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Article de méthode

Coloration immunohistochimique de B7-H1 (PD-L1) sur la paraffine Diapositives de tissus adénocarcinome pancréatique

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DOI :

10.3791/4059

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3 janvier 2013

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1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

B7-H1 (PD-L1) et sa liaison au PD-1 fournissent une importante induite par la tumeur de signal immunosuppresseur dans le micro de la tumeur. Une technique de coloration immunohistochimique pour caractériser l'expression et la localisation de B7-H1 dans l'adénocarcinome pancréatique est décrite ici.

Résumé

B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 du système immunitaire réglementaires protéines de surface cellulaire, joue un rôle important dans la régulation négative des réponses à médiation cellulaire immunitaire grâce à son interaction avec son récepteur, la mort programmée-1 (PD -1) 1,2. La surexpression de B7-H1 par les cellules tumorales a été observée dans un certain nombre de cancers humains, y compris le mélanome, le glioblastome et les carcinomes du poumon, du sein, du côlon, de l'ovaire, et des cellules rénales, et a été montré pour affecter anti-tumorales T- 3-8 immunité cellulaire.

Récemment, B7-H1 expression par les tissus adénocarcinome pancréatique a été identifié comme un marqueur pronostique potentiel de 9,10. De plus, le blocage de B7-H1 dans un modèle murin de cancer du pancréas a été montré pour produire une réponse anti-tumorale 11. Ces données suggèrent l'importance de la B7-H1 comme une cible thérapeutique potentielle. Anticorps blocus anti-B7-H1 sont donc l'objet d'essais cliniques pour le mulsieurs tumeurs solides humaines, y compris le mélanome et le cancer du poumon, du côlon, du rein, de l'estomac et du pancréas 12.

Pour finalement être en mesure d'identifier les patients qui bénéficieront de B7-H1 ciblage des thérapies, il est essentiel d'étudier la corrélation entre l'expression et la localisation de B7-H1 et la réponse du patient au traitement avec des anticorps blocus B7-H1. Examiner l'expression de B7-H1 dans les tissus humains adénocarcinome pancréatique par immunohistochimie vous donnera une meilleure compréhension de la façon dont cette molécule de signalisation co-inhibiteur contribue à la suppression de l'immunité anti-tumorale dans le micro de la tumeur. L'anticorps anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) développé par Chen et ses collègues a été montré pour produire des résultats fiables dans cryosections coloration de plusieurs types de tissus humains néoplasiques 4,8, mais des taches sur paraffine diapositives a été un défi que récemment 13-18. Nous avons devenfuie le protocole de coloration B7-H1 pour les diapositives inclus en paraffine des tissus adénocarcinome pancréatique. Le protocole de coloration B7-H1 décrit ici produit conforme coloration membranaire et cytoplasmique de B7-H1 avec petit retour en arrière.

Protocole

B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 du système immunitaire réglementaires protéines de surface cellulaire, joue un rôle important dans la régulation négative des réponses à médiation cellulaire immunitaire grâce à son interaction avec son récepteur, la mort programmée-1 (PD -1) 1,2. La surexpression de B7-H1 par les cellules tumorales a été observée dans un certain nombre de cancers humains, y compris le mélanome, le glioblastome et les carcinomes du poumon, du sein, du côlon, de l'ovaire, et des cellules rénales, et a été montré pour affecter anti-tumorales T- 3-8 immunité cellulaire.

Récemment, B7-H1 expression par les tissus adénocarcinome pancréatique a été identifié comme un marqueur pronostique potentiel de 9,10. De plus, le blocage de B7-H1 dans un modèle murin de cancer du pancréas a été montré pour produire une réponse anti-tumorale 11. Ces données suggèrent l'importance de la B7-H1 comme une cible thérapeutique potentielle. Anticorps blocus anti-B7-H1 sont donc l'objet d'essais cliniques pour l'homme multipledes tumeurs solides, y compris le mélanome et le cancer du poumon, du côlon, du rein, de l'estomac et du pancréas 12.

Pour finalement être en mesure d'identifier les patients qui bénéficieront de B7-H1 ciblage des thérapies, il est essentiel d'étudier la corrélation entre l'expression et la localisation de B7-H1 et la réponse du patient au traitement avec des anticorps blocus B7-H1. Examiner l'expression de B7-H1 dans les tissus humains adénocarcinome pancréatique par immunohistochimie vous donnera une meilleure compréhension de la façon dont cette molécule de signalisation co-inhibiteur contribue à la suppression de l'immunité anti-tumorale dans le micro de la tumeur. L'anticorps anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) développé par Chen et ses collègues a été montré pour produire des résultats fiables dans cryosections coloration de plusieurs types de tissus humains néoplasiques 4,8, mais des taches sur paraffine diapositives a été un défi que récemment 13-18. Nous avons développé le staini B7-H1protocole ng pour les diapositives inclus en paraffine des tissus adénocarcinome pancréatique. Le protocole de coloration B7-H1 décrit ici produit conforme coloration membranaire et cytoplasmique de B7-H1 avec petit retour en arrière.

1. De-parafinization

  1. Cuire glisse à 55 ° C pendant 20 min.
  2. Dans une hotte chimique, immerger les lames dans du xylène pendant 10 min.
  3. Immerger les lames dans du xylène frais pendant 10 min.
  4. Plonger les lames dans de l'éthanol à 100% pendant 5 min.
  5. Plonger les lames dans de l'éthanol 100% frais pendant 5 min.
  6. Plonger les lames dans de l'éthanol à 95% pendant 5 min.
  7. Plonger les lames dans l'éthanol à 80% pendant 5 min.
  8. Plonger les lames dans de l'eau désionisée pendant 5 min.

2. Récupération antigène

  1. Immerger les lames dans du Tris-EDTA (pH 9,0) et de la chaleur dans une cocotte-minute à 125 ° C pendant 30 secondes, puis 90 ° C pendant 10 sec.
  2. Laissez refroidir diapositives pendant 60 min.
  3. Immerger les lames dans du TBST pendant 5 min; Repemoins deux fois.

3. Tachant

  1. Essuyez solutions autour du tissu sur les diapositives. Marquer un cercle autour du tissu avec un stylo hydrophobe.
  2. Placer les lames dans une chambre humide et éviter le séchage du tissu sur la lame pendant le processus de coloration entier. Déposer une goutte (environ 200 pi ou plus pour couvrir complètement la zone de tissu) du bloc de peroxydase dans le cercle hydrophobe sur la diapositive et diapositives incuber dans le bloc peroxydase pendant 5 min.
  3. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
  4. Déposer une goutte de BLOCK ACE tampon de blocage sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
  5. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
  6. Déposer une goutte de solution d'avidine sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
  7. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
  8. Déposer une goutte de solution de biotine sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
  9. Rincer slides avec TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
  10. Incuber les lames avec 1:1000 dilution des anticorps de souris anti-B7-H1 anticorps monoclonal (clone 5H1) ou une souris IgG1 κ isotype contrôle dans 200 ul TBST à 4 ° C pendant la nuit pendant 22 heures + / - 1 heure. La concentration finale de l'anticorps dans du TBST vaut 2.57 pg / ml.
  11. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
  12. Incuber les lames avec un rat biotine anti-souris conjugué anticorps IgG1 secondaire à une concentration 1:500 (dans 200 ul solution de chèvre 2% de sérum) pendant 30 min.
  13. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
  14. Déposer une goutte de streptavidine-biotine (doit être préparé au moins 30 minutes avant de l'utiliser) sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
  15. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
  16. Déposer une goutte de réactif d'amplification (dilué 2:1 avec du TBST) sur chaque lame et incuber pendant 4 min.
  17. Rincer les lames avec TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
  18. Déposer une goutte de streptavidine-HRP sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
  19. Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
  20. Déposer une goutte de 3,3-diaminobenzidine (DAB) et substrat chromogène sur chaque diapositive et développer la couleur pendant 2 min.
  21. Immédiatement après le développement de la couleur, laver les lames avec ddH 2 O pendant 1-2 min.
  22. Incuber les lames avec une goutte d'hématoxyline pendant 90 sec.
  23. Laver avec ddH 2 O pendant 1-2 min.
  24. Laver à l'eau savonneuse robinet pendant 1-2 min.
  25. Laver avec ddH 2 O pendant 1-2 min.

4. La déshydratation et de montage

  1. Immerger les lames dans l'éthanol à 80% pendant 3 min.
  2. Immerger les lames dans l'éthanol à 95% pendant 3 min.
  3. Immerger les lames dans l'éthanol à 100% pendant 5 min. Répéter.
  4. Immerger les lames dans du xylène pendant 5 min. Répéter.
  5. Ajouter une goutte deCytoseal 60 à la lame et le lieu de la lamelle.

Le tableau 1 dresse la liste des réactifs utilisés dans les procédures décrites ci-dessus.

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Résultats

Une coloration immunohistochimique succès de B7-H1 fera la démonstration de l'expression hétérogène de B7-H1 (brun signaux développement de la couleur DAB) dans l'adénocarcinome du pancréas. Certaines cellules d'adénocarcinome du pancréas ont une expression essentiellement membranaire de B7-H1 (figure 1A) tandis que d'autres ont une expression soit essentiellement cytoplasmique de B7-H1 ou peu d'expression de B7-H1 (figures 2 et 3). Épithélium pancréatique normal con...

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Discussion

La coloration immunohistochimique de B7-H1 sur cryocoupes a été rapporté dans les études antérieures pour une variété de cancers 3,4. Cependant, cliniques échantillons tumoraux sont généralement disponibles que sous la forme de blocs de paraffine. L'anticorps monoclonal 5H1 a plus récemment été appliquée avec succès à la coloration des tissus tumoraux inclus en paraffine y compris le carcinome à cellules rénales, cancer du col, cancer de la vessie et le mélanome 13-18. B7-H1 taches sur la paraf...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

EB, KMB, et HX contribuent à parts égales. Cette étude a été financée par le NCI SPORE de cancers gastro-intestinaux P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Lustgarten Foundation, Viragh Fondation, le Prix du jeune chercheur ASCO, NIH 5T32 CA0090701-28 Subvention de formation, Sol Goldman Centre cancer du pancréas, de la Fondation nationale du pancréas.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
CSA Système Dako K1500 Comprend les réactifs suivants mentionnés dans le protocole: bloc peroxydase streptavidine-biotine, complexe, de réactifs d'amplification, la streptavidine-HRP et le substrat chromogène DAB et
Avidine / biotine Blocage Kit Vecteur SP-2001
Bloquer ACE Serotec BUF029
La biotine anti-IgG1 de souris BD 553441
Mouse IgG1 Isotype contrôle K eBioscience 14-4714-85
TBS (Tris-buffered saline), 10X Cellgro 46-012 CM- 10xTBS contient 80 g / L de NaCl et 24,2 g / L Tirs;
Diluée à 1X avec ddH2O pour les lavages;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 Ajouté 1 ml à 1 L d'1X TBS pour faire TBST
Target Retrieval, 20x Celerus Vague 014-3000-000 Dilué à 1 avec ddH 2 O
190 preuve Alcool éthylique Pharmco-AAPER 111000190
200 Proof Alcool éthylique PHARMO-AAPER 111000200
Xylène VWR 95057-827
Hématoxyline Richard-Allan scientifique 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan scientifique 8310-4
Lamelles de Corning 2940-245
Chambre d'humidité Sigma H6644
Tableau 1. Réactifs et matériel.

Références

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