Summary
ووصف وظيفي اندماجي طريقة الفرز من أجل الحصول على نظرة ثاقبة لآثار التركيب الجزيئي للmicroenvironments على الوظائف الخلوية. الأسلوب يستفيد من التكنولوجيات القائمة على أساس ميكروأري لتوليد صفائف microenvironments اندماجي تعريف التي تدعم التصاق الخلايا والتحليل الوظيفي.
Abstract
التفاعلات بين الخلايا والمكروية المحيطة بها تكون له عواقب وظيفية للسلوك الخلوية. على مستوى خلية واحدة، يمكن microenvironments متميزة فرض التمايز، والهجرة، وانتشار الظواهر، وعلى مستوى أنسجة المكروية العمليات المعقدة مثل التشكل وتكون الأورام 1. ليس فقط محتويات الخلية والجزيئية لتأثير microenvironments الخلايا داخل، ولكن القيام بذلك مرونة 2 و 3 من هندسة الأنسجة. يعرف بأنه مجموع خلية خلية، ECM-، والتي تذوب في التفاعلات عامل، بالإضافة إلى الخصائص الفيزيائية، والمكروية معقدة. والظواهر من الخلايا داخل الأنسجة ويرجع ذلك جزئيا إلى محتواها الجيني ويرجع ذلك جزئيا إلى التفاعلات اندماجي مع microenviroment. ومن التحديات الرئيسية هو ربط مجموعات محددة من مكونات microenvironmental مع السلوكيات المميزة.
الأنف والحنجرة "> وهنا، نقدم المكروية ميكروأري (MEArray) منهاج خلية مقرها الفرز وظيفية من التفاعل مع microenvironments اندماجي 4. طريقة تسمح للسيطرة في وقت واحد من التركيب الجزيئي ومعامل المرونة، ويجمع بين استخدام ميكروأري على نطاق واسع تقنيات micropatterning و. شاشات MEArray تتطلب عدد قليل من إلى 10،000 خلية لكل مجموعة، مما يسهل الدراسات الفنية للأنواع الخلايا نادرة مثل الخلايا الاصلية الكبار. وجود قيود على التكنولوجيا التي لا microenvironments الأنسجة كامل تلخيصها بشكل كامل على MEArrays. ومع ذلك، مقارنة الردود في نوع من الخلايا نفس microenvironments العديدة ذات الصلة، على سبيل المثال سوف تركيبات البشرى للبروتينات ECM التي تميز نسيج معين، يعطي فكرة عن كيفية حصول microenvironmental مكونات الأنسجة محددة الظواهر الفنية.يمكن طباعة MEArrays باستخدام مجموعة متنوعة واسعة من المؤتلف غرووث العوامل، السيتوكينات، والبروتينات تنقية ECM، وخليط منها. يقتصر فقط منصة توفر الكواشف محددة. MEArrays قابلة للتحليل الوقت انقضى، ولكن في معظم الأحيان تستخدم لتحليل نقطة النهاية من الوظائف الخلوية التي هي قابلة للقياس مع تحقيقات الفلورسنت. على سبيل المثال، عادة يتم قياس توليف الحمض النووي، موت الخلايا المبرمج، واقتناء الدول المتباينة، أو إنتاج منتجات جين معين. لفترة وجيزة، وتدفق الأساسية للتجربة MEArray هو إعداد الشرائح المغلفة مع الطبقات التحتية الطباعة وإعداد لوحة رئيسية من البروتينات التي سيتم طباعتها. ثم يتم طباعة المصفوفات مع الروبوت ميكروأري، يسمح لخلايا إرفاق، وتنمو في الثقافة، ومن ثم يتم إصلاحها كيميائيا عند الوصول إلى نقطة النهاية التجريبية. وتستخدم المقايسات الفلورسنت أو اللونية، مع تصوير المجاهر التقليدية أو الماسحات الضوئية ميكروأري، لتكشف الظواهر ذات الصلة الجزيئية والخلوية (الشكل 1).
Protocol
1. الطباعة إعداد الطبقات التحتية
قرار استخدام polydimethylsiloxane (PDMS) المغلفة أو بولكرلميد (PA)-الشرائح المغلفة تعتمد على المعالم الهامة للتصميم تجريبي. يمكن ضبطها معامل مرونة كل من البوليمرات لتقليد التصلب من الأنسجة المختلفة عن طريق تغيير نسبة الأساسية / علاج من PDMS، ونسبة مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد من السلطة الفلسطينية. يمكن PDMS تقليد صلابة الأنسجة في مجموعة من 10MPa-1 (الغضروف على سبيل المثال، القرنية، وجدران الشرايين)، والسلطة الفلسطينية يمكن أن تحاكي الأنسجة ليونة في حدود 5 (الثدي على سبيل المثال، الدماغ، الكبد والبروستاتا) 100Pa-100kPa. PDMS غير مكلفة، سهلة التحضير، وهندسة ملامح المطبوعة سوف تكون مماثلة لرئيس دبابيس الطباعة. ومن ثم لا يمكن أن يكون حجم وشكل ملامح يسيطر بدقة باستخدام دبابيس مع هندستها طرف آخر. PDMS أكثر من PA مسعور، والذي يسبب بعض التحديات خلال التعامل مع الخلايا وimmunosقد الحتفاظ الخطوات، ويكون متوافق مع بعض خطوط الخلايا. لأن السلطة الفلسطينية هي من مواليد هيدروجيل والسطح غير قاذورات، وسوف نعلق فقط على الخلايا التي توجد فيها البقع البروتينات التي تدعم التصاق الخلية. هندسة ملامح مطبوعة على المواد الهلامية PA لا تتبع بدقة هندسة رأس الدبوس؛ عادة ما تصبح الدوائر بسبب نشرها، بغض النظر عن هندسة رأس الدبوس الذي يتم استخدامه. يمكن الطباعة المعلمات قطر الاتصال الوقت وتحديد دبوس تجريبيا لحجم الميزة الأمثل على المواد الهلامية PA.
Polydimethylsiloxane (PDMS)
- في كوب من البلاستيك القابل للتصرف الجمع بين Sylgard الاستومر سيليكون 184 قاعدة مع وكيل علاج في نسبة 10:1، خلط بقوة مع لسان خشبية أو بلاستيكية ثم خافضة ديغا في فراغ جرس درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- مركز شريحة المجهر الموحدة بشأن تحقيق تشاك الفراغ دفعتها لالمغطي تدور، ثم رذاذ 0.5 مل من البوليمر الاستومر مختلطة على مركز سطح الشريحة. تدور في6،000 دورة في الدقيقة لثانية 60.
- علاج الشرائح المغلفة PDMS في فرن درجة أو 70 درجة على لوحة ساخنة الرقمية (محمية من الغبار) لمدة 4 ساعة ليلة وضحاها.
- ويمكن استخدام شرائح علاجه على الفور، أو تخزينها لعدة أشهر في مربع الشريحة التي ختمت داخل كيس من البلاستيك زيبلوك ويحتفظ بها في درج. ويجذب الغبار PDMS لذلك يجب أن محمية بشكل جيد من التداول هواء الغرفة.
- ملاحظة: يجب أن ترتديه أو غيرها نيتريل قفازات اللاتكس غير عند العمل مع عدة الاستومر PDMS. والاتصال مع عرضية قفازات مطاطية تمنع PDMS البلمرة.
بولكرلميد (PA)
- هيدروكسيد الصوديوم النقش: الشرائح مكان في كتلة الحرارة عند 80 ° C. إضافة 1 مل هيدروكسيد الصوديوم 0.1N على كل شريحة، مع التأكد من تغطية سطح الشريحة بأكملها. السماح للهيدروكسيد الصوديوم تتبخر (فيلم أبيض وينبغي أن تتشكل على سطح الشريحة). منذ هلام PA يمكن أن نعلق فقط على الأسطح بقوة محفورا هيدروكسيد الصوديوم، فإن جل PA فصل الجفاف خلال الخطوة إذا الأمواج الشريحة بأكملهالا تغطي ACE من هيدروكسيد الصوديوم. إذا لم يتم تغطية سطح الشريحة تماما، كرر بإضافة 1 مل هيدروكسيد الصوديوم 0.1N. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أيام. ملاحظة: بديل لهيدروكسيد الصوديوم هو النقش للمواد المستنفدة للأو البلازما تنظيف الشرائح.
- 3-Aminopropyltriethoxysilane (القردة) طلاء: في غطاء الدخان، والشرائح مكان في صحن 15 مل، وإضافة 300 ميكرولتر القردة على كل شريحة محفورا هيدروكسيد الصوديوم. السماح للالقردة تتفاعل مع هيدروكسيد الصوديوم الشرائح لمدة 5 دقائق. وسوف تزيد هذه المرة يسبب صعوبة في غسل غير المتفاعل من القردة كاشف. تغسل جيدا بالماء القردة منزوع الأيونات مرتين إلى ثلاث مرات على كلا الجانبين من الشرائح. إذا لم يكتمل غسل، سيتم المؤكسد من القردة غلوتارالدهيد لتشكيل وديعة بني على الشرائح في الخطوة 1.8.
- الأكسدة غلوتارالدهيد: نضح كل الحلول من السطوح الشريحة. في كل طبق 15 سم، إضافة 25 مل غلوتارالدهيد 0.5٪ في برنامج تلفزيوني. تتفاعل لمدة 30 دقيقة في منطقة مظلمة. بعد 30 دقيقة، نضح كل غلوتارالدهيد واستخدام العمالة غير الوبرatory مناديل (Kimwipes على سبيل المثال) لتجف بعناية الشرائح. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين الشرائح في RT لمدة تصل إلى يوم واحد.
- هلام إعداد: بعد إعداد الخلائط PA بما في ذلك، الأكريلاميد مادة الأكريلاميد مكرر وDDH O 2 في وفقا للجدول أدناه، ديغا لمدة 30 دقيقة، ثم ضع خليط PA على الجليد لإبطاء البلمرة. إضافة APS وTEMED وتخلط جيدا قبل اتخاذ هذا الحق المواد الهلامية. الماصة مخاليط PA على أسطح الشرائح والمكان 24 مم × 50 مم، عدد 1 coverslips على رأس السلطة الفلسطينية. تجنب الضغط على ساترة وشريحة زجاجية معا وتشكيل فقاعة تجنب. لالهلام> 40000 باسكال استخدام 100 ميكرولتر، لالهلامية الأخرى 350 لميكرولتر.
| المطلوب معامل (باسكال) | الأكريلاميد٪ | مكرر الأكريلاميد٪ | مادة الأكريلاميد من المخزون 40٪ (مل) | مكرر الأكريلاميد من المخزون 2٪ (مل) | منزوع الأيونات الماء (مل) | APS (ميكرولتر) | TEMED (ميكرولتر) |
| 480 ± 160 3 | 0.06 | 0.75 | 0.3 | 8.95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 100 | 10 |
| 40400 ± 2390 | 8 | 0.48 | 2 | 2.4 | 5.6 | 100 | 10 |
مقتبس من 6،7.
- السماح للهلام PA تتبلمر لمدة 2 ساعة، ثم قم بإزالة تحت الماء منزوع الأيونات coverslips.
- غسل هلام الشرائح PA في الجرار COPLAN كبيرة بين عشية وضحاها في الماء (~ 8 ساعات) لإزالة acrylamides غير المتفاعل.
- الشرائح الجافة في فرن درجة 37 درجة لمدة 2-4 ساعة أو حتى يصلب PA جل تماما.
- ويمكن تخزين PA هلام الشرائح في C ° 4 لمدة شهر في مربع الشريحة مختومة.
2. إعداد لوحة البروتين ماجستير
- جميع البروتينات شولد أن aliquoted في مخزونات حلول 10X في مخازن موصى بها من قبل موفر وتخزينها في -80 ° C. البروتينات هي الأكثر ECM للذوبان في الماء منزوع الأيونات، ولكن درجة الحموضة قد تحتاج إلى تعديل مع قطرات من حمض الخليك. وتعد أهم العوامل النمو، السيتوكينات، والمجالات مستقبلات المؤتلف خارج الخلية في برنامج تلفزيوني مع BSA، ولكن الظروف تختلف الصانع و. تصفية البروتين مأخوذة من خلال ميكرون 0.45 4 ملم النايلون حقنة تصفية (Nalgene) قبل التخزين.
- تصميم لوحة رئيسية وفقا للتركيبات البروتين المطلوب والتخفيفات. الخلايا الملتصقة عادة تعتمد على وجود واحد على الأقل متوافقة ECM للتوسط التصاق الخلية، ولكن الأجسام المضادة لالحواتم سطح الخلية يمكن التوسط أيضا مرفق في بعض الأحيان. انها فكرة جيدة لإضافة صبغة FITC مجانا أو بروتين fluorphore، مترافق إلى واحد على الأقل بشكل جيد بحيث يمكن أن تكون موجهة نحو صفائف بسهولة في وقت لاحق.
- إعداد لوحة رئيسية من تمييع تركيبات البروتين مع العازلة الطباعة يتكون من 100 مليTris-acetate/20٪ glycerol/0.05٪ تريتون-100X درجة الحموضة 5.2. عادة كل بئر من لوحة 384 ميكرولتر جيدا لا يحتوي على أكثر من 10.
- تسجيل محتويات كل بئر في كل لوحة رئيسية في علامة التبويب ملف محدد قاعدة البيانات وتزويد كل لوحة رئيسية مع رقم تعريف فريد. A تاريخ ستة أرقام الأحرف الأولى تليها المصمم غالبا ما تخدم الغرض (MMDDYYinitial). لأن كميات صغيرة بشكل جيد، ويمكن استخدام البروتين مأخوذة بكفاءة لتوليد أعداد كبيرة من لوحات تكرار. فمن المستحسن أن يتم تخزين لوحات رئيسية في -80 درجة مئوية و كل لوحة رئيسية ينبغي أن يخضع أي أكثر من عقدين من تجميد ذوبان الجليد دورات.
3. MEArray الطباعة
- يمكن طباعة MEArrays مع معظم الروبوتات التقليدية الطباعة ميكروأري. الطابعات التي تستخدم دبوس ريشة إما السيليكون أو دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ تعمل بشكل جيد، ولكن اللزوجة البروتين يمكن أن يكون مشكلة. الطابعات مثالية الشعرية الروبوتات الطباعة ميكروأري لهذا التطبيق، كما أنها تعملبشكل جيد مع حلول البروتين اللزج.
- للوصول إلى السلطة إحصائية جيدة ضمن مجموعة، ويوصى تكرار النقاط 10 إلى 12 من كل المكروية. وهذا التصميم يسمح مقارنة بين النشاط النسبي في واحدة المكروية إلى آخر في نفس مجموعة بسيطة باستخدام اختبار T-الإحصاءات. ويمكن استخدام اختبار Dunnette لمقارنة النشاط في بيئة التحكم مع microenvironments أخرى. هذا التصميم يعمل بشكل أفضل عندما ارتبط النمط الظاهري وظيفية مع المكروية السيطرة قبل تنفيذ التجارب MEArray.
- ينبغي الحفاظ على الرطوبة حوالي 50٪. مراقبة الرطوبة مهم لأن وجود الرطوبة المنخفضة يمكن أن تجفف الحل داخل دبابيس أو في الآبار من لوحة رئيسية تسبب ترسب الطبقات التحتية غير فعالة على الطباعة. الرطوبة يمكن التحكم بفعالية من قبل اللف الروبوت مع المنظمات غير مسامية والأغطية البلاستيكية باستخدام كل من المرطب ودي المرطب لضبط للحفاظ على الرطوبة 50٪. يمكن تبريد plattens الطباعة تكون usefيجب أن تؤخذ UL للحفاظ على بعض البروتينات، ولكن الحذر لتجنب التكثيف من تشكيل على الشرائح.
- وينبغي تصنيف كل مجموعة طبعت مع تسميات الشريحة الفريزر واقية المشفرة مع رقم تسلسلي يتكون من معرف لوحة الماجستير تليها عدد من ثلاثة أرقام (MMDDYYinitial-NNN). كما يتم استخدام كل مجموعة أو توزيعها، ينبغي الحفاظ تفاصيل العلاجات التجريبية في قاعدة بيانات. وسوف تتبع مواعيد الطباعة وأعداد تجميد ذوبان الجليد دورات لوحات رئيسية تساعد في تحديد الظروف المثلى للحفاظ على التكاثر.
- يجب أن يتم تخزين MEArrays المطبوعة في صناديق مختومة الشريحة في -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن شهر واحد. استنساخ ينخفض بشكل ملحوظ بعد ذلك.
4. زراعة خلايا الثدييات على MEArrays لتحليل دالي
- غرف إرفاق الثقافة: للحد من حجم وسائل الإعلام وعدد من زراعة الخلايا المطلوبة على MEArrays، غرفة البلاستيك هو وitted لتطويق مجموعة المطبوعة. للصفائف كثيرة، يمكن أن تستخدم من مجلس واحد من شريحة 2-غرفة (نونك) الذي يحتوي على مساحة 4.2 سم 2. إزالة الدوائر من الشريحة غرفة المصنعة وقطع الدوائر في نصف مع شفرة حلاقة. استخدام حقنة 3 مل لتطبيق حبة رقيقة من السيليكون الحوض (DAP) إلى حافة الدائرة واضغط على سطح MEArray. تجنب وضع حوض السمك تطبيق سيليكون غرفة على الميزات الصفيف.
- الحجب والشطف: MEArrays تحتاج إلى أن تكون تشطف جيدا لإزالة مونومرات غير المتفاعل، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا. إذا استخدمت PDMS المغلفة الشرائح، ثم المناطق في الميزات بين المطبوعة تحتاج أولا للإحاطة بها مع طلاء غير قاذورات لمنع التصاق الخلية؛ احتضان صفائف في بلورونيك 1٪ F108 (BASF) في الماء أو 2٪ BSA في المياه لمدة 15 دقيقة تحت الفراغ. PA الشرائح هلام لا تتطلب خطوة حظر. في جميع الحالات، وشطف مع صفائف أوساط استزراع الخلايا، ثلاث مرات لمدة خمس دقائق (وسائل الإعلام يعتمد اختيارعلى الخلايا المستخدمة، ولكن من المستحسن استخدام المضادات الحيوية بغض النظر عن وسائل الإعلام أو الخلايا). PA تحتاج الى مزيد من المواد الهلامية الحضانة 30 دقيقة في وسائل الإعلام لترطيب هلام.
- مرفق الخلية: أربعة إلى خمسة صفائف يمكن أن يصلح من داخل 15 سم واحد طبق بتري معقمة. تغطية طبق بتري مع غطاء للحفاظ على صفائف العقيمة. إضافة نصف من حجم وسائل الاعلام النهائي إلى MEArray بإضافة خلايا في وسائل الإعلام إلى تركيز النهائي من 10،000 إلى 1،000،000 خلية / مل. وسوف نعلق على الخلايا ملامح مطبوعة بمعدلات مختلفة تبعا لتكوين المكروية المطبوعة. تحقق من وجود المرفقات موحدة عن طريق عرض صفائف من خلال مجهر مقلوب في مرحلة فترات 15 دقيقة إلى 20. عن طريق هز بلطف ذهابا وإيابا MEArrays، يمكن التمييز بين الخلايا إرفاق بطريقة نمط من الخلايا، غير مرتبط عائمة.
- إزالة الخلايا غير منضم: على السلطة الفلسطينية المغلفة MEArrays، يمكن أن يستنشق الخلايا غير منضم ويمكن استبدال وسائل الإعلام، ويبلغ حجم المناسبة. على PDMS المغلفة MEArrays، يمكن لوسائل الإعلام لن تكون إزالتها تماما من البئر لأن الخلايا تجف وتموت على الفور تقريبا. بالتالي على PDMS المغلفة MEArrays، يجب إزالة الخلايا غير منضم من خلال عملية التبادل متتالية من نصف حجم وسائل الاعلام حتى يتم إزالة أي خلايا غير منضم، على النحو الذي يحدده التفتيش المجهري. تأثير دي ترطيب PDMS هو أقل وضوحا عند استخدام مصل المحتوية على وسائل الإعلام وسائل الإعلام مقارنة محددة، وعند استخدام BSA لمنع المناطق غير مطبوع مقارنة Pluronics F108.
- يمكن تربيتها الخلايا على MEArrays وضعت داخل أطباق بتري من 15 سم لعدة أيام مع وسائل الإعلام تغييرات طبيعية. ويجب أن يتم تغيير وسائل الاعلام على الشرائح PDMS مع التغييرات المتلاحقة من نصف حجم سائل الإعلام.
- مثبتات المشتركة، مثل بارافورمالدهيد والميثانول / الأسيتون، متوافقة مع أنظمة MEArray. عندما تلطيخ الخلايا على السلطة الفلسطينية المغلفة MEArrays، يمكن إضافة مثبتات وجرفت تماما كما أنها ستكون في إجراء تلطيخ التقليدية.ولكن عندما تلطيخ الخلايا على PDMS المغلفة MEArrays، يجب أن تبقى رطبة السطح حتى أثناء التثبيت. نضح نصف وسائل الإعلام واستبدالها مع مثبت. كرر العملية عدة مرات حتى يتم تعبئة بشكل جيد مع أغلبية مثبت. بعد التثبيت، يتم استبدال تدريجيا مثبت بنفس الطريقة مع العازلة عرقلة غير مناسبة لاتخاذ الخطوة التالية من التحليل.
- ويشيع استخدام المناعية لتحليل الوظائف الخلوية. سوف تختلف إجراءات تلطيخ، ولكن عند العمل على MEArrays PDMS، ويحتاج المرء لأداء كل خطوة الغسيل وتطلع على النحو الوارد أعلاه، وتغيير تدريجي الحلول وعدم السماح السطح لإزالة الرطب. سوف يسبب التبول في دي التحف في تلطيخ.
- يمكن إزالة الدوائر بمساعدة شفرة حلاقة. يمكن تركيبه على رأس Coverslips MEArrays الملون باستخدام Fluoromount-G (جنوب التكنولوجيا الحيوية). لا يمكن أن يؤديها مع معظم الماسحات الضوئية الكشف متعدد الألوان ميكروأري مضان المجاهر مبائر أو على آلية معمبلطة وسائط صورة الاستحواذ.
5. ممثل النتائج
مثال على ترسب البروتين منقوشة على المطبوعة PDMS-كواستيد MEArray باستخدام دبابيس السيليكون ذات الرؤوس مربع على الروبوت ريشة ميكروأري الطباعة دبوس هو مبين في الشكل 2. يمكن التحقق من ترسب البروتينات المختلفة التي يتم طباعتها من قبل الأجسام المضادة المناعي باستخدام (الشكل 2A). التخفيفات من الحلول البروتين في لوحة رئيسية هي انعكاس للمبلغ (كثافة الفلورية) أن يترسب على سطح الطبقات التحتية الطباعة (الشكل 2B). يجب أن نعلق على الخلايا ميزات المطبوعة بطريقة واضحة منقوشة (الشكل 2C).
مثال لتجربة MEArray تبين أن التخفيفات عكس البروتينات المكروية 2 أثارت محددة ملامح التعبير الكيراتين بطريقة تعتمد على التركيز البروتين في الإنسان متعددة القدرات ف الظهارية الثدييةويرد rogenitor خط الخلية (الخلايا D920)، في الشكل 3. قطع فقاعة مفيدة لتحديد ما إذا كان يتم فرض الظواهر محددة على الخلايا على الميزات تكرار لسلسلة التخفيف. على سبيل المثال، إذا جزيء معين في المكروية يؤدي إلى النمط الظاهري متميزة، بمجرد المخفف المكون مفيدة بما فيه الكفاية إلى خلفية محايدة ECM النمط الظاهري ينبغي تغيير أو تختفي. تم إجراء الكشف المناعي من الكيراتين 8 و 14 الكيراتين البروتينات خيوط وسيطة مع اكسون 4200a (الأجهزة الجزيئية) ميكروأري الماسح الضوئي. وطبعت اثني عشر سلسلة التخفيف انتهاج هذه السياسة في كل MEArray، وسجل 2 نسبة من الكيراتين 8 إلى 14 يعني الكيراتين ورسوم بيانية وكثافة مضان مؤامرة فقاعة لإعطاء فكرة واقعية من التباين واستنساخ للإشارة. أظهرت بيانات من هو MEArray الذى كان قد حدد الخلايا علقت بعد وغسلت الخلايا غير منضم بعيدا (الشكل 3A)، وبعد 24 ساعة من cultuإعادة (الشكل 3B). لهذا التحليل صغيرة نسبيا، تم استخدام ANOVA في اتجاه واحد لتحديد الفرق من إشارة يعني في كل نقطة الوقت، ويتم تجميعها واستخدمت اثنين من الذيل T-اختبارات لتحديد ما إذا كان التخفيفات مختلفة من النوع الأول الكولاجين و-P الإنسان المؤتلف تسبب التغييرات في التعبير كادهيرين الكيراتين. لم يكن هناك اختلاف عن المتوسط بين الخلايا على الميزات فقط بعد الحجز، ومع ذلك، كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في التعبير الكيراتين بين خلايا بعد 24 ساعة من التعرض للmicroenvironments مختلفة. T-اختبارات التحقق من أن ارتفاع تركيزات النوع الأول الكولاجين أثارت أعلى الكيراتين 8 التعبير، في حين ارتفاع P-كادهيرين تركيزات قوية استدعت الكيراتين 14 إشارة بعد 24 ساعة. وكانت هذه النتيجة تتفق مع التقارير السابقة التي P-كادهيرين التي تحتوي على microenvironments ستفرض من K14، معربا عن النمط الظاهري ظهاري عضلي على ثنائية قوية الخلايا الاصلية الثديية 4.
مثال لscanne كاملويرد د MEArray مطبوعة على مادة هلامية 40000 PA السلطة الفلسطينية في الشكل 4.
الشكل 1. مخطط تدفق الإجراء MEArray. أولا، يتم إعداد الطبقات التحتية الطباعة إما مع أو PDMS PA. الثانية، لوحات رئيسية هي معدة والمفصل في قاعدة بيانات. الثالث، يتم طباعة MEArrays والمشفرة مع الأرقام التسلسلية. الرابعة، هي التي تعلق الدوائر والثقافة، والسطوح هي كتل و / أو تشطف، ثم يسمح لخلايا إرفاق وتغسل الخلايا غير منضم بعيدا. الخامس، يمكن علاج الخلايا مع تلطيخ أو الفحص الحيوي، بعد فترة من الحضانة يعتمد على التصميم التجريبي. وأخيرا، يمكن الحصول على الصور من MEArray وتحليلها مع الماسحة الضوئية والبرمجيات المناسبة.
الشكل 2. Deposيمكن التحقق ition وفرة نسبية من البروتينات المناعية المطبوعة مع المرفقات قبل الخلية. A) الأجسام المضادة التي اعترفت النوع الرابع الكولاجين وlaminin-111 كانت تستخدم للتحقق من وجودها في ملامح المطبوعة من MEArray. B) باستخدام كثافة بكسل ميزة تحليل متوسط في المعاهد الوطنية للصحة يماغيج البرمجيات، والوفرة النسبية للالبروتينات اثنين عبر سلسلة من التخفيفات، بدءا من حل البروتين 200 ميكروغرام / مل، يمكن تقييم نوعيا. C) صورة مجهرية من المرحلة D920 الخلايا المرتبطة مربعة الشكل ملامح MEArray PDMS المغلفة المطبوعة.
الشكل 3. مثال على تحليل MEArray باستخدام التغيرات في التعبير الكيراتين في خط خلية متعددة القدرات والسلف من الوظائف من الوقت والمكروية. كل فقاعة تمثل نسب الكيراتين الكيراتين 8 و 14 مستويات البروتين 10-15 خلايا مثبتة في الهيئة الاتحادية للبيئةتلح في MEArray. تم تحديد التعبير مع تحقيقات مناعي. A) يبين نسب الكيراتين في الخلايا بعد المرفق، وB) يبين نسب الكيراتين بعد 24 ساعة على صفيف ومطلي بشكل متواز. كان التركيز الأقصى على حد سواء البروتينات 200 ميكروغرام / مل والمخففة 2 أضعاف. قطر فقاعة يمثل حجم سجل نسبة 2 من الكيراتين 8 و 14 الكيراتين يعني كثافة، واللون البرتقالي والأبيض الترميز يشير القيم> 0 و <0، على التوالي. وتظهر قيم F-في اتجاه واحد وANOVA P-القيم من الاختبارات-T، وأقواس مع السهام تحديد السكان مقارنة.
الشكل 4. المكتسبة مثال لمسح MEArray باستخدام وضع البلاط على اقتناء ليزر متحد البؤر المسح الضوئي المجهر. HCC1569 الخلايا سمحنا لدمج DNA متشابهة EDU لمدة 4 ساعة قبل التثبيت.دابي (الأزرق) وايدو (أحمر) وترد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة MEArray المقدمة هنا يمكن التحليلات الفنية للخلية والتفاعلات المكروية اندماجي 4. MEArray تحليل يجمع بين استخدام تكنولوجيات micropatterning الأساسية، بيولوجيا الخلايا، والروبوتات وأجهزة الطباعة ميكروأري التحليل التي تتوفر في مرافق متعددة كثيرة. شاشات MEArray متوافقة مع معظم أنواع الخلايا الملتصقة، على الرغم من المصل خالية من وسائل الإعلام قد تركيبات تحتاج إلى تعديل في بعض الحالات لتشمل BSA أو <1٪ مصل، والتي يمكن أن تحسن المرفقات. ويقتصر هذا الأسلوب من قبل توافر الكواشف لتحليل وظيفة معينة الخلوية؛ مضان مقرها المقايسات متوافقة مع معظم أنظمة التصوير القائم على مجموعة، ولكن المقايسات اللونية يمكن أن تعمل أيضا بشكل جيد. تغيرات أخرى في هذه الطريقة موجودة ودعم الفكرة العامة التي يمكن microenvironments معقدة وظيفيا تشريح لكشف ما الأدوار الجزيئات المكروية الفردية ومجموعات تلعب منه في مجموعة متنوعة من الخلايا ظائفهستعقد 8،9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم من قبل ML NIA (R00AG033176 وR01AG040081) ومختبر البحوث الموجهة والتنمية، وزارة الطاقة عقد # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
