Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

Sunandan Saha; Yozo Nakazawa; Leslie E. Huye; Joseph E. Doherty; Daniel L. Galvan; Cliona M. Rooney; Matthew H. Wilson

doi:10.3791/4235

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Article de méthode

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

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DOI :

10.3791/4235

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5 novembre 2012

Sunandan Saha¹^,² , Yozo Nakazawa³ , Leslie E. Huye⁴^,⁵ , Joseph E. Doherty²^,⁶ , Daniel L. Galvan² , Cliona M. Rooney⁴^,⁵^,⁷ , Matthew H. Wilson¹^,²^,⁴^,⁸

¹Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine , ²Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine , ³Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, ⁴Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine , ⁵Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine , ⁶Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine , ⁷Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine , ⁸Michael E. DeBakey VA Medical Center

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement des cellules T humaines primaires avec un transgène en utilisant la non-virale PiggyBac Transposon système. Lymphocytes T modifiés à l'aide de la PiggyBac Transposon exposition expression du transgène système stable.

Résumé

Le système piggyBac transposon est active par sa nature, l'origine dérivé de la ^1,2 arpenteuse du chou papillon. Ce système non viral est un plasmide à base, le plus souvent en utilisant deux plasmides avec une expression de l'enzyme transposase piggyBac et un transposon plasmide hébergeant le gène (s) d'intérêt entre répétées inversées d'éléments qui sont nécessaires à l'activité de transfert de gène. PiggyBac transfert de gènes par médiation un "couper et coller" mécanisme par lequel la transposase intègre le segment de transposon dans le génome de la cellule cible (s) d'intérêt. PiggyBac a démontré l'efficacité de délivrance de gènes activité dans une large gamme de ^1,2 insecte, de mammifère ^3-5, et humaine cells6 y compris les cellules T humaines primaires ^7,8. Récemment, une transposase hyperactive piggyBac a été générée en améliorant l'efficacité de transfert de gènes ^9,10.

Lymphocytes T humains sont des intere cliniqueer pour l'immunothérapie adoptive du cancer ^11. Fait à noter, le premier essai clinique impliquant une modification transposon des lymphocytes T humains en utilisant le système Sleeping beauty transposon a été approuvée le ^12. Nous avons déjà évalué l'utilité de piggyBac comme une méthode non virale pour la modification génétique de cellules T humaines. Nous avons trouvé piggyBac pour être efficace dans la modification génétique de cellules T humaines avec un gène rapporteur et un gène non immunogène inductible suicide ^7. L'analyse des sites d'intégration génomique a révélé un manque de préférence pour une intégration dans ou à proximité connues proto-oncogènes ^13. Nous avons utilisé piggyBac de gènes modifient les lymphocytes T cytotoxiques pour réaliser un récepteur d'antigène chimérique dirigé contre l'antigène tumoral HER2, et a trouvé que le gène modifiés lymphocytes T médié assassinat ciblé de HER2-positives cellules tumorales in vitro et in vivo dans un modèle de souris orthotopique ^14. Nous avons également utilisé piggyBacpour générer des cellules T humaines résistantes à la rapamycine, qui devraient être utiles dans les thérapies du cancer, où la rapamycine est utilisée ^15.

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser piggyBac de modifier génétiquement les cellules T humaines primaires. Ceci inclut l'isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain suivie par la culture, la modification génétique, et l'activation des cellules T. Aux fins du présent rapport, les cellules T ont été modifiées avec un gène rapporteur (eGFP) pour l'analyse et la quantification de l'expression génique par cytométrie en flux.

PiggyBac peuvent être utilisées pour modifier des cellules T avec une variété de gènes d'intérêt. Bien que nous ayons utilisé piggyBac de diriger les lymphocytes T aux antigènes tumoraux ^14, nous avons également utilisé piggyBac d'ajouter un interrupteur de sécurité inductible afin d'éliminer les cellules gènes modifiés si nécessaire ^7. La capacité de chargement importante de piggyBac a également permis le transfert de gènes deune molécule de rapamycine grande résistance mTOR (15 ko) ^15. Par conséquent, nous présentons une méthodologie non-virale pour le gène-modification stable de cellules T humaines primaires pour une large variété de fins.

Protocole

Jour 0

1. Isolation des PBMC à partir de sang humain

Recueillir 20 ml de sang humain frais en utilisant ponction veineuse dans des tubes Vacutainer Na-héparine.
Mélanger le sang et avancée RPMI 1640 en 1:1 (v / v).
Ajouter 20 ml Lymphoprep moyen d'un tube à centrifuger de 50 ml (25 ° C). Lentement couche de 25-30 ml de sang RPMI 1640 mélange sur le dessus du Lymphoprep.
Centrifuger à 400 xg pendant 40 min sans freins.
Recueillir les deux couches distinctes et floue à l'aide d'une pipette jetable dans 10 ml de PBS 1x (25 ° C) et porter le volume à 50 ml avec du PBS 1x.
Centrifuger à 450 xg pendant 10 min.
Aspirer le surnageant et ajouter 20 ml de RPMI 1640 avancée.
Centrifuger à 400 xg pendant 5 min.
Aspirer le surnageant. Ajouter 10 ml de milieu complet de lymphocytes T additionné de 5 ng / ml rhIL-15 préchauffé à 37 ° C.
Compter le nombre de cellules et la plaque en 24 manteau de culture de tissus ainsied plaque à 2 x 10 ⁶ cellules / puits dans les médias complets de lymphocytes T supplémenté avec 5 ng / ml rhIL-15 Ajouter de l'eau stérile pour puits environnants. Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO _2.

Jour 1

2. Les plaques de revêtement avec un anticorps anti-CD28 et anti-CD3 pour stimuler les lymphocytes T

Diluer anticorps anti-CD28 et anti-CD3 dans de l'eau stérile à une concentration de 1 pg / ml.
Ajouter 500 ul de solution d'anticorps à chaque 5 puits marqués d'une culture de tissu non enduit plaque à 24 puits.
Ajouter de l'eau stérile pour se reposer des puits. Enveloppez la plaque dans une pellicule rétractable et placer au réfrigérateur 4 ° C.

3. Nucléofection de cellules T non stimulés

Préchauffer médias lymphocytes T à 37 ° C et un supplément de 5 ng / ml de rhIL-15. Préparer une solution complète Nucleofector en ajoutant 500 ul de supplément Nucleofector 1 à 2,25 ml de solution Nucleofector.
Aliquot 5 ug chacun des transposon (Zeo-pT-CMV-eGFP) et la transposase (pCMV-piggyBac) dans un tube de 1,5 ml. Remarque: il peut être nécessaire d'optimiser la transposase et la quantité d'ADN du transposon pour la livraison génique optimale et de minimiser toxicité cellulaire. Les plasmides peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande.
PBMC récolte de la plaque 24 tissus et la culture dans un tube de 50 ml. Compter le nombre de cellules. Enregistrer 2 x 10 ⁶ cellules pour une utilisation en tant que commande au cours de la cytométrie en flux.
Ajouter 7-10 x 10 ⁶ cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger à 400 xg, 5 min, aspirer le surnageant et le doigt du coup de la pastille.
Ajouter 100 ul de cellules T nucléofection solution complète à la cellule desserré granulés.
Ajouter le mélange de solution de cellules dans le tube contenant les plasmides.
Ajouter le mélange de solution de cellule de plasmide au fond de la cuvette nucléofection. Veillez à ne pas introduire de bulles.
Nucleofect les cellules en utilisant programme U-014 (cellules T non stimulés, l'homme, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
Immédiatement ajouter 500 ul de médias préchauffé avec rhIL-15 à la cuvette. Transférer les cellules à un puits d'une plaque à 24 puits avec 1,5 ml de milieu préchauffé à rhIL15.
Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO _2.

Jour 2

4. La stimulation non spécifique des cellules T

Récolte des cellules et de déterminer le nombre de cellules. Annuler 0,5 x 10 ⁶ cellules par cytométrie en flux pour déterminer la fréquence de cellules GFP-positives. Utilisez les PBMC non transfectées comme témoins.
Aspirer la solution CD3/28 anticorps de la plaque de culture de tissu non enduit et rincer chaque puits avec les médias de lymphocytes T.
Remettre en suspension les cellules nucleofected à 0,5 x 10 ⁶ cellules par ml dans les médias complets CTLadditionné de 5 ng / ml de rhIL-15. Ajouter 2,0 ml de chacune des cellules nucleofected à 4 puits de la plaque de culture de tissus non. Ajouter 0,5 x 10 ⁶ cellules non nucleofected ^au 5 bien.
Incuber pendant 3 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO _2.

Jour 5

Récolter les cellules T stimulées à partir de la plaque non revêtue de la culture tissulaire.
Compter et Réensemencement les cellules dans un 24 plaque de culture tissulaire pour bien les enrober à 0,7 x 10 ⁶ cellules / ml dans un milieu de lymphocytes T avec 5 ng / ml d'IL-15.

Jour 7

7. L'analyse de l'expression des gènes

Cellules de récolte et se colorent avec anti-humain CD8 (peut également utiliser l'anti-CD3 et anti-CD4) et d'analyser avec la cytométrie en flux pour l'expression de la GFP%.

Jour 8 (Facultatif)

8. L'expansion des cellules T

Le jour 8 après transfection, les cellules T peuvent être réensemencées en TDes cellules support avec l'IL-15 à une densité de 0,7 x 10 ⁶ cellules par puits d'une nouvelle expansion ^16.