Une méthode pratique et roman d'extraire l'ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Résumé

Nous décrivons une nouvelle méthode d'isolement de l'ADN génomique à partir de sang total prélevé pour plasma / sérologie. Après la collecte de plasma, le sang compacté est habituellement jeté. Notre nouvelle méthode représente une amélioration significative par rapport aux méthodes existantes et rend l'ADN et plasma disponibles à partir d'une collection unique, sans demander de sang supplémentaire.

Résumé

Les tests de laboratoire peuvent être effectués sur les parties cellulaires ou de liquide du sang. L'utilisation de différents tubes de prélèvement de sang détermine la portion du sang pouvant être analysé (sang total, le plasma ou le sérum). Les laboratoires impliqués dans l'étude de la base génétique des maladies humaines s'appuient sur sang total anticoagulant recueillies dans Vacutainer contenant de l'EDTA comme source d'ADN pour analyse génétique / génomique. Parce que la plupart des laboratoires cliniques effectuent des tests biochimiques, sérologiques et virales comme une première étape dans l'enquête de résultat phénotypique, le sang coagulé sont aussi recueillis dans un tube contenant de l'héparine (tube à plasma). Par conséquent, lorsque l'ADN et de plasma sont nécessaires pour des analyses simultanées et parallèles de données à la fois génomiques et protéomiques, il est de coutume pour recueillir le sang dans les deux tubes EDTA et l'héparine. Si le sang peut être recueilli dans un seul tube et servir de source pour le plasma et l'ADN, cette méthode serait considérée comme un avancement à l'existant methSAO. L'utilisation du sang compactée après l'extraction du plasma représente une autre source d'ADN génomique, ce qui réduit la quantité d'échantillons sanguins traitées et de réduire le nombre d'échantillons requis pour chaque patient. Ce serait finalement gagner du temps et des ressources.

Le système de collecte de sang P100 BD pour la préservation de protéines plasmatiques a été créé comme un procédé amélioré au plasma précédente ou la collecte du sérum tubes ^1, pour stabiliser la teneur en protéines du sang, ce qui permet une meilleure découverte des biomarqueurs protéiniques et protéomique expérimentation à partir de sang humain. Le P100 tubes BD contiennent 15,8 ml de K2EDTA atomisé et un cocktail à large spectre propriétaire lyophilisée d'inhibiteurs de protéase pour éviter la coagulation et de stabiliser les protéines plasmatiques. Elles comprennent également un séparateur mécanique, ce qui constitue une barrière physique entre le plasma et les culots cellulaires après centrifugation. Peu de méthodes ont été mises au point pour extraire l'ADN à partir de sang coagulé SAmples recueillis dans des tubes de plasma vieux ^2-4. Défis de ces méthodes ont été principalement associés avec le type de séparateur à l'intérieur des tubes (séparateur gel) et comprenaient des difficultés à récupérer le sang coagulé, les inconvénients de la fragmentation ou la dispersion du caillot et l'obstruction de l'extraction caillot par le gel de séparation.

Nous présentons la première méthode qui extrait et purifie l'ADN génomique à partir de sang prélevé dans les nouveaux tubes P100 BD. Nous comparons la qualité de l'échantillon d'ADN de P100 tubes à celle des tubes EDTA. Notre approche est simple et efficace. Elle comporte quatre grandes étapes, comme suit: 1) l'utilisation d'un plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tubes avec séparateur mécanique pour la collecte de sang, 2) la suppression du séparateur mécanique à l'aide d'une combinaison de saccharose et un stérile trombone métallique crochet, 3) la séparation de la couche leuco-plaquettaire contenant les globules blancs et 4) l'isolement de l'ADN génomique à partir de l'couche leuco-plaquettaire en utilisant un kit d'extraction d'ADN commercial régulier ou d'un protocole standard similaire.

Protocole

1. Prélèvement

1. Prélever des échantillons de sang de personnes atteintes de consentement éclairé adéquat. Pour chaque individu, tirage 4 à 5 ml de sang dans un tube P100 (BD Diagnostics, le lac Franklin, NY, USA). Aux fins de comparaison, recueillir simultanément sang dans un tube EDTA.
2. Le P100 tubes BD contiennent 15,8 ml K2EDTA atomisé et un cocktail à large spectre propriétaire lyophilisée d'inhibiteurs de protéase pour éviter la coagulation et de stabiliser les protéines plasmatiques. Ils contiennent également un séparateur mécanique. Après avoir recueilli le sang total, maintenir les deux tubes à la température ambiante pendant 60 minutes....

Résultats

évaluation de la qualité de l'ADN et la mesure de la concentration

Les rendements des P100_DNAs étaient significativement inférieurs à ceux des EDTA_DNAs (tableaux 1 et 2). La pureté d'ADN représentée par sa valeur du rapport 260/280 est similaire pour les deux P100_DNA et ensemble d'échantillons EDTA_DNA (tableaux 1 et 2). La qualité de l'ADN est assez uniforme dans chaque ensemble de l'échantillon, bien qu.......

Discussion

De nombreuses maladies humaines ont des causes génétiques et explorer la base génétique des maladies humaines exige une augmentation de l'ADN de haute qualité. La source la plus commune de l'ADN utilisée dans les études génétiques anticoagulant du sang total. Parce que la plupart des laboratoires cliniques effectuent des tests biochimiques, sérologiques et virales comme une première étape dans l'enquête de résultat phénotypique, le sang est souvent recueillie dans un tube à plasma. Après le prélèvement du pl.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes BD P100	BD Diagnostics	366448
Tubes EDTA	BD Diagnostics	367863
Saccharose	Sigma	S9378
Trombone	Produit de bureau
Tubes de 15 ml	Corning	430052
Hématies (GBR)	Qiagen	158389 (kit)
Solution tampon phosphate (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
Kit BioSprint 96 ADN Blood (48)	Qiagen	940054
Microtubes de 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
Kit Human Immuno DNA Analysis BeadChip	Illumina	WG-352-1001
Lecteur de puces à billes	Illumina	NA
Logiciel GenomeStudio	Illumina	N/A