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Summary

Cet article décrit la procédure de synthèse d'une membrane Nafion modifié hydrophobiquement enzyme immobilisation et comment immobiliser des protéines et / ou des enzymes au sein de la membrane et de tester leur activité spécifique.

Abstract

Au cours de la dernière décennie, il a été une richesse d'application pour les enzymes immobilisées et stabilisé, y compris la biocatalyse, les biocapteurs et les cellules de biocarburants. ^1-3 Dans la plupart des applications bioélectrochimiques, des enzymes ou des organites sont immobilisés sur une surface de l'électrode avec l'utilisation d'un certain type de matrice de polymère. Cet échafaudage polymère doit maintenir les enzymes stable et permettre la diffusion facile des molécules et des ions dans et hors de la matrice. La plupart des polymères utilisés pour ce type d'immobilisation sont basées sur des polyamines ou des polyols – polymères qui imitent l'environnement naturel des enzymes qu'ils encapsuler et de stabiliser l'enzyme par le biais d'hydrogène ou une liaison ionique. Une autre méthode pour stabiliser les enzymes implique l'utilisation de micelles, qui contiennent des régions hydrophobes qui peuvent encapsuler et de stabiliser les enzymes. ^4,5 En particulier, le groupe a développé Minteer un polymère micellaire basée sur Nafion disponible dans le commerce. ^6,7 Nafionlui-même est un polymère micellaire qui permet la diffusion de canal assistée de protons et d'autres cations de petite taille, mais les micelles et les canaux sont extrêmement faibles et le polymère est très acide en raison de chaînes latérales d'acides sulfoniques, ce qui est défavorable pour l'immobilisation d'enzymes. Cependant, lorsque le Nafion est mélangé avec un excès de sels d'ammonium d'alkyle hydrophobes tels que le bromure de tétrabutylammonium (TBAB), les cations ammonium quaternaire remplacer les protons et les contre-ions deviennent des groupes sulfonate sur les chaînes latérales polymères (figure 1). Il en résulte dans les grandes micelles et les canaux dans le polymère qui permettent la diffusion de substrats de grande taille et des ions qui sont nécessaires pour la fonction enzymatique de type nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Cette modification de Nafion polymère a été utilisé pour immobiliser de nombreux différents types d'enzymes ainsi que des mitochondries pour une utilisation dans des biocapteurs et les cellules de biocarburants. ^8-12 Cet article décrit une nouvelle procédure pour la fabrication de ce microellar membrane polymère immobilisation d'enzymes qui peuvent stabiliser les enzymes. La synthèse de la membrane immobilisation d'enzymes micellaire, la procédure d'immobilisation d'enzymes dans la membrane, et les essais pour étudier l'activité enzymatique spécifique de l'enzyme immobilisée sont détaillées ci-dessous.

Protocol

1. Modification de Nafion avec sels d'ammonium quaternaire

1. Agiter une bouteille de suspension Nafion 5% p / v vigoureusement pendant environ. 30 secondes pour s'assurer que le Nafion est suspendu de manière uniforme dans la solution.
2. Introduire à la pipette sur 2 mL de la Nafion désormais remis en suspension dans un flacon en verre (volume du flacon peut contenir de 2,5 ml à 10 ml).
3. Mesurer un excès de 3 fois molaire (par rapport à des groupes acide sulfonique sur le polymère Nafion) du sel de bromure d'ammonium alkyle (masses appropriées sont indiquées dans le tableau 1) et l'ajouter à la fiole contenant le 2 mL de Nafion.
4. Vortex du flacon à 1500 rpm pendant 10-15 minutes.
5. Verser la solution visqueuse dans un bac en plastique de pesage qui mesure environ. 3 x 3 po, et d'utiliser une pipette pour transférer toute solution résiduelle de la fiole sur le plateau de pesée.
6. Permettre aux solvants pour évaporer du bateau poids, en laissant un jaune / brun, un film transparent sur ​​le fond du plateau de pesage (Figure 2). Le taux d'évaporation des solvants devrait être telle qu'elle prend plus de 6 heures pour tout le solvant s'évapore. Si le solvant s'évapore trop vite, un matériau blanc croustillant formeront, au lieu d'un film transparent qui indique que la structure micellaire du polymère a été détruit, et vous devez redémarrer la procédure. Si l'évaporation du solvant est trop lent, un déshumidificateur peut être nécessaire, parce que trop lente de l'évaporation conduit généralement à un collant, un gel orange et vous devez redémarrer la procédure. Plages de température typiques pour l'évaporation du solvant sont de 20 à 37 ° C. Les conditions réelles pour le séchage sont fonction de l'humidité relative et la température dans la chambre, mais il est important que le séchage est lent pour maintenir la structure des micelles, mais pas trop lent pour permettre la formation de gel.
7. Remplissez la pesée bateau avec 18M Qcm de l'eau déminéralisée (10-20 ml d'eau), la couverture, et laisser tremper pendant 12-24 heures pour éliminer l'excès de sels d'alkyl ammonium bromure et HBr.
<li> Versez (ou une pipette) à l'eau et rincer 3 fois avec DI assez d'eau pour remplir le bac à chaque fois. Veillez à ne pas perdre de la pellicule de polymère au cours de cette étape.
8. Laissez le plateau de pesée de s'asseoir à découvert jusqu'à ce que le polymère est complètement sec À ce stade, le polymère doit être un film clair et un peu cassant en plastique. Encore une fois, si l'air est très humide, un déshumidificateur peut être nécessaire pour compléter l'évaporation dans les meilleurs délais.
9. Avec une spatule, retirez délicatement le film séché à partir du bac de pesage et de le transférer dans un flacon en verre propre.
10. Ajouter 2 ml d'éthanol et 3 perles en céramique de mélange, et le vortex pendant 4 heures ou jusqu'à ce que le film de polymère est complètement remis en suspension.

2. Immobilisation d'enzymes dans TBAB-mise à jour pour le Nafion tests d'activité

1. Pour une enzyme sec, peser 1-10 mg de l'enzyme dans un microtube de 1,5 mL, et ajouter 1 mL de 100 mM de tampon phosphate pH 7 pour créer un 1-10 mg / ml solution enzymatique. For une enzyme qui est en solution, utiliser un acide bicinchoninique (BCA) test ¹³ pour déterminer la quantité de protéines, et ajouter une quantité appropriée de tampon phosphate 100 mM pour amener la concentration de protéines à 1-10 mg / ml. 1-10 ml mg / correspond typiquement à 1-50 nanomoles / mL.
2. À 120 pi de 1 mg / ml solution enzymatique, ajouter 60 ul de la solution de Nafion d'ammonium modifié alkyle, et vortex pendant 10 secondes. (Ce mélange peut être étendu à un grand nombre de répétitions. Garder le rapport solution enzymatique à polymère à 2:1.)
3. Introduire à la pipette 60 pi de la solution enzymatique / polymère dans le bas de 3 séparées de 1 cm ² cuves, et laisser sécher pendant la nuit.

3. Le dosage de l'enzyme immobilisée déshydrogénase NAD-dépendante

1. Pour la cuvette, ajoutez 1,3 ml de 50 mM de pyrophosphate de sodium (pH 8,8), 1,5 ml de 15 mM NAD (fraîchement préparée), et 0,1 mL d'eau.
2. Placer la cuvette dans un spectrophotomètre UV / VIS (c.-à-Evolut ThermoScientificion 260 Bio et Thermo Spectronic Genesys 20) fixée à une longueur d'onde de 340 nm.
3. Zéro du spectromètre, puis ajouter 0,1 ml d'éthanol. Mélanger les réactifs par pipetage doucement la solution de haut en bas 5 fois. Pour un blanc, utiliser 0,1 ml d'eau supplémentaire au lieu de la 0,1 mL d'éthanol.
4. Enregistrez l'absorbance à 340 nm à 5 minutes après les réactifs ont été ajoutés à la cuvette et 20 minutes après. Tracer les deux points de données pour obtenir une pente qui peut être utilisé pour le calcul d'activité.

4. Dosage de la immobilisées PQQ-dépendants déshydrogénases

1. Pour la cuvette, ajoutez 1,5 ml de phosphate de sodium (pH 7,3) et 200 ul de 600 uM PMS.
2. Placer la cuvette dans un spectrophotomètre UV / Vis réglé à une longueur d'onde de 600 nm, puis zéro le spectromètre.
3. Ajouter 100 ul de 700 DCIP ul et 200 ul du substrat d'intérêt (l'éthanol, l'acétaldéhyde, le glycérol, le glucose, ou de glycéraldéhyde), et mélanger les réactifs par un léger pipetage la solutions de haut en bas 5 fois. Pour un blanc, utiliser 200 pi d'eau au lieu du substrat d'intérêt.
4. Enregistrez l'absorbance à 600 nm à 5 minutes après les réactifs ont été ajoutés à la cuvette et 20 minutes après.

5. Dosage de la glucose-oxydase immobilisée

1. Ensemble de la cuvette, ajouter 2,0 ml d'une solution contenant 0,2 M d'acide p-hydroxybenzoïque, l'azoture de sodium 0,02% (p / v), la peroxydase 128 U, 0,3 mM de 4-aminoantipyrine, une M de phosphate de potassium, et 50 mM de glucose. Mélanger la solution par aspiration et refoulement 5 fois.
2. Placer la cuvette dans un ensemble spectrophotomètre UV / Vis à une longueur d'onde de 510 nm.
3. Enregistrez l'absorbance à 510 nm à 5 minutes après les réactifs ont été ajoutés à la cuvette et encore moins 20 minutes après.

6. Les résultats représentatifs

La structure micellaire du polymère Nafion modifié peut être perturbé par le séchage du sel d'origine / polymère co-moulé film trop fast. La figure 2 montre un mélange sel / polymère qui a été séché correctement résultant d'une manière transparente, brun léger film. Un film qui sèche trop rapide peut entraîner opaques, de flocons de polymère blanc en raison du fait que le processus de séchage peut détruire la structure micellaire.

Une fois que le Nafion polymère modifié et de l'enzyme ont été mélangés et co-coulée sur le fond d'une cuvette, les dosages d'activité enzymatique peut être utilisé pour évaluer la stabilité de l'enzyme dans le film polymère. Tableaux 2-4 montrent les résultats d'analyse de deux enzymes déshydrogénases et la glucose oxydase immobilisée dans divers films de Nafion modifiés, respectivement. Notez la plus grande activité des enzymes qui sont immobilisées vs les enzymes en solution tampon, montrant que les polymères Nafion modifiés peuvent en fait accroître l'activité de certaines enzymes (appelé suractivité). D'autres enzymes ont des limitations de transport qui réduisent leur activité spécifique lorsque les immobiliser dans le polymère (cellulases et amylases, c.-à-dont les substrats sont assez grandes macromolécules).

<td> 40,89 mg / ml

Sel d'ammonium quaternaire utilisé	3 fois plus
T3A (bromure de tétrapropylammonium)	32,37 mg / ml
TBAB (bromure de tétrabutylammonium)	39,19 mg / ml
TPAB (bromure de tétrapentylammonium)	46,01 mg / ml
TEHA (bromure de triethylhexylammonium)	32,37 mg / ml
TMHA (bromure de trimethylhexylammonium)	27,25 mg / ml
TMOA (bromure de trimethyloctylammonium)	30,66 mg / ml
TMDA (bromure de trimethyldecylammonium)	34,07 mg / ml
TMDDA (bromure de trimethyldodecylammonium)	37,48 mg / ml
TMTDA (bromure de trimethyltetradecylammonium)
TMHDA (bromure de triméthylhexadécylammonium)	44,31 mg / ml
TMODA (bromure de trimethyloctadecylammonium)	47,71 mg / ml

Tableau 1. Montants de sels d'ammonium tétra-alkyle à utiliser pour le Nafion modification de polymères.

Type de Nafion	L'activité enzymatique (U / g)
Tampon (aucun polymère)	16,63 ± 8,11
Nafion (un-mod.)	9,25 ± 2,21
TMTDA	3,23 ± 2,92
TBAB	3,93 ± 3,33
TMDDA	4,19 ± 1,04
TMOA	3,51 ± 1,11
TMDA	8,00 ± 4,53
TMHA	1,68 ± 1,39
TMHDA	4,83 ± 0,99
TMODA	10,45 ± 3,20

Tableau 2 NAD-dépendante activité glucose déshydrogénase immobilisée dans sélectionnés polymères modifiés Nafion billet: activité immobilisée est une fonction de l'activité initiale spécifique de l'enzyme)..

Type de Nafion	L'activité enzymatique (mU / g)
Tampon (aucun polymère)	7,18 ± 0,51
Nafion (un-mod.)	70,1 ± 0,5
TMTDA	133 ± 6
TBAB	244 ± 4
TMDDA	221 ± 6
TMOA	1,78 ± 0,63
TMDA	206 ±5
TEHA	40,1 ± 50,6
TMHDA	0
TMODA	1,45 ± 0,06

Tableau 3 PQQ-dépendante activité glucose déshydrogénase immobilisée dans sélectionnés polymères modifiés Nafion billet: activité immobilisée est une fonction de l'activité initiale spécifique de l'enzyme)..

</tr>

Type de Nafion	L'activité enzymatique (U / g)
Tampon (aucun polymère)	103,61 ± 3,15
Nafion (un-mod.)	19,93 ± 10,10
TMTDA	247,25 ± 12,49
TBAB	152,27 ± 5,29
TMDDA	262,05 ± 6,26
TMOA	129,18 ± 2,31
TMDA	141,23 ± 1,97
TMHA	131,75 ± 2,89
TMHDA	132,50 ± 1,18
TMODA	136,50 ± 0,96

. Représentant Tableau 4 glucose oxydase spécifique immobilisé dans certains polymères Nafion modifiés (note: l'activité immobilisé est une fonction de l'activité initiale spécifique de l'enzyme).

Figure 1. Schéma de constitution TBAB en Nafion polymère et une utilisation ultérieure dans l'immobilisation d'enzymes.

Figure 2. Photographie optique d'un premier co-casting des films de Nafion et TBAB. Séchage lent donne un film transparent, brun clair couvrant la boTTOM du plateau de pesage.

Discussion

Dans le mode opératoire décrit, les sels d'ammonium tétra-alkyle sont utilisés pour modifier le Nafion commerciale pour créer des polymères micellaires qui peuvent être utilisés pour immobiliser et stabiliser les enzymes. Les tests décrits dans le spectacle procédure que le polymère peut être utilisé pour immobiliser une grande variété d'enzymes avec une forte rétention de l'activité. Si l'enzyme d'intérêt a une activité très faible ou qui est impur, une concentration plus élevée peut être nécessaire et ne devrait pas affecter le processus d'immobilisation, à moins que l'immobilisation d'enzymes dans des concentrations supérieures à 10 mg / ml. La simplicité de la procédure le sépare des autres techniques d'immobilisation d'enzymes en ce sens qu'aucun étapes de synthèse (par exemple en tant que polymère de synthèse ou de cross-linking) sont nécessaires. En outre, ces étapes de synthèse souvent dénaturer les protéines ou réduire considérablement leur activité. La concentration en protéines de 1mg/mL est simplement suggéré une concentration pour le chargement enzymatique élevée. La baisse des concentrations d'enzyme peut toujours être utilisé,mais se traduira par une baisse d'activité catalytique volumétrique. En théorie, les concentrations d'enzymes plus élevés peuvent être utilisés aussi longtemps que l'enzyme se dissout.

Parce que les polymères sont solubles dans les alcools aliphatiques inférieurs tels que le méthanol, l'éthanol, et le propanol, un pourcentage élevé d'alcool doit être présent lors du mélange la suspension de polymère avec une enzyme. Dans de nombreux cas, ce n'est pas un problème tant que l'éthanol est évaporé dans un temps opportun une fois le film enzyme encapsulée est jeté. Toutefois, une limitation de cette immobilisation peut se produire si une enzyme n'est pas du tout l'alcool tolérante et dénature ou de précipités lors de l'addition de la suspension Nafion modifié. Dans de rares cas, les enzymes seront précipité ou dénaturant lorsqu'il est mélangé avec la suspension Nafion modifié, qui indique généralement que l'enzyme est devenu dénaturé et ne fonctionnera pas. Il est possible de diminuer la teneur en alcool dans la suspension par la remise en suspension des polymères dans mélanges alcool / eau, Mais des alcools aliphatiques inférieurs sont tenus à des concentrations significatives (> 25%) dans la solution de remise en suspension, donc cette technique d'immobilisation ne fonctionne pas pour les enzymes et les solutions enzymatiques qui ne peuvent tolérer ces concentrations d'alcool.

Les essais enzymatiques pour chacun des polymères avec chacun des trois enzymes montrent que les tendances de l'activité spécifique relative par rapport à l'enzyme en solution est une fonction du système enzymatique. Ceci est normal, car chacune des enzymes est d'une taille différente, pI différent, différent pH optimal, ainsi que le fait que la glucose-déshydrogénase PQQ-dépendante est une protéine associée à la membrane et donc besoin d'un micro-environnement chimique très différente que les protéines cytosoliques. Par conséquent, le Nafion modifié hydrophobiquement micellaire donne une plus-membrane comme l'environnement pour la stabilisation de la glucose déshydrogénase actif PQQ-dépendante que tampon et montre suractivité, ce qui est rare dans les enzymes immobilisées. Uneutre question à considérer est que les membranes polymères de diminuer le transport de grosses molécules de glucose et de bien (le substrat pour les trois tests présentés ici) est de petite taille, le coenzyme NAD doit diffuser dans et hors de la membrane pour NAD-dépendantes déshydrogénases, ce qui diminue la ont observé une activité enzymatique. Dans l'ensemble, il est important de noter que le polymère exacte nécessaire pour chaque enzyme doit être optimisée, en raison des différences dans la taille, la charge, le pH optimal, et le transport de substrat / cofacteurs pour chacun des systèmes enzymatiques.

Autre que les dosages enzymatiques immobilisés, l'application principale qui a été exploré avec cette méthode d'immobilisation enzyme est la fabrication de biocapteurs enzymatiques et les cellules de biocarburants. Lorsque les polymères modifiés contenant Nafion encapsulés enzymes redox sont jetés sur des surfaces d'électrodes, les processus bioelectrocatalytic peut se produire dans la présence de substrats appropriés et des cofacteurs, la production d'un courant électrique response. Bioanodes fabriqués avec Nafion modifié ont été utilisés dans les cellules de biocarburants qui utilisent l'éthanol, le méthanol, le pyruvate et du glycérol, tel que décrit dans l'introduction.

Materials

Nafion	Sigma-Aldrich	70160
Tetra alkylammonium bromide salts	Sigma-Aldrich	n/a
Alcohol dehydrogenase	Sigma-Aldrich	A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)	Simga-Aldrich	N7004
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	P8010
Phenazine methosulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP)	Sigma-Aldrich	D1878
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141
4-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	240141
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Peroxidase	Sigma-Aldrich	P8375
4-aminoantipyrine	Sigma-Aldrich	06800
UV/Vis Spectrophotometer	Thermo	Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance