Cet article décrit la procédure de synthèse d'une membrane Nafion modifié hydrophobiquement enzyme immobilisation et comment immobiliser des protéines et / ou des enzymes au sein de la membrane et de tester leur activité spécifique.
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Article de méthode
Hydrophobe sel modifié Nafion pour l'immobilisation d'enzymes et de stabilisation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Au cours de la dernière décennie, il a été une richesse d'application pour les enzymes immobilisées et stabilisé, y compris la biocatalyse, les biocapteurs et les cellules de biocarburants. 1-3 Dans la plupart des applications bioélectrochimiques, des enzymes ou des organites sont immobilisés sur une surface de l'électrode avec l'utilisation d'un certain type de matrice de polymère. Cet échafaudage polymère doit maintenir les enzymes stable et permettre la diffusion facile des molécules et des ions dans et hors de la matrice. La plupart des polymères utilisés pour ce type d'immobilisation sont basées sur des polyamines ou des polyols - polymères qui imitent l'environnement naturel des enzymes qu'ils encapsuler et de stabiliser l'enzyme par le biais d'hydrogène ou une liaison ionique. Une autre méthode pour stabiliser les enzymes implique l'utilisation de micelles, qui contiennent des régions hydrophobes qui peuvent encapsuler et de stabiliser les enzymes. 4,5 En particulier, le groupe a développé Minteer un polymère micellaire basée sur Nafion disponible dans le commerce. 6,7 Nafionlui-même est un polymère micellaire qui permet la diffusion de canal assistée de protons et d'autres cations de petite taille, mais les micelles et les canaux sont extrêmement faibles et le polymère est très acide en raison de chaînes latérales d'acides sulfoniques, ce qui est défavorable pour l'immobilisation d'enzymes. Cependant, lorsque le Nafion est mélangé avec un excès de sels d'ammonium d'alkyle hydrophobes tels que le bromure de tétrabutylammonium (TBAB), les cations ammonium quaternaire remplacer les protons et les contre-ions deviennent des groupes sulfonate sur les chaînes latérales polymères (figure 1). Il en résulte dans les grandes micelles et les canaux dans le polymère qui permettent la diffusion de substrats de grande taille et des ions qui sont nécessaires pour la fonction enzymatique de type nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Cette modification de Nafion polymère a été utilisé pour immobiliser de nombreux différents types d'enzymes ainsi que des mitochondries pour une utilisation dans des biocapteurs et les cellules de biocarburants. 8-12 Cet article décrit une nouvelle procédure pour la fabrication de ce microellar membrane polymère immobilisation d'enzymes qui peuvent stabiliser les enzymes. La synthèse de la membrane immobilisation d'enzymes micellaire, la procédure d'immobilisation d'enzymes dans la membrane, et les essais pour étudier l'activité enzymatique spécifique de l'enzyme immobilisée sont détaillées ci-dessous.
Protocole
1. Modification de Nafion avec sels d'ammonium quaternaire
- Agiter une bouteille de suspension Nafion 5% p / v vigoureusement pendant environ. 30 secondes pour s'assurer que le Nafion est suspendu de manière uniforme dans la solution.
- Introduire à la pipette sur 2 mL de la Nafion désormais remis en suspension dans un flacon en verre (volume du flacon peut contenir de 2,5 ml à 10 ml).
- Mesurer un excès de 3 fois molaire (par rapport à des groupes acide sulfonique sur le polymère Nafion) du sel de bromure d'ammonium alkyle (masses appropriées sont indiquées dans le tableau 1) et l'ajouter à la fiole contenan....
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Discussion
Dans le mode opératoire décrit, les sels d'ammonium tétra-alkyle sont utilisés pour modifier le Nafion commerciale pour créer des polymères micellaires qui peuvent être utilisés pour immobiliser et stabiliser les enzymes. Les tests décrits dans le spectacle procédure que le polymère peut être utilisé pour immobiliser une grande variété d'enzymes avec une forte rétention de l'activité. Si l'enzyme d'intérêt a une activité très faible ou qui est impur, une concentration plus élevée peut être nécessaire.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier l'Office of Naval Research, United Soybean Board, et la National Science Foundation pour le financement.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Le numéro de catalogue | |
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| Sels de bromure de Tetra alkylammonium | Sigma-Aldrich | n / a | |
| L'alcool déshydrogénase | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) | Simga-Aldrich | N7004 | |
| Pyrophosphate de sodium | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| Méthosulfate de phénazine (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-dichloroindophénol (DCIP) | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| La glucose oxydase | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| L'acide 4-hydroxybenzoïque | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| L'azoture de sodium | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Peroxydase | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-aminoantipyrine | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| UV / Vis Spectrophotomètre | Thermo | Evolution 260 Bio ou Spectronic Genesys 20 | |
| Vortex Genie | |||
| Balance analytique |
Références
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrol....
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Réimpressions et autorisations
