La génération et la caractérisation des tumeurs des cellules T spécifiques en utilisant des souris humanisés est décrit ici. Human tissu thymique et génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines sont transplantées dans des souris immunodéprimées. Cela se traduit par la reconstitution d'un système immunitaire humain ingénierie permettant l'examen in vivo des réponses anti-tumorales immunitaires.
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Article de méthode
Utilisation de la souris BLT humanisé comme une tumeur de cellules souches Gene Therapy modèle basé sur
Dans cet article
Résumé
Résumé
De petits modèles animaux tels que des souris ont été largement utilisées pour étudier les maladies humaines et à développer de nouvelles interventions thérapeutiques. Malgré la richesse des informations obtenues à partir de ces études, les caractéristiques uniques de l'immunité de la souris ainsi que la spécificité d'espèce des maladies virales comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) a conduit au développement de modèles murins humanisés. Les modèles précédents impliquaient l'utilisation de C. B 17 scid / scid souris et la transplantation de l'homme thymus foetal et le foie du fœtus appelés ton / liv (SCID-hu) 1, 2 ou le transfert adoptif de l'homme leucocytes du sang périphérique (SCID-huPBL ) 3. Les deux modèles ont été principalement utilisés pour l'étude de l'infection par le VIH.
L'une des principales limites de ces deux modèles est le manque de reconstitution stable de cellules immunitaires humaines dans la périphérie pour en faire un modèle plus physiologiquement pertinente pour étudier la maladie du VIH. À cette fin, le bourdonnement BLTmodèle de souris anized a été développé. BLT est synonyme de moelle osseuse / foie / thymus. Dans ce modèle, de 6 à 8 semaine vieux NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) des souris immunodéprimées recevoir l'implant ton / liv comme dans le modèle de souris SCID-hu ne doit être suivie d'une deuxième transplantation de cellules souches hématopoïétiques humaines 4. L'avantage de ce système est la reconstitution complète du système immunitaire humain dans la périphérie. Ce modèle a été utilisé pour étudier l'infection à VIH et la latence 5-8.
Nous avons généré une version modifiée de ce modèle dans lequel nous utilisons génétiquement modifiés cellules souches hématopoïétiques humaines (HHSC) pour construire l'implant ton / liv suivie d'une injection autologue de transduction HHSC 7, 9. Cette approche se traduit par la génération de lignées génétiquement modifiées. Plus important encore, nous avons adapté ce système pour étudier le potentiel de générer des cellules fonctionnelles T cytotoxiques (CTL) exprimant un mélanome récepteur des cellules T spécifiques. En utilisant ce modèle, nous avons pu évaluer la fonctionnalité de notre CTL transgénique en utilisant en direct par émission de positrons (TEP) pour déterminer la régression tumorale (9).
L'objectif de ce protocole est de décrire le processus de génération de ces souris transgéniques et d'évaluer l'efficacité in vivo utilisant l'imagerie TEP en direct. Comme une note, car nous utilisons des tissus humains et les vecteurs lentiviraux, nos installations sont conformes aux directives du NIH pour la CDC de biosécurité de niveau 2 (BSL2) avec des précautions particulières (BSL2 +). En outre, les souris NSG sont gravement immunodéprimés par conséquent, leur logement et de maintenance doivent être conformes aux normes les plus élevées de santé ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocole
A. Production de souris BLT
La génération de souris BLT est divisé en trois (3) parties: (1) traitement de tissus fœtaux et la préparation du CD34 des cellules souches hématopoïétiques, (2) la transplantation de tissus humains, et (3) de greffe secondaire. Pour tous les protocoles, nous avons fourni le tableau 1 de l'information réactif.
1. Traitement des tissus et isolement de CD34 cellules souches hématopoïétiques humaines
Frais tissus fœtaux ou d'un tissu moins chere sur la glace de divers organismes d'approvisionnement en organes peuvent être utilisés. S....
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Résultats
Un diagramme du processus de transplantation est illustré à la figure 1A. Une image de l'implant ton / liv est montré dans la figure 1B. Le tissu thymique se développe normalement et a une distribution physiologique des humains CD4 et CD8 des lymphocytes T. Après reconstitution, les animaux sont porteurs d'un système immunitaire humain avec une distribution normale des CD4, CD8 des lymphocytes T et d'autres lignées de cellules immunitaires.
L'.......
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Discussion
Le modèle modifié BLT souris humanisée associée à l'imagerie TEP in vivo sont des outils puissants pour étudier les maladies chroniques de l'homme. Ce système prend le modèle de souris BLT et elle avance au-delà de la portée limitée de recherche sur le VIH. En outre, il est un grand système dans lequel nous pouvons examiner les divers protocoles de thérapie génique ainsi que des techniques de diagnostic avant qu'ils ne puissent atteindre le milieu clinique. Celui-ci couplée avec le faible coût de l&.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier Alvin et Larry Welch Pang pour leur assistance technique. Ce travail a été financé en partie par le National Institutes of Health (NIH) P50 CA086306 prix, le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) des subventions RC1-00149-1 et RS1-00203-1; prix CIRM Faculté Nouvelle-RN2 00902-1 , le Centre de Caltech-UCLA commun pour la médecine translationnelle, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, l'UCLA AIDS Institute, les outils du CIRM et du Prix de la technologie RT1-01126, et le Programme de recherche multicampus UC et initiatives de la Californie Centre de Découverte médicament antiviral (nombre MRPI-143226). <....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove | 12440061 | ||
| Sérum de veau foetal | 16000085 | ||
| Collagénase de type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Pipéracilline / tazobactam combinaison | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS tampon | Miltenyi Biotech | Voir les commentaires | MACS mémoire tampon: PBS supplémenté avec 0,5% de sérum de veau foetal et 2 mM de citrate dextrose formule-A |
| CD34 à micro-Kit | 130-046-702 | ||
| Colonnes LS | 130-042-401 | ||
| Rétronectine | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofène (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
Références
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A.
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