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Flux de travail d'étiquetage protéase et catalysée par un acide Embauche

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DOI :

10.3791/3891

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20 février 2013

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

Dans cet article

Résumé

Stable workflows marquage isotopique qui emploient 18 O-eau enrichie (Leo-workflows) sont des outils polyvalents pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives. En workflows protéase assistée (paléo), 18 Atomes d'oxygène sont introduits par clivage protéolytique et carboxyle réactions d'échange d'oxygène médiée par les protéases. Dans la catalyse acide (Aleo) flux de travail, 18 Atomes d'oxygène sont introduits par échange d'oxygène carboxyle à faible pH.

Résumé

Les isotopes stables sont des outils essentiels pour la spectrométrie de masse biologique. Historiquement, 18 O-isotopes stables ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes catalytiques des enzymes protéolytiques 1-3. Avec l'avènement de la spectrométrie de masse à base de protéomique, l'incorporation enzymatique catalysée de 18 atomes d'oxygène de l'eau isotopiquement enrichi stable est devenue une méthode populaire de comparer quantitativement les niveaux d'expression de protéines (revue par Fenselau et Yao 4, Miyagi et Rao 5 et Ye et al. 6). 18 O-étiquetage constitue une alternative simple et peu coûteuse aux produits chimiques (par exemple iTRAQ, ICAT) et métaboliques (par exemple les techniques de marquage SILAC) 7. En fonction de la protéase utilisée, 18 O-étiquetage peut conduire à la prise en compte d'un maximum de deux atomes d'oxygène 18 dans le groupe carboxyle C-terminal du produit de clivage 3 8. Dans notre Paléo (p-rotease un e ssisted l Abeling mploying 18 O de l'eau enrichie) l'adaptation des enzymatique 18 O-étiquetage, nous avons utilisé 50% 18 O de l'eau enrichie pour produire des signatures isotopiques distinctes. En combinaison avec haute résolution assistée par matrice ionisation par désorption laser à temps de vol tandem spectrométrie de masse (MALDI-TOF/TOF MS / MS), les enveloppes des isotopes caractéristiques peuvent être utilisées pour identifier des produits de clivage avec un degré élevé de spécificité. Nous avons précédemment ont utilisé le paléo-méthodologie pour détecter et caractériser les protéases endogènes 9 et surveiller les réactions protéolytiques 10-11. Depuis Paléo code l'essence même de la réaction de clivage protéolytique, le dispositif expérimental est enri simple et biochimiqueétapes chment de produits de clivage peut être contournée. Le paléo-méthode peut facilement être étendue à (i) des expériences suivies dans le temps qui surveillent la dynamique des réactions de clivage protéolytique et (ii) l'analyse de la protéolyse dans des échantillons biologiques complexes qui représentent des conditions physiologiques. Paléo-TimeCourse expériences permettent d'identifier les étapes de traitement de limitation de vitesse et les intermédiaires de réaction à complexes réactions protéolytiques voie. En outre, la paléo-réaction nous permet d'identifier des enzymes protéolytiques telles que la trypsine sérine-protéase qui est capable de relier ses produits de clivage et de catalyser l'incorporation d'un 18 second joint atome. Ces «double étiquetage" enzymes peuvent être utilisées pour postdigestion 18 O-étiquetage, dans laquelle les peptides sont exclusivement marqués par la réaction d'échange d'oxygène carboxyle. Notre troisième stratégie s'étend étiquetage employant 18 O de l'eau enrichie au-delà des enzymes et utilise conditions de pH acide à introduire 18 Signe isotope O-stablepératures en peptides.

Protocole

Les présentées Léo-workflows permettent l'étiquetage des isotopes stables de protéines et de peptides synthétiques digère. Ces expériences suivies dans le temps (figure 1) sont applicables aux études comparatives et quantitatives protéomique ainsi que la recherche de protéase. Chaque flux de travail se compose de deux étapes expérimentales (figure 2): A) Le temps d'échantillonnage résolu de l'respectif 18 O-isotope stable codé réaction (protéase catalysée par clivage du peptide; protéase réaction catalysée par l'échange d'oxygène carboxyle; catalyse acide échange d'oxygène carboxyle réaction) et B) l'analyse par spectrométrie de masse et la représentation graphique de 18 O à la constitution cinétique.

Les expériences TimeCourse A.

I. paléo-TimeCourse: Protéase catalysée par l'étiquetage des clivages protéolytiques

  1. (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM)dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C.
  2. (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
  3. Selon la protéase d'intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l'agent d'alkylation. Utilisez PepClean colonnes C-18 spin (Thermo) pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges (Sartorius) pour échanger les tampons pour les échantillons de protéines.
  4. Redissoudre / peptides / protéines change dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
  5. Prélever un échantillon au temps zéro point avant l'ajout de la protéase: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul alpha cyano-4-hydroxycinnamiqueacide matrice (10 mg / ml dans l'acétonitrile 50%, TFA 0,1%). Place sur un échantillon Opti-TOF plaque 384 cible MALDI (AB SCIEX) et de laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu'à sec (environ 5 min).
  6. Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote va être mis à incuber avec la protéase d'intérêt (ECE-1: 75 nM; trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l'enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira d'échantillon témoin. La première aliquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-étiquetage et peut être utilisé pour l'identification des peptides et des protéines, la détection des activités protéolytique et le suivi des réactions de clivage protéolytique. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est induite par la protéase, par conséquent, ni étiquetage ni clivage est prévu pour cet échantillon.
  7. Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de les repérer comme described à l'étape 5 à intervalles de temps qui lui semble approprie. Les conditions de réaction décrites ci-dessus sont utilisés pour surveiller une réaction protéolytique pour un maximum de quatre jours (environ 24 places). Commencer l'échantillonnage toutes les 5 min jusqu'à 30 min, puis repérer toutes les 30 minutes jusqu'à 2 heures, puis toutes les heures jusqu'à 8 heures et 8 heures, jusqu'à ce que tous les 4 jours. Produits de clivage doit apparaître dans les premières 12 heures et le substrat doit être complètement hydrolysé après 24 heures. De longues périodes d'incubation de réaction permettent de définir les produits de réaction stables qui sont discrets à partir d'intermédiaires de réaction, qui sont ensuite transformés. Selon question de recherche et de données enzyme-substrat paires, les temps de repérage et de la température d'incubation doivent être modulée pour assurer l'échantillonnage de réaction optimale.
  8. Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage, la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B).

II. Paléo-TimeCourse: Postdigétiquetage estion des terminaisons protéolytiques

  1. (Facultatif) liaisons disulfure des protéines (10 uM) et des peptides (250 uM) sont réduites avec la TNT (concentration finale 2,5 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 (tous deux fraîchement préparé) par incubation pendant 30 min à 50 ° C.
  2. (Facultatif) cystéines libres sont alkylés avec iodoacétamide (concentration finale 10 mM) dans 25 mM de NH 4 HCO 3 par incubation pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
  3. En fonction de la protéase d'intérêt, protéines / peptides solutions doivent être nettoyés pour éliminer le tampon résiduel et l'agent d'alkylation. Utilisez les colonnes PepClean C-18 de spin pour le nettoyage des peptides et Vivaspin concentrateurs centrifuges pour l'échange de tampon protéique.
  4. Redissoudre / échanger les produits nettoyé jusqu'à peptides / protéines dans 20 ul de tampon de réaction de protéase (par exemple la trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) et digérer avec une protéase d'intérêt à terme (par exemple la trypsine: 0,04 nM, 37 ° C, 12 h).
  5. Produits de clivage de nettoyage avec des colonnes PepClean C-18 spin. Cette étape mettra fin aux activités de protéases résiduelles.
  6. Redissoudre / échanger les produits peptidiques nettoyé dans 20 pl de tampon réactionnel protéase (trypsine: 25 mM de NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenant 1:1 (v / v) final H 2 18 O.
  7. Prélever un échantillon au temps zéro point avant l'addition d'enzyme: Mélanger 0,5 ul du mélange réactionnel et 0,5 ul matrice de l'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans 50% d'acétonitrile, TFA à 0,1%). Tache d'échantillon sur une plaque cible MALDI et laisser les gouttelettes de solvant à température ambiante jusqu'à sec (environ 5 min).
  8. Diviser la solution de réaction en deux parties aliquotes. La première partie aliquote seront incubées avec la protéase d'intérêt (par exemple la trypsine: 0,04 nM) à la température ambiante ou la température recommandée pour l'enzyme particulière. La seconde partie aliquote seront incubés sans protéase et servira de contrôle. La premièrealiquote représente un échantillon standard pour la protéase catalysée par 18 O-postdigestion étiquetage et peuvent être utilisées pour la quantification de protéines et peptides. La seconde aliquote est utilisée pour montrer que 18 O-incorporation est catalysée par la protéase, par conséquent, aucun étiquetage n'est prévu pour cet échantillon.
  9. Suivez la réaction en retirant des aliquotes de réaction et de repérer les comme décrit dans l'étape 7.) À des intervalles de temps qui lui semble approprie. Par exemple, nous avons repéré un premier temps toutes les 5 min jusqu'à 30 min toutes les 15 min et ensuite pour surveiller la réaction de l'oxygène carboxyle échange catalysée par la trypsine.
  10. Après le point final de réaction est repéré temps ou entre les intervalles prolongés de repérage de la plaque cible MALDI est soumis à MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous (section B).

III. Aleo-TimeCourse: acide catalysée par l'étiquetage des groupes carboxyle

  1. Incuber peptides individuels (50 nm) avec 1:1 (v / v) 18 O-eau enrichie en til présence ou l'absence (témoin) de 0,1% (v / v) d'acide trifluoroacétique finale (volume total 30 pi).
  2. Les produits de réaction d'échantillon par jour pendant 48 jours par co-spotting une aliquote de 0,5 ul du mélange avec 0.5μl de matrice d'acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique (10 mg / ml dans l'acétonitrile 50%, TFA 0,1%) directement sur une cible MALDI plaque.
  3. Entre les intervalles de repérage et après avoir repéré le point de temps de réaction finale soumettre plaque cible MALDI pour MALDI-TOF/TOF MS / MS comme décrit ci-dessous à la section B.

B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Acquisition et analyse des données

  1. Les spectres de masse sont acquis sur une 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
  2. Avant l'analyse, l'instrument est étalonné avec un mélange de normes peptidiques (Mass Kit normes pour l'étalonnage d'AB SCIEX TOF / TOF instruments) avec une tolérance d'erreur maximale de mesure de masse de ± 50 ppm et un nombre minimal de six sommets de match.
  3. Spectres SM (gamme de masse400 - 4.000 m / z) sont acquises en triple en utilisant le mode ions positifs, avec une intensité laser réglable (3.400 - 3.800; taille de pas de 50) avec une plage d'intensité de crête de base acceptable de 2.000 - 45.000. Plans simples sont acquis pour les sous-spectres, avec 400 coups total / spectre, arrêtez conditions entreront en vigueur après 800 sous-spectres sont acquis (réussite ou échec) ou 400 sous-spectres critères d'acceptation de passe. Dans le cas d'échantillons à faible abondance ou en présence de complexes de milieux biologiques de l'extrémité inférieure de la plage de détection MS doit être porté à 800 m / z. En outre, il peut être nécessaire d'enlever le sel et d'autres composés qui interfèrent avec une étape de nettoyage échantillon comme décrit plus haut ou par séparation LC.
  4. MS fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir du logiciel 4000 Series Explorateur d'acquisition de données et importés dans notre propre système d'information de laboratoire, qui utilise le logiciel Distiller MASCOT (Matrix Science) pour le traitement spectrale et la détection de pointe. Enveloppes isotopiquessont déconvolué et 18 O à la constitution des ratios déterminés automatiquement par un algorithme similaire à celle décrite par Mason et al. 12 et adapté par notre groupe 9. Alternativement, des outils logiciels tels que ZoomQuant 13 et Viper 14, ainsi que logiciels commerciaux tels comme BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) et Mascot Distiller quantification Boîte à outils (Matrix Science) peut déconvoluer 18 O des données de type 15,16. 18 O à la constitution ratios sont exprimés en des contributions relatives des différentes espèces isotopiques peptidiques (par exemple, des peptides, contenant 16 O, 18 O 18 O ou 1 2) à l'ensemble de l'enveloppe isotopique.
  5. Pour chaque expérience TimeCourse, les masses moléculaires ([M + H] +) pour toutes les espèces de peptides détectés sont extraites à partir des fichiers de données associés MS et les valeurs mis en cellule à une largeur de 100 ppm en masse.
  6. Au moins trois [M + H] + sont configurés pour être tenus de remplir un bac. Dans le cas de substrats connus, la liste bin filtré est comparé à une liste de produits de clivage protéolytique prédite à partir de la séquence du peptide substrat en utilisant l'outil ExPASy FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) et un 200 ppm en masse acceptation tolérance aux erreurs.
  7. Spectres MS / MS sont acquis pour toutes les valeurs de masse de produits de coupure par l'outil prédites et des valeurs FindPept bin qui ont 18 O-incorporations qui leur sont associés. MS / MS sont acquises sur le 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer dans le réflecteur d'ions 1kV mode positif, avec une intensité laser fixe de 4200 et CID-gaz en mode hors tension. 50 tirs sont acquis selon un schéma randomisé par sous-spectres pour un total de 40 sous-spectres par endroit (ce qui donne un total de 2.000 coups / place).
  8. MS / MS des fichiers de données (. T2D fichiers) sont exportés à partir de l'Explo 4000 Seriesrer le logiciel d'acquisition de données et importés dans notre propre système d'information de laboratoire, les pics sont détectés et MS / MS listes de pics sont associés avec les données correspondantes MS regroupées par casiers.
  9. Pour l'identification des peptides, MS / MS listes de pointe lancer une recherche dans la base de données SwissProt en utilisant le moteur de recherche MASCOT avec les paramètres de recherche suivants: pas de spécificité de l'enzyme, 150 ppm ion précurseur et 0,2 Da tolérances de fragments d'ions de masse.
  10. Identifications peptidiques peuvent en outre être validée à l'aide du logiciel Data Explorer (AB SCIEX) en confirmant les 18 caractéristiques O-incorporation tendances entre ions fragments série Y telle que décrite par Shevchenko et al. 18.

C. Préparation du Temps spectrale et 18 O à la constitution Parcelles

Parcelles de temps spectrales: MS fichiers de données (. T2D fichiers) pour chaque point de temps de réaction sont exportés à partir du logiciel Data Explorer en mode ASCII des fichiers en utilisant unmacro importés dans une analyse de données et un logiciel graphique (par exemple, en OriginLab origine) et affichés sous forme de tracés cascade (figure 3).

18 O à la constitution des parcelles: Pour chaque produit clivage du peptide mis en cellule, les contributions relatives des différentes espèces isotopiques (16 O peptidiques, 18 ou 18 O 1 O 2) sont extraits dans tous les points dans le temps de réaction et en fonction du temps (figure 4).

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Résultats

Nous avons utilisé le flux de travail paléo-TimeCourse de surveiller dynamiquement l'incorporation de 18 S-isotopes stables dans les produits de clivage de peptides générés par des enzymes protéolytiques. L'approche présentée est un outil polyvalent pour étudier les voies relativement traitement protéolytique de substrat différent et les combinaisons de protéase. En échantillonnant les réactions protéolytiques à plusieurs reprises au cours de la réaction, l'expérience paléo-TimeCourse fournit des ...

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Discussion

En combinant l'étiquetage des isotopes stables et la spectrométrie de masse à haute résolution dans un temps résolu manière, la méthode paléo-TimeCourse permet une analyse dynamique de la production de produits peptidiques. Le test peut être utilisé pour générer des peptides marqués par des isotopes stables pour les études protéomiques quantitatives et qualitatives pour évaluer la cinétique de peptides qui protéotypiques sont générés. En outre, le Paléo-TimeCourse est conçu pour évaluer voies protéolytiques dans des...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du matériau Entreprise Numéro de catalogue
Colonnes PepClean C-18 Spin Thermo 89870
Opti-TOF plaque 384 cible MALDI AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF / TOF AB SCIEX

Tableau 1. Matériaux

Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue
Alpha cyano-4-hydroxycinnamique Sigma Aldrich 70990-1G-F
Albumine de sérum bovin (BSA) Sigma Aldrich A3294-10G
Dithiothréitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacétamide (IAM) Sigma Aldrich 1149-5G
L'endothéline-1 converting enzyme (CEE-1) R & D Systems 1784-ZN
Or la trypsine Promega V5280
Eau-18 O, 97% atomique 18 O Sigma Aldrich 329878-1G
L'acide trifluoroacétique (TFA) Thermo 28904
Kit de masse pour l'étalonnage des normes AB SCIEX TOF / TOF instruments AB SCIEX 4333604

Tableau 2. Réactifs

Références

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Mots-clés

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