La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains

Résumé

Cet article décrit une méthode par laquelle on peut imiter In vivo Le développement de la Drosophila dans un Ex vivo.

Résumé

Nous décrivons une méthode pour la culture ex vivo du cerveau chez la drosophile entiers. Ceci peut être utilisé comme un contrepoint à des manipulations génétiques chroniques pour étudier la biologie cellulaire et le développement des structures cérébrales centrales en permettant des interventions pharmacologiques aigus et d'imagerie en direct des processus cellulaires. Comme un exemple de la technique, avant de travailler à partir de notre laboratoire ¹ a montré que d'un compartiment non comptabilisé antérieurement subcellulaire se situe entre les compartiments axonaux et somato d'axones du cerveau chez la drosophile centrale. Le développement de ce compartiment, appelé le segment initial de l'axone (AIS) ^2, a été montré génétiquement dépendre de la kinase spécifique des neurones cycline-dépendantes, Cdk5. Nous montrons ici que le traitement ex vivo du cerveau chez la drosophile de type sauvage larvaires avec la roscovitine Cdk5-pharmacologique spécifique et les inhibiteurs de olomoucine ³ provoque des changements dans l'organisation aigus actine, etdans la localisation de la protéine de surface cellulaire Fasciclin 2, qui imitent les changements observés chez les mutants qui n'ont pas Cdk5 activité génétiquement.

Un deuxième exemple de la technique de culture ex vivo est prévu pour le remodelage des connexions du corps champignons embryonnaire (MB) des neurones gamma lors de la métamorphose de la larve à l'adulte. Le corps du champignon est le centre de l'apprentissage olfactif et de la mémoire chez la mouche ^4, et ces neurones gamma élaguer leurs branches axonales et dendritiques au cours du développement nymphal et puis re-branches s'étendent à un instant plus tard, pour établir le modèle innervation adulte ^5. La taille de ces neurones de la MB a été démontré que la dégénérescence se produire via des branches locales neurites ^6, par un mécanisme qui est déclenchée par l'ecdysone, une hormone stéroïde, agissant au niveau du récepteur d'ecdysone B1 ^7, et qui dépend de l'activité de la système ubiquitine-protéasome ^6. Notre méthode de culture ex vivo peut be utilisé pour interroger davantage le mécanisme de remodelage de développement. Nous avons constaté que dans le cadre de la culture ex vivo, les neurones gamma de la MB a récapitulé le processus d'élagage de développement avec une évolution similaire à celle in vivo. Il était essentiel, cependant, attendre 1,5 heures après la formation puparium avant explantation du tissu pour que les cellules de commettre de façon irréversible à la métamorphose; la dissection des animaux au début de la nymphose a conduit à la métamorphose peu ou pas dans la culture. Ainsi, moyennant des modifications appropriées, l'approche ex vivo de la culture peut être appliquée à l'étude dynamique ainsi que les aspects de l'état d'équilibre la biologie du cerveau central.

Protocole

A. Préparation des médias

1. Préparez le support complets par le filtre-stérilisation Drosophila de Schneider médias supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et 1% de pénicilline / streptomycine.
2. Les médias devraient être préparées à chaque fois. Alternativement, une partie aliquote de la pré-congelés médias peuvent être décongelés avant chaque utilisation.
3. Avant la mise en culture, ajouter 10 g / ml d'insuline et 2 pg / ml ecdysone aux médias. Les médicaments ont été préparés comme les stocks de concentrés et congelés dans de petites aliquotes. Aliquotes décongelées ne sont pas recongeler.
4. Toutes les solutions de t....

Discussion

Chroniques les manipulations génétiques de la structure des tissus et la fonction, y compris les mutations et l'expression des transgènes, produisent typiquement une combinaison d'effets immédiats et tardifs conséquences indirectes qui peuvent être très difficiles à séparer. En complément des méthodes génétiques à la pharmacologie peut faciliter les interrogatoires de l'évolution dans le temps derrière un phénotype. Par exemple, cela a été une approche puissante pour disséquer les contributions des dif.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Concentration finale
Drosophila de Schneider médias	Invitrogen	21720-024
Sérum fœtal bovin (inactivé par la chaleur)	Invitrogen	10082-147	10%
Pénicilline / streptomycine	Invitrogen	15140-122	1%
Insuline	Invitrogen	12585-014	10μg/ml
Ecdysone	Sigma-Aldrich	H5142	2μg/ml
Roscovitine	Sigma-Aldrich	R7772	100 um
Lolomoucine	Sigma-Aldrich	O0886	100 um
Sérum de chèvre normal	Invitrogen	50062Z	1%
Albumine de sérum bovin	Fisher Scientific	M9501	1%
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	D4551	4%
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151	0,5%
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	70011-044	1X
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
Inserts de culture cellulaire Millicell	Millipore	PI8P01250
Multidish, 4 et	Thermo Scientific	176740
Dumont n ° 5 Pince	Outils belle science	11251-20
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-544-7
Couverture de verre	Fisher Scientific	12-548-5M