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Article de méthode

Imagerie par bioluminescence de l'activité de la NADPH oxydase dans différents modèles animaux

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DOI :

10.3791/3925

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22 octobre 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Departments of Medicine and Immunology, Roswell Park Cancer Institute, 3Department of Medicine, University at Buffalo School of Medicine

Dans cet article

Résumé

NADPH oxydase est la principale source d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les phagocytes. En raison de la nature éphémère de ROS, il est difficile de mesurer et de surveiller les niveaux de ROS chez les animaux vivants. Une méthode minimalement invasive pour la quantification de série de ROS chez les souris vivant est décrite.

Résumé

NADPH oxydase est une enzyme essentielle qui assure la médiation défense de l'hôte antibactérienne et antifongique. En plus de son rôle dans la défense de l'hôte antimicrobienne, la NADPH oxydase a les fonctions essentielles de signalisation qui modulent la réponse inflammatoire 1. Ainsi, le développement d'une méthode de mesure en "temps réel" la cinétique de la NADPH oxydase dérivée de génération de ROS est prévu pour être un outil de recherche précieux pour comprendre les mécanismes pertinents de défense de l'hôte, de l'inflammation et des blessures.

Granulomatose chronique (CGD) est une maladie héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections graves et de l'inflammation excessive. L'activation de la NADPH oxydase phagocytaire nécessite la translocation de ses sous-unités cytosoliques (p47 phox, p67 phox, p40 phox et) et Rac à un flavocytochrome liée à la membrane (composé d'un phox gp91 et p22 phox hétérodimère). Pertedes mutations de fonction dans l'un de ces composants résultat oxydase NADPH en DMC. Similaires aux patients atteints de CGD, gp91 phox souris déficientes en p47 phox et les souris déficientes ont une activité défectueuse NADPH oxydase phagocytaire et l'hôte altération de la défense 13, 14. En plus des phagocytes, qui contiennent les composants de la NADPH oxydase décrites ci-dessus, une variété de types de cellules expriment différentes isoformes de la NADPH oxydase.

Nous décrivons ici une méthode pour quantifier la production de ROS chez les souris vivantes et de délimiter la contribution de la NADPH oxydase à la génération de ROS dans les modèles d'inflammation et des blessures. Cette méthode est basée sur la réaction de ROS L-012 (un analogue de luminol) pour émettre de la luminescence qui est enregistrée par un dispositif à couplage de charge (CCD). Dans la description originale de la sonde L-012, L-012-dépendante chimioluminescence a été complètement abolie par la superoxyde dismutase, ce qui indique que la principale ROS détecté dans cette réaction était superanion oxyde 15. Des études ultérieures ont montré que la L-012 peut détecter les autres radicaux libres, y compris les espèces réactives de l'azote 16, 17. Kielland et al. 17 ont montré que l'application topique d'acétate de phorbol myristate, un puissant activateur de la NADPH oxydase, mené en NADPH oxydase dépendante de la production de ROS qui pourrait être détectée chez les souris en utilisant la sonde luminescente L-012. Dans ce modèle, ils ont montré que la luminescence L-012-dépendante a été aboli en p47 phox souris déficientes.

Nous avons comparé la génération de ROS dans les souris de type sauvage et NADPH oxydase déficiente en p47 phox-/ - ont 2 dans les trois modèles suivants: 1) l'administration intratrachéale de zymosan, une cellule pro-inflammatoire fongique mur produit dérivé qui permet d'activer la NADPH oxydase; 2) ligature caecale et ponction (CLP), un modèle de sepsis intra-abdominal avec une inflammation pulmonaire aiguë secondaire et des blessures, et 3) le tétrachlorure de carbone par voie orale(CCl 4), un modèle de lésion hépatique ROS-dépendante. Ces modèles ont été spécifiquement choisis pour évaluer la NADPH oxydase dépendante de la production de ROS dans le cadre de l'inflammation non infectieuse, la septicémie polymicrobienne, et la toxine induite par une lésion d'organe, respectivement. En comparant la bioluminescence chez la souris de type sauvage de p47 phox-/ - ont nous permet de définir la contribution spécifique de ROS générés par p47 phox de la NADPH oxydase contenant au signal bioluminescent dans ces modèles.

Résultats de l'imagerie de bioluminescence qui ont démontré une augmentation des niveaux de ROS dans les souris de type sauvage par rapport à p47 phox-/ - ont indiqué que la NADPH oxydase est la principale source de production de ROS en réponse à des stimuli inflammatoires. Cette méthode offre une approche minimalement invasive pour "temps réel" suivi de la production de ROS au cours de l'inflammation in vivo.

Protocole

1. Modèles animaux

  1. Souris: Utilisez p47 phox-/ - souris et d'âge et le sexe assortie souris C57BL6/DBA. Obtenir l'approbation pour des expériences de protection des animaux et du Comité institutionnel utilisation.
  2. Anesthésie: Utiliser un système d'administration continue isoflurane pour induire une anesthésie. Le système de vaporisation (VetEquip) est rempli avec de l'isoflurane (2-3%). Assurez-vous que les souris sont pleinement anesthésiés par l'observation de la respiration, le mouvement et réflexe cornéen en réponse à des stimuli externes.
  3. Les interventions chirurgicales: Frotter la zone chirurgicale (de table) avec de l'éthanol à 70%. Porter des gants stériles et une blouse chirurgicale propre et un masque. Préparer les souris par clipsage les cheveux et appliquer la bétadine en alternance avec 70% d'éthanol à l'endroit où l'incision sera faite. Effectuer une intervention chirurgicale sur une surface stérile et utiliser des instruments stériles. Souris Moniteur post-opératoire jusqu'à ce éveillé et se déplacer librement.
  4. Intratrachéale administration zymosan
    1. Administrer une anesthésiecomme décrit dans l'1,2.
    2. Désinfecter la zone chirurgicale (cou) avec de la bétadine et de l'éthanol à 70% et exposer la trachée par une dissection chirurgicale.
    3. Pierce trachée avec une aiguille de calibre 27 et d'injecter zymosan (St. Louis, MO) à une dose de 1 mg / g en utilisant un mg 0,5 / ul de solution (volume total de 50 pl pour une souris de 25 g) dissous dans du PBS stérile.
    4. Fermer cou souris enroulé avec des sutures en soie 5-0 stériles dans des conditions aseptiques.
    5. L'image après 4 h et 24 h.
  5. Ligature caecale et ponction
    1. Administrer une anesthésie comme décrit en 1.2.
    2. Couper les poils dans la zone chirurgicale (abdomen) et désinfecter avec de la bétadine et de l'éthanol à 70%.
    3. Effectuer une laparotomie médiane et identifier le caecum.
    4. Ligaturer la partie distale 50% du caecum exposée avec une suture de soie 4-0 et le caecum perforation distale de la ligature avec un passage d'une aiguille de calibre 21.
    5. Fermer l'incision avec des sutures en soie 4-0 stériles.
    6. Image après 4 h et24 heures.
  6. Oral tétrachlorure de carbone (CCl 4) l'administration
    1. Administrer une anesthésie comme décrit en 1.2.
    2. Administrer CCl 4 (2 mg / g, St. Louis, MO) dissous dans l'huile de maïs par gavage oral. La procédure de CCl4 administration doit être effectuée dans une zone désignée conformément à l'IBC / EHS politiques.
    3. L'image après 4 h et 24 h.

2. L'acquisition d'une image Bioluminescent

  1. Initialiser le IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) système d'imagerie, réglé sur le mode de luminescence, et attendez que le dispositif à couplage de charge (CCD) pour verrouiller la température.
  2. Sélectionnez la durée d'exposition, binning (moyenne) et F / Stop (8) paramètres.
  3. Souris placer en position couchée dans la chambre d'imagerie sur une platine chauffante pour maintenir la température normale du corps. Administrer une anesthésie selon la coiffe par 1,2 alors que les souris sont dans la chambre d'imagerie IVIS.
  4. Administrer L-012 (20 pg / g) dissous dans du PBS stérile (10 pg / pl) par voie intraveineuse via rétro-orbitaire d'injection à chaque moment choisi pour l'imagerie.
  5. Capturez des images en commençant à 2 min après injection de L-012. Nous utilisons généralement une exposition de 40 sec.

3. Analyse des données en utilisant la région d'intérêt

  1. Analyser les données en utilisant un logiciel image vivante v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
  2. Ouvrez une image et sélectionner la mesure de la Région d'outils d'intérêt.
  3. Sélectionnez la région de la forme et de la taille d'intérêts sur la poitrine et / ou l'abdomen après superposition d'une image pseudo-couleur numérique (représentant la détection de photons) sur une image photographique de la souris.
  4. Quantifier l'intensité du signal (flux de photons) de la région d'intérêt.

4. Statistiques

  1. Utilisez statistique progiciel d'analyse à effectuer deux ANOVA avec correction de Bonferroni post-tests à des moments différents.
TLE "> Les résultats représentatifs 5.

Zymosan est un produit pro-inflammatoire des cellules de levure mur et un puissant activateur de la NADPH oxydase 3. Nous avons montré précédemment que zymosan intratrachéale induit une inflammation des poumons plus robuste neutrophiles et la production de cytokines pro-inflammatoires dans p47 phox-/ - par rapport au type sauvage souris 1. Ici, notre objectif était de comparer la génération de ROS dans les poumons de type sauvage et p47 phox-/ - souris à la suite défi zymosan. A 4 heures après administration intratrachéale zymosan, nous avons observé une augmentation significative de l'émission de photons sur la poitrine chez les souris de type sauvage par rapport au scénario de référence, ainsi qu'une augmentation de l'émission de photons dans de type sauvage par rapport à p47 phox-/ - ont à 4 h et 24 h. En revanche, les signaux de bioluminescence en p47 phox-/ - souris sont restées au niveau de référence à 4 h après le traitement zymosan (Fig.1 AB). Ainsi, la NADPH oxydase semble be la principale source de production de ROS dans les poumons après l'administration zymosan.

Ensuite, nous avons évalué la production de ROS dans le modèle de septicémie CLP-induite. Le sepsis est un syndrome potentiellement mortelle associée à des organes cibles des blessures, y compris une lésion pulmonaire aiguë (ALI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) 4, 5. ROS médiée par des blessures a été considérée comme un facteur important dans induite par le sepsis dysfonction d'organes multiples. Nous avons constaté que les ROS ont été considérablement augmenté au cours de la poitrine (4 h) et sur l'abdomen (24 h) à la suite CLP souris de type sauvage par rapport à la valeur initiale. Cependant, les niveaux de ROS en p47 phox-/ - ont étaient similaires aux niveaux de référence à des points temporels deux (Fig.2 AC). Ces résultats montrent que la génération de ROS dans le modèle CLP-induite septicémie souris est NADPH oxydase dépendante.

Enfin, nous avons utilisé l'imagerie par bioluminescence pour détecter la production de ROS dans un CCl 4-induite mode de lésions hépatiquesl. CCl 4 provoque une nécrose hépatocellulaire, et a été utilisé pour modéliser à la fois une atteinte hépatique aiguë et 6 fibrose hépatique. Contrairement aux modèles décrits précédemment de l'inflammation et des blessures, nous avons constaté que la production de ROS dans l'abdomen était modeste (environ 35%) a augmenté par rapport au départ de p47 phox-/ - souris à 4 heures après l'administration de CCl 4. Cependant, l'ampleur de CCl 4 induite par les ROS génération était significativement plus élevée chez les souris de type sauvage que dans p47 phox-/ - ont (Fig.3 AB). Ces données suggèrent que l'p47 phox génération contenant du NADPH oxydase dépendante et indépendante de ROS se produire dans CCl atteinte hépatique aiguë 4-induite.

figure-protocol-1
Figure 1. Production de ROS dans les poumons après le traitement zymosan. A) représentant bioluminescenCE imagerie de la production de ROS. Notez qu'en plus de la poitrine, la luminescence est détectable sur l'abdomen à la fois de type sauvage et p47 phox-/ - souris et la luminescence abdominale est inchangée par le traitement zymosan. B) comptages de photons de la poitrine de type sauvage et p47 phox-/ - souris après une seule injection intra-trachéale (IT) du zymosan. Imagerie par bioluminescence a été initialement réalisée, 4 h et 24 h. Émission de lumière à partir de la région d'intérêt sur la poitrine a été identifié en utilisant la pseudo-couleur indiquée échelle. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, n = 6-9 par groupe, * = p <0,05. Cliquez ici pour agrandir la figure .

figure-protocol-2
Figure 2. Détection de ROS suite CLP. Une imagerie) représentant la bioluminescence de la production de ROS, BComptages de photons) de la poitrine, et C) comptages de photons de l'abdomen de type sauvage et p47 phox-/ - ont au départ, 4 h, et ​​24 h après CLP. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type, n = 4-5 par groupe, * = p <0,05. Cliquez ici pour agrandir la figure .

figure-protocol-3
Figure 3. Production de ROS dans l'abdomen après CCl 4-lésions hépatiques induites. Une imagerie) bioluminescence Représentant de la production de ROS et B) comptages de photons de l'abdomen de type sauvage et p47 phox-/ - ont au départ, 4 heures et 24 heures après l'administration orale CCl 4 traitements. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SE;. N = 4-5 par groupe, * = p <0,05 Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

"En temps réel" la mesure des espèces réactives de l'oxygène (ROS) chez les animaux vivants peuvent être obtenus en utilisant des sondes fluorescentes et chimiluminescence. Tandis que les sondes fluorescentes comportant souffrent de faiblesse de signal sur bruit 12, la technique d'imagerie décrit est plus sensible à la détection de l'émission de lumière à la suite d'une réaction chimique de ROS avec le substrat à base de luminol L-012. Comme toutes les techniques d'imagerie biolu...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail a été financé par le NIH RO1 AI079253 et le ministère des Anciens Combattants.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
L-012 Wako Chemicals USA, Inc 120-04891
Zymosan Sigma, St. Louis, MO Z4250
le tétrachlorure de carbone Sigma, St. Louis, MO 289116

Références

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Réimpressions et autorisations

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