Cet article décrit une méthode par laquelle on peut imiter In vivo Le développement de la Drosophila dans un Ex vivo.
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Article de méthode
La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous décrivons une méthode pour la culture ex vivo du cerveau chez la drosophile entiers. Ceci peut être utilisé comme un contrepoint à des manipulations génétiques chroniques pour étudier la biologie cellulaire et le développement des structures cérébrales centrales en permettant des interventions pharmacologiques aigus et d'imagerie en direct des processus cellulaires. Comme un exemple de la technique, avant de travailler à partir de notre laboratoire 1 a montré que d'un compartiment non comptabilisé antérieurement subcellulaire se situe entre les compartiments axonaux et somato d'axones du cerveau chez la drosophile centrale. Le développement de ce compartiment, appelé le segment initial de l'axone (AIS) 2, a été montré génétiquement dépendre de la kinase spécifique des neurones cycline-dépendantes, Cdk5. Nous montrons ici que le traitement ex vivo du cerveau chez la drosophile de type sauvage larvaires avec la roscovitine Cdk5-pharmacologique spécifique et les inhibiteurs de olomoucine 3 provoque des changements dans l'organisation aigus actine, etdans la localisation de la protéine de surface cellulaire Fasciclin 2, qui imitent les changements observés chez les mutants qui n'ont pas Cdk5 activité génétiquement.
Un deuxième exemple de la technique de culture ex vivo est prévu pour le remodelage des connexions du corps champignons embryonnaire (MB) des neurones gamma lors de la métamorphose de la larve à l'adulte. Le corps du champignon est le centre de l'apprentissage olfactif et de la mémoire chez la mouche 4, et ces neurones gamma élaguer leurs branches axonales et dendritiques au cours du développement nymphal et puis re-branches s'étendent à un instant plus tard, pour établir le modèle innervation adulte 5. La taille de ces neurones de la MB a été démontré que la dégénérescence se produire via des branches locales neurites 6, par un mécanisme qui est déclenchée par l'ecdysone, une hormone stéroïde, agissant au niveau du récepteur d'ecdysone B1 7, et qui dépend de l'activité de la système ubiquitine-protéasome 6. Notre méthode de culture ex vivo peut be utilisé pour interroger davantage le mécanisme de remodelage de développement. Nous avons constaté que dans le cadre de la culture ex vivo, les neurones gamma de la MB a récapitulé le processus d'élagage de développement avec une évolution similaire à celle in vivo. Il était essentiel, cependant, attendre 1,5 heures après la formation puparium avant explantation du tissu pour que les cellules de commettre de façon irréversible à la métamorphose; la dissection des animaux au début de la nymphose a conduit à la métamorphose peu ou pas dans la culture. Ainsi, moyennant des modifications appropriées, l'approche ex vivo de la culture peut être appliquée à l'étude dynamique ainsi que les aspects de l'état d'équilibre la biologie du cerveau central.
Protocole
A. Préparation des médias
- Préparez le support complets par le filtre-stérilisation Drosophila de Schneider médias supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et 1% de pénicilline / streptomycine.
- Les médias devraient être préparées à chaque fois. Alternativement, une partie aliquote de la pré-congelés médias peuvent être décongelés avant chaque utilisation.
- Avant la mise en culture, ajouter 10 g / ml d'insuline et 2 pg / ml ecdysone aux médias. Les médicaments ont été préparés comme les stocks de concentrés et congelés dans de petites aliquotes. Aliquotes décongelées ne sont pas recongeler.
- Toutes les solutions de travail doit être maintenue à 25 ° C.
La culture de Brains larvaires
1. Sélection et dissection des cerveaux des larves
- Ajouter 500 ul de médias pour un insert de 12 mm Millicell culture cellulaire. Les cerveaux disséqués sera placé dans ces inserts pour faciliter immunomarquage facile.
- Ajouter une petite quantité de milieu préparé à un verre de montre de dissection.
- Uchanter une petite spatule, ramasser les larves de troisième stade errance et de les placer dans le verre de montre. (Nous présumons que la méthode culture ex vivo s'appliquerait aussi bien pour les larves de premier stade larvaire ou la deuxième, mais nous n'avons pas testé cela.)
- Tenir l'extrémité postérieure de la larve avec une paire de pince, ouvrir avec précaution jusqu'à l'extrémité antérieure avec une deuxième paire de pince n ° 5.
- Rapidement disséquer le cerveau, en gardant la corde nerveuse ventrale intacte.
2. La culture ex vivo de disséqués Brains larvaires
- En utilisant des pointes de pipette pré-humides, de transférer le cerveau avec précaution dans les inserts de culture cellulaire, les pré-remplis avec les médias.
- Cerveaux de transfert, dans les médias, à un incubateur à 25 ° C jusqu'à ce que le temps désiré-point est atteint. Cette méthode fonctionne efficacement pour un maximum de 48 heures dans la culture.
- Remplacer les médias à 8 heures. Au-delà de ce que, remplacer la moitié des médias toutes les 5-6 heures.
3. La manipulation pharmacologique deBrains larvaires
Cette méthode de culture ex vivo peuvent être utilisés pour corroborer pharmacologiquement interactions génétiques déjà démontré dans notre laboratoire 1.
- Ajouter 100 roscovitine uM et 100 uM olomoucine aux médias préparés.
- Transfert cerveaux disséqués à ce média.
- Cerveaux Culture à 25 ° C pendant 24 heures.
- Remplacer les médias à 8 heures. Au-delà de ce que, remplacer la moitié des médias (avec des médicaments) toutes les 5-6 heures.
La culture de Brains chrysalides
1. Sélection des pupes pour la dissection
- Marquer les pupes blanc sur les bouteilles ou flacons.
- Ne choisissez que les nymphes sont complètement blancs. Les pupes avec n'importe quelle sorte de coloration ne devrait pas être inclus.
- Cette étape est 0 heures après la formation Pupe (APF).
- Ces nymphes sera prêt pour la dissection de 1,5 heures après le marquage. Cette étape est cruciale pour assurer que la taille pour le développement survient dans l'ex vivo la culture.
2. Dissection de pupes
- Ajouter 500 ul de médias pour un insert de 12 mm Millicell culture cellulaire. (Les cerveaux disséqués sera placé dans ces inserts pour faciliter immunomarquage facile).
- Une fois le temps désiré-point a été atteint, ajouter une petite quantité de milieu préparé à un verre de montre de dissection.
- En utilisant une petite spatule humide, ramasser les pupes préalablement marqué pour la dissection et les placer dans le verre de montre.
- Tenir l'extrémité postérieure de la pupe avec une paire de pince, ouvrir avec précaution l'extrémité antérieure de l'affaire nymphe avec une deuxième paire de pince n ° 5.
- Rapidement disséquer le cerveau, en gardant la corde nerveuse ventrale intacte et fixée.
3. La culture ex vivo de disséqués Brains chrysalides
- Transfert du cerveau avec précaution dans les inserts de culture cellulaire, les pré-remplis avec les médias.
- Cerveaux de transfert, dans les médias, à un incubateur à 25 ° C jusqu'à la désirée de temps point est atteint. Nous avons utilisé cette méthode pour un maximum de 10 heures dans la culture de l'expérience le montre, mais il peut être étendu à de plus longues périodes d'observation et de traitement, si nécessaire.
- Pour le temps des points de plus de 8 APF heures, remplacer le support toutes les 5-6 heures.
A partir de cette étape, le protocole reste inchangé pour les larves et les nymphes.
B. Fixation Brains disséqués
- Une fois le temps désiré-point est atteint, retirer le support et ajouter 500 ul de formaldéhyde à 4% dans du PBS 1X avec 0,5% de Triton X-100 (PBST) pendant 30 minutes, en remplacement de frais avec du formaldéhyde après 15 minutes.
- Assurez-vous de ne pas laisser le cerveau à sécher tout en remplaçant les médias avec un fixateur.
- Laver formaldéhyde avec quatre 10 lavages minute de 1x PBS avec 0,5% TritonX-100 (PBST).
C. La coloration Brains fixes
- Après le formaldéhyde a été lavé, bloquer les cerveaux pendant 1 heure dans une solution de blocage de 1x PBS avec 1% normalDu sérum de chèvre et 1% de sérumalbumine bovine.
- Ajouter anticorps primaires réalisées dans une solution de blocage.
- Cerveaux incuber une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain matin, laver les anticorps primaires avec quatre 10 lavages minute de PBST.
- Ajouter Anticorps secondaires faites dans une solution de blocage.
- Laisser à température ambiante pendant 4 heures.
- Laver Anticorps secondaires avec quatre 10 lavages minute de PBST.
D. Montage Brains fixées et colorées pour la microscopie
- Equilibrer les cerveaux dans les médias Vectashield de montage pendant 1 heure.
- Montez les cerveaux sur lames de verre en utilisant les médias Vectashield de montage.
- Placez les éclats de verre de chaque côté du cerveau avant de monter la lamelle. Cela empêche le cerveau d'être écrasé, tout en gardant l'échantillon suffisamment mince pour analyser tous les plans focaux avec un microscope confocal. Brains étaient à peu près orientée lors du montage pour faciliter la visualisation des points d'intérêt. Lorsque cela est nécessaire,des images du cerveau ont été mis en rotation avec le logiciel Imaris pour fournir une vue optimale de la documentation et la mesure.
- Couvercle d'étanchéité glisse avec du vernis à ongles transparent.
- Magasin glisse abri de la lumière.
E. Les résultats représentatifs
La figure 1 montre un panel de troisième stade larvaire de cerveaux (A) de type sauvage mouches et (B) les mouches qui expriment un dérivé dominant négatif de Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Les deux expriment l'actine-GFP (green) dans les neurones gamma MB. Comme décrit précédemment (Trunova et al., 2011), il ya une région dans les axones proximaux de neurones gamma de type sauvage qui ne parvient pas à accumuler des actine-GFP, ce qui apparaît-elle comme une «zone claire» (A, support), et fasciclin 2 protein (rouge) s'accumule dans les axones que jusqu'à la frontière de cette zone ventrale (ligne blanche horizontale). La ligne en pointillé dans le troisième panneau de la figure 1 (A) indique la position de la MB, en soulignant l'actedans la «zone claire» et son bord ventral. Dans exprimant mouches Cdk5DN, la zone claire est absent actine (B) et deux Fasciclin (FasII) immunoréactivité s'étend à travers cette région dorsale. (Notez que des nombres variables de FasII positif du projet axones horizontalement à travers le Mo; ce ne sont pas pertinentes pour le phénotype). La barre d'échelle représente 20 um.
Grâce à notre méthode de culture ex vivo, nous avons traité des mouches de type sauvage avec une combinaison de roscovitine et olomoucine, des inhibiteurs pharmacologiques de Cdk5 activité. La figure 2 montre un panel de troisième stade larvaire cerveaux de contrôle (A) et traités par le médicament (B ) de type sauvage. mouches Semblable à mouches exprimant un dominant négatif Cdk5 construction, les cerveaux traités avec des inhibiteurs de cdk5 pour 24 heures, montrent la perte caractéristique de l'actine zone claire et une rupture dans la limite FasII (entre crochets). Des lignes blanches montrent la position de type sauvage limite FasII. La barre d'échelle représente 20 um.
Figure 3 montre une série représentative de corps pédonculés drosophile de 0-10 heures du CSA, marqué par une membrane-cible mCD8-GFP (green). Les parenthèses indiquent le calice, qui est, les projections dendritiques de la MB. Avant la métamorphose, on peut voir les axones MB coursing dorso-ventralement en faisceaux épais, ainsi que d'une «brume» du signal fluorescent provenant de la dendritique dense arbre (support). Panneau de cerveaux A spectacles disséqués à l'heure indiquée. Notez la taille des dendrites dans la région indiquée par les parenthèses, de telle sorte que par 6-8 heures CSA, la brume du signal dendritique est parti (si le signal n'est pas affecté axonale). Brains dans le panneau B ont été disséqués à 0 heures CSA, avant le pic interne ecdysone (Truman et Riddiford, 2002), et cultivés ex vivo comme indiqué. Ceux-ci révèlent pas d'élagage de développement des dendrites, mais plutôt le signal dendritique persiste à 10 heures du CSA. Pour contourner cela, les nymphes sont marqués à 0 APF heures, mais disséqués à 1,5 heures CSA et cultivé. Vitrel C montre une série représentative de ces corps pédonculés drosophile de 0-10 APF heures. Comme dans les échantillons non-cultivées, le signal dendritique est indétectable par 8 heures CSA. La barre d'échelle représente 20 um.
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Discussion
Chroniques les manipulations génétiques de la structure des tissus et la fonction, y compris les mutations et l'expression des transgènes, produisent typiquement une combinaison d'effets immédiats et tardifs conséquences indirectes qui peuvent être très difficiles à séparer. En complément des méthodes génétiques à la pharmacologie peut faciliter les interrogatoires de l'évolution dans le temps derrière un phénotype. Par exemple, cela a été une approche puissante pour disséquer les contributions des dif...
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour leurs conseils, discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Nous aimerions également remercier particulièrement Marta Koch et Bassem Hassan pour la suggestion excellente que nous attendre 1,5 heures CSA avant la dissection des cerveaux pour la culture dans les expériences de rénovation. Nous remercions également le centre d'imagerie NHGRI pour l'utilisation de leur microscope confocal. Ce travail a été soutenu par le Programme des neurosciences fondamentales du programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS003106).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Concentration finale |
| Drosophila de Schneider médias | Invitrogen | 21720-024 | |
| Sérum fœtal bovin (inactivé par la chaleur) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Pénicilline / streptomycine | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insuline | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100 um |
| Lolomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100 um |
| Sérum de chèvre normal | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Albumine de sérum bovin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldéhyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | 0,5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Inserts de culture cellulaire Millicell | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 et | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont n ° 5 Pince | Outils belle science | 11251-20 | |
| Lames de microscope | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Couverture de verre | Fisher Scientific | 12-548-5M |
Références
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).
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Réimpressions et autorisations
