Application Notes

रिसेप्टर tyrosine kinase phosphorylation एंटीबॉडी का उपयोग में परिवर्तन की रूपरेखा - विज्ञापन

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Greta J. Wegner¹, David J. Finkel¹, Amy E. James¹, Richard A. Krzyzek¹

¹Array Group, Assay Department, R&D Systems, Inc.

Summary

Proteome Profiler एंटीबॉडी arrays रिसेप्टर tyrosine (RTK) kinase phosphorylation में परिवर्तन के लिए एक सुविधाजनक और लागत स्क्रीन करने के लिए कुशल कई (आईपी) immunoprecipitation Westerns प्रदर्शन के बिना जिस तरह से कर रहे हैं. एक एकल नमूना chemiluminescence का पता लगाने का उपयोग कर कई RTKs में गुणात्मक माप के लिए ARY001 मानव RTK सरणी की अनुमति देता है.

Abstract

रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK) अभिव्यक्ति और phosphorylation dysregulation अक्सर कैंसर कोशिकाओं के विकास और metastatic प्रसार के साथ जुड़ा हुआ है ^1-3 महत्वपूर्ण प्रयास है. विकासशील inhibitors पर ध्यान केंद्रित किया गया विशिष्ट RTKs लक्ष्य और न्यायपालिका सिगनल रोग राज्यों के साथ जुड़े रास्ते अंतरायन ^4-7 इस अध्ययन का उद्देश्य. RTK phosphorylation पर inhibitors के एक नंबर का चयन के प्रभाव को मापने के लिए किया गया था. इस अध्ययन में मानव सरणी Phospho RTK है, जो एक झिल्ली आधारित सैंडविच phosphorylation में एक एकल नमूना में कई RTKs के लिए बढ़ जाती है या कम हो जाती है एक साथ की निगरानी immunoassay है इस्तेमाल किया. इस परख में, दोनों phosphorylated और unphosphorylated RTKs एक lysate नमूना में मौजूद असतत एक nitrocellulose झिल्ली एक खुर्दबीन स्लाइड के आकार भर में दो प्रतियों में मुद्रित एंटीबॉडी द्वारा कब्जा कर रहे हैं. धोने के बाद, arrays विरोधी phospho-tyrosine हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के साथ incubated हैं,phosphorylated सरणी पर कब्जा कर लिया RTKs के साथ सैंडविच है. एक दूसरे कदम धोने के बाद, सरणियाँ chemiluminescent अभिकर्मकों के साथ incubated हैं. प्रत्येक सरणी स्थान पर उत्पन्न सिग्नल phospho प्रोटीन की राशि प्रत्येक कब्जा एंटीबॉडी द्वारा बाध्य करने के लिए आनुपातिक है. इन प्रयोगों में, सरणियाँ एमडीए MB-453 या तो स्तन कैंसर या KATO III गैस्ट्रिक कार्सिनोमा कोशिकाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए phosphorylation में ErbB की ओर चयनात्मक inhibitors के साथ कोशिकाओं के उपचार के साथ जुड़े कम हो जाती है विशेषताएँ ligand उत्तेजना के बाद phosphorylation में वृद्धि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया या FGF आर परिवार के सदस्यों को.

Protocol

1. नमूना तैयार

अनुपचारित, ligand इलाज, या अवरोध करनेवाला और मानव सरणी Phospho RTK datasheet में दिशा निर्देशों का पालन ligand इलाज किया कोशिकाओं से lysates ले लीजिए. lysis बफर इस किट के लिए अनुकूलित किया गया है. अन्य lysis buffers की प्रतिस्थापन सरणी के अंतिम प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है. Proteolytic नमूना क्षरण को रोकने के लिए, 10 ग्राम / एमएल Aprotinin, 10 ग्राम / मिलीलीटर Leupeptin, और 10 / ग्राम मिलीलीटर Pepstatin lysis बफर प्रत्येक सेल lysate प्रत्येक उपयोग के लिए नए सिरे से तैयार करने के लिए आवश्यक की मात्रा जोड़ने.
Lysate एकाग्रता एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख का उपयोग कर मापा जाना चाहिए. नमूना एकाग्रता empirically इष्टतम संवेदनशीलता और कम पृष्ठभूमि के लिए समायोजित किया जा सकता है. Lysate की 100-300 ग्राम की एक श्रेणी एक प्रारंभिक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सिफारिश की है.
रुक / नमूनों के के गल चक्र और बचा जाना चाहिए lysates की उचित भंडारण अनुकूलतम प्रदर्शन के लिए आवश्यक है. बर्फ पर जमी lysate नमूने पिघलना के.

उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए किट घटकों लाओ. संक्रमण से बचने के लिए, दस्ताने पहनते हैं, जबकि प्रक्रियाओं के प्रदर्शन.
पिपेट 4 ही बहु पकवान की एक अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा में ऐरे 1 बफर के 2.0 मिलीलीटर. ऐरे 1 बफर एक ब्लॉक बफर के रूप में कार्य करता है.
फ्लैट टिप चिमटी का उपयोग करना, प्रत्येक सुरक्षात्मक शीट और 4 खैर पकवान मल्टी के एक कुएं में जगह के बीच से इस्तेमाल किया जा झिल्ली को हटा दें. सरणी संख्या ऊपर का सामना किया जाना चाहिए.
ऐरे 1 बफर के साथ संपर्क करने पर, स्पॉट से नीले डाई गायब हो जाते हैं, लेकिन कब्जा एंटीबॉडी अपनी विशिष्ट स्थानों में बनाए रखा जाएगा.
एक कमाल मंच पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. ओरिएंट ट्रे इतनी है कि प्रत्येक सरणी चट्टानों अंत इसकी अच्छी तरह से समाप्त करने के लिए. सरणी की सतह पूरी तरह से हो सकता है और गीला चाहिए ब्लॉक बफर से कवर किया.
जबकि झिल्ली को अवरुद्ध कर रहे हैं, ऐरे 1 बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा सेलुलर lysate की वांछित मात्रा में पतला.
2-8 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक कमाल मंच पर सेते हैं. अगर इष्टतम संवेदनशीलता की आवश्यकता नहीं है एक छोटा ऊष्मायन समय इस्तेमाल किया जा सकता है.
ध्यान से 4 ही बहु पकवान और जगह से व्यक्तिगत प्लास्टिक के कंटेनर में 1X धो बफर के 20 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक झिल्ली को हटा दें. 4 खैर मल्टी पकवान धोने चरणों को पूरा करने के लिए नहीं किया जा सकता है. विआयनीकृत या आसुत जल के साथ 4 ही बहु पकवान कुल्ला और अच्छी तरह से सूखे.
1X धो बफर के साथ एक कमाल मंच हिलनेवाला पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक झिल्ली धो लें. 3 washes के एक कुल के लिए दो बार दोहराएँ.
1X सरणी बफर में विरोधी phospho-tyrosine हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) का पता लगाने बफर पतला 2 शीशी लेबल पर कमजोर पड़ने कारक का उपयोग. पिपेट पतला समाधान के 2.0 मिलीलीटर 4 खैर पकवान मल्टी प्रत्येक कुएं में.
ध्यान अपने धोने कंटेनर से प्रत्येक झिल्ली को हटा दें.अतिरिक्त बफर की अनुमति देने के लिए झिल्ली से पलायन के लिए और 4-खैर पतला विरोधी phospho-tyrosine एचआरपी युक्त मल्टी पकवान झिल्ली वापस. ढक्कन के साथ कवर कुओं.
एक कमाल मंच पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
प्रत्येक सरणी के रूप में पहले से वर्णित धो लें.
बिना किसी रुकावट के बचे हुए चरणों को पूरा करें. ध्यान अपने धोने कंटेनर से प्रत्येक झिल्ली को हटा दें. अतिरिक्त बफर झिल्ली से शोषक कागज पर निचले किनारे सोख्ता द्वारा पलायन करने की अनुमति दें. पहचान संख्या का सामना करना पड़ रहा है के साथ एक प्लास्टिक शीट रक्षक पर प्रत्येक झिल्ली रखें.
पिपेट तैयार Chemi अभिकर्मक के 1 मिलीग्राम प्रत्येक झिल्ली पर समान रूप से मिश्रण. कम से कम 1 मिलीग्राम प्रति Chemi झिल्ली अभिकर्मक मिक्स का उपयोग अधूरा झिल्ली कवरेज में हो सकता है. Chemi 1 और 2 अभिकर्मकों के लिए कुछ उच्च तीव्रता chemiluminescent अभिकर्मकों का प्रतिस्थापन भी बढ़ पृष्ठभूमि या कम अभिकर्मक के आधार पर संकेत के कारण हो सकता है.
ध्यान से एक प्लास्टिक के साथ कवरचादर रक्षक. धीरे बाहर किसी भी हवाई बुलबुले चिकनी और यह सुनिश्चित करें Chemi अभिकर्मक मिक्स समान रूप से प्रत्येक झिल्ली के सभी कोनों में फैल रहा है. 1 मिनट के लिए सेते हैं.
स्थिति शीर्ष और प्लास्टिक शीट झिल्ली युक्त रक्षक के पक्ष पर कागज तौलिए और ध्यान से बाहर अतिरिक्त Chemi अभिकर्मक मिक्स निचोड़.
ऊपर प्लास्टिक की चादर रक्षक निकालें और ध्यान रखना एक शोषक प्रयोगशाला के लिए रवाना किसी भी शेष Chemi अभिकर्मक मिक्स दाग झिल्ली के शीर्ष पर पोंछ.
नीचे प्लास्टिक शीट रक्षक पर झिल्ली छोड़कर, प्लास्टिक की चादर के देखभाल करने के लिए धीरे से बाहर किसी भी हवाई बुलबुले चिकनी झिल्ली के साथ कवर किया. चादर रक्षक इतना है कि झिल्ली और चादर रक्षक पूरी तरह से लपेट कर रहे हैं के पीछे के आसपास अतिरिक्त प्लास्टिक की चादर के लपेटें.
पहचान संख्या के साथ ऊपर का सामना करना पड़ झिल्ली है कि रेडियोधर्मी आइसोटोप का पता लगाने के साथ प्रयोग किया जाता है एक autoradiography फिल्म कैसेट में रखें.
1-10 मिनट के लिए कोडक BioMax लाइट फिल्म को बेनकाब. कई जोखिम recommसमाप्त हो गया. वैकल्पिक रूप से, छवियों Carestream स्वास्थ्य के रूप में एक chemiluminescence संगत imager का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है छवि स्टेशन 4000mm प्रो.

3. डेटा विश्लेषण

सकारात्मक विकसित फिल्म पर देखा संकेतों जल्दी सरणी छवि पर पारदर्शिता उपरिशायी रखने और इस उद्देश्य के लिए कोनों में मुद्रित संदर्भ स्पॉट के जोड़े के साथ aligning से पहचाना जा सकता है. सरणी पर मुद्रांकित पहचान संख्या छोड़ दिया था पक्ष पर रखा जाना चाहिए. नियंत्रण और कब्जा एंटीबॉडी के स्थान मानव सरणी Phospho RTK datasheet के परिशिष्ट में सूचीबद्ध है.
विकसित फिल्म पर पिक्सेल घनत्व Epson पूर्णता V750 के समर्थक के रूप में इस तरह के एक स्कैनर संचरण मोड का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है.
सरणी के प्रत्येक स्थान एक उपयुक्त इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग में पिक्सेल घनत्व का विश्लेषण करने के लिए एक टेम्पलेट बनाएँ. संगत कार्यक्रमों जीई से ImageQuant या ArrayVision सॉफ्टवेयर, पश्चिमी विजन sofProfiler Arrays, मात्रा BioRad एक, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, और प्रोटीन सरल AlphaView proteome विशिष्ट टेम्पलेट के साथ tware.
Microsoft एक्सेल जैसे एक कार्यक्रम में हेरफेर करने के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल निर्यात संकेत मूल्यों.
डुप्लिकेट प्रत्येक RTK का प्रतिनिधित्व स्थलों में से एक जोड़ी के औसत संकेत (पिक्सेल घनत्व) का निर्धारण करते हैं.
हर जगह से एक औसत पृष्ठभूमि संकेत घटाना. सरणी या एक पृष्ठभूमि के मूल्य के रूप में नकारात्मक नियंत्रण स्पॉट के एक स्पष्ट क्षेत्र से एक संकेत का उपयोग करें.
अलग arrays पर इसी संकेतों तुलना RTK नमूने के बीच phosphorylation के स्तर में सापेक्ष परिवर्तन निर्धारित.

4. प्रतिनिधि परिणाम

इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे मानव सरणी Phospho RTK RTK phosphorylation पर ligand उत्तेजना और inhibitors के प्रभाव स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1 में डेटा एमडीए MB-453 कोशिकाओं है कि इलाज थे के लिए दिखाया गया है, 100 एनजी के साथ इलाज5 मिनट, या पूर्व ज्ञात ErbB परिवार ^8-11 पहले HRGβ1 उपचार inhibitors के साथ इलाज के लिए / एमएल rhNRG-β1/HRG-β1 (एचआरजी β1). अवरोध करनेवाला प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं 1 HDS 029, 200 +१५३०३५ पीडी एनएम, या तीन घंटे के लिए 200 में 158780 पीडी SFM एनएम सुक्ष्ममापी के साथ incubated रहे थे. प्रत्येक सरणी lysate की 100 ग्राम के साथ incubated किया गया था. Phosphorylation में वृद्धि ErbB2, ErbB3 के लिए मनाया जाता है, और ErbB4 पर कब्जा धब्बे जब एचआरजी - β1 साथ अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना एमडीए MB-453 कोशिकाओं का इलाज किया. सभी तीन ErbB परिवार पहले एचआरजी β1 ऊष्मायन चयनात्मक inhibitors के साथ कोशिकाओं के उपचार ErbB2 में कटौती, ErbB3, और ErbB4 phosphorylation के कारण होता है.

चित्रा 2 में, डेटा Kato III RTK FGF R2 overexpress जाना जाता कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है. प्रयोगों के इस सेट में, Kato III कोशिकाओं अनुपचारित थे, के साथ इलाज के लिए पहले 100 एनजी / एमएल rhFGF अम्लीय (FGF) और 1 / ग्राम मिलीलीटर हेपरिन, या FGF आर चयनात्मक inhibitors के साथ ^12-15 pretreated के साथ इलाजFGF और हेपरिन. inhibitors PD173074, पीडी 161570, 166285 और पीडी 1 सुक्ष्ममापी की एक एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया और सीरम मुक्त मीडिया में 3 घंटे के लिए Kato III कोशिकाओं के साथ incubated. जबकि वहाँ दोनों EGF अनुसंधान और इलाज KATO III कोशिकाओं में FGF R2 के विधान phosphorylation, FGF R2 phosphorylation में एक वृद्धि FGF उपचार पर मनाया गया. है 173074 पीडी के साथ कोशिकाओं Incubating, 161570, पीडी, या 166285 पीडी FGF R2 और EGF आर phosphorylation में कमी के परिणामस्वरूप. हालांकि इन inhibitors FGF आर परिवार के सदस्यों की phosphorylation को प्रभावित जाना जाता है, इन परिणामों प्रभाव अवरोध करनेवाला का एक विशिष्ट एकाग्रता EGF आर के रूप में अन्य, इस मामले में RTKs पर हो सकता है की निगरानी के लिए मानव सरणी Phospho RTK की उपयोगिता प्रदर्शित करता है.

चित्रा 1. प्रेरण और रेसेप के निषेधटो स्तन कैंसर की कोशिकाओं में tyrosine kinase phosphorylation Proteome Profiler मानव Phospho RTK arrays और इसी हिस्टोग्राम प्रोफाइल से सरणी चित्र दिखाए जाते हैं. एमडीए MB-453 कोशिकाओं अनुपचारित या RTK inhibitors NRG-β1/HRG-β1 के साथ इलाज के द्वारा पीछा के साथ इलाज किया गया. सरणी एमडीए MB-453 कोशिकाओं में kinase phosphorylation पर inhibitors के प्रभाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. प्रेरण और गैस्ट्रिक कैंसर की कोशिकाओं में रिसेप्टर tyrosine kinase phosphorylation के निषेध एक Proteome Profiler मानव सरणी phospho-RTK और इसी हिस्टोग्राम प्रोफाइल से सरणी चित्र दिखाया जाता है. Kato III कोशिकाओं unt थेreated या RTK FGF अम्लीय और हेपरिन के साथ इलाज के बाद inhibitors के साथ इलाज किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

मानव Phospho RTK (आईपी) RTK phosphorylation में स्क्रीनिंग परिवर्तन के लिए पश्चिमी immunoprecipitation जैसे पारंपरिक तरीकों के लिए एक किफायती और तेजी से विकल्प है. इस पद्धति का उपयोग करके, 42 phospho RTKs के रिश्तेदार का स्तर एक साथ जांच की गई एमडीए MB-453 या Kato III सेल lysate का एक नमूना का उपयोग. इसके अलावा, इस सरणी परख 2.5 घंटा हाथों पर समय की आवश्यकता है, इस विधि एकाधिक आईपी Westerns प्रदर्शन से दूर समय प्रभावी बनाने. एक chemiluminescence विधि का पता लगाने के द्वारा रोजगार, जो आम तौर पर पश्चिमी डेटा एकत्र करने के लिए प्रयोग किया जाता है परे कोई विशेष उपकरण के लिए आवश्यक था. Arrays संवेदनशील होते हैं और दोनों ligand और अवरोध करनेवाला उपचार की वजह से phosphorylation में परिवर्तन की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि भी अवरोध करनेवाला बंद लक्ष्य RTKs चयनात्मकता के मूल्यांकन की अनुमति देता है. सकारात्मक हिट आगे एक एलिसा के रूप में एक मात्रात्मक परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है.

को प्रभावी ढंग से परिवर्तन के लिए स्क्रीन arrays रोजगारphosphorylation में कुछ महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक दिशा निर्देशों का पालन किया जाना चाहिए. सबसे पहले, प्रयोगों उचित नियंत्रण के नमूने शामिल करना चाहिए. उदाहरण के लिए, इन प्रयोगों में एमडीए MB-453 या Kato III lysates inhibitors के प्रभाव lysate उसी दिन पर तैयार नमूनों पर मापा गया. केवल सरणी डेटा है कि एक ही प्रयोग में एकत्र किया जाता है नमूना हैंडलिंग, ऊष्मायन समय में मतभेद, pipet तकनीक, या धोने तकनीक की वजह से संकेत में बदलाव को कम करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए. एक ही झिल्ली पर दो analytes के बीच तुलना संकेत तीव्रता की सिफारिश नहीं है, के बाद से कब्जा एंटीबॉडी समानांतर समानताएं हैं के लिए चयनित नहीं किया गया है.

Acknowledgments

इस काम के आर एंड डी सिस्टम्स इंक, द्वारा वित्त पोषित किया गया था

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.