussion

Nous avons montré que la production recPV peut être renforcée par la présence d'éléments génomiques adénoviraux. Nous avons augmenté les rendements recPV de plus de 10 fois (0,3 à 5 TU / cellule) en fournissant des éléments génomique adénovirus par transfection et de plus de 100 fois co-infectant les cellules avec Ad-VP-helper en combinaison avec le recPV dans Comparaison de protocoles conventionnels. Le protocole décrit ici peut être encore optimisée en déterminant le moment le plus approprié pour la livraison des .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
DMEM	Sigma	D5796
MEM	Sigma	M4655
Le sérum fœtal bovin	AAP	A15-101
L-glutamine	Gibco	25030-024
Fugene	Roche	047097050001
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25300062
Benzonase nucléase	Sigma	E8263
Adeno-X rapide Titer Kit	Clontech	632250