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Article de méthode

Progénitrices dérivées de Système de culture Oligodendrocyte du cerveau foetal humain

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DOI :

10.3791/4274

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20 décembre 2012

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1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Primaire, l'homme dérivés du cerveau du fœtus, des cellules progénitrices multipotentes prolifèrent In vitro Tout en maintenant la capacité de se différencier en neurones et les astrocytes. Ce travail montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites à se différencier par des étapes de la lignée oligodendrogliome par le conditionnement des facteurs de croissance choisis.

Résumé

Différenciation des progéniteurs neuronaux de l'homme dans les types de cellules neuronales et gliales propose un modèle pour étudier et comparer la régulation moléculaire du développement neuronal lignée cellulaire. En expansion in vitro des progéniteurs neuronaux du tissu du SNC du fœtus a été bien caractérisée. Malgré l'identification et l'isolement des progéniteurs gliales de l'adulte humain sous-corticale de la substance blanche et le développement des conditions de culture différentes de différenciation directe des cellules progénitrices neurales foetales en oligodendrocytes de myéline produire, acquérir suffisamment oligodendrocytes humains pour une expérimentation in vitro reste difficile. Différenciation des galactocérébroside + (GalC) et O4 + précurseurs d'oligodendrocytes ou cellules progénitrices (OPC) à partir de cellules précurseurs neurales ont été signalés à l'aide du cerveau du fœtus deuxième trimestre. Cependant, ces cellules ne prolifèrent en l'absence de cellules de soutien, y compris les astrocytes et les neurones, et se perdent rapidement au fil du temps dans la culture. Il subsiste le besoin d'un système de culture pour produire des cellules de la lignée oligodendrocytaire apte à une expérimentation in vitro.

Culture des oligodendrocytes humains primaires pourrait, par exemple, être un modèle utile pour étudier la pathogenèse de la neurotropes agents infectieux comme le polyomavirus humain, JCV, que in vivo infecte ces cellules. Ces cellules en culture pourrait également fournir des modèles d'autres maladies de démyélinisation du système nerveux central (SNC). Primaire, du fœtus humain dérivé du cerveau, les cellules progénitrices neurales pluripotentes proliférer in vitro tout en conservant la capacité de se différencier en neurones (progéniteurs des neurones dérivés, PDN) et les astrocytes (progéniteurs dérivés des astrocytes, PDA) Cette étude montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites se différencier grâce à de nombreux stades de développement lignée oligodendrogliome (progéniteurs des oligodendrocytes dérivées, AOP). Nous cellules progénitrices neurales culture dans du DMEM-F12 sans sérum supplemented avec le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), le facteur neurotrophique 3 (NT-3), N-2 et de la triiodothyronine (T3). Les cellules cultivées sont passées à cellules 2.5e6 par flacons de 75 cm environ tous les sept jours. L'utilisation de ces conditions, la plupart des cellules en culture maintenir une morphologie caractérisée par quelques procédés et expriment des marqueurs de cellules pré-oligodendrocytes, telles que A2B5 et O-4. Quand nous enlevons les facteurs de croissance quatre (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) et ajouter milieux conditionnés provenant de PDN, les cellules commencent à acquérir davantage de processus et de marqueurs spécifiques expresses de la différenciation des oligodendrocytes, comme GalC et de la myéline protéine de base (MBP). Nous avons effectué la caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolores pour identifier des marqueurs uniques de oligodendrocytes.

Protocole

Remarque: Pour la culture de routine de progéniteurs neuronaux et cellules de la lignée oligodendrogliome, l'incubation se fait à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 5% atmosphère. Tous les 2 jours, le milieu est remplacé à partir de 50 à 100% de milieu frais si la culture est confluente 40-70%. Au moment de la confluence proche, les cultures sont passées à 2-2.5e6/T75 flacon généralement sur une base hebdomadaire.

1. Préparer le flacon couché

  1. Pour préparer des flacons revêtus de diluer 5 mg de poly-D-lysine (PDL) dans 100 ml d'eau déminéralisée (eau déminéralisée), puis les enrober flacons T75 avec 50 pg / ml de PDL à la température ambiante (RT) dans l'obscurité. Après 1 ½ h, aspirer le PDL et rincer les flacons une fois avec de l'eau déminéralisée. Laissez les flacons secs avant l'ensemencement des cellules (tableau 1).

2. À partir de différenciation des cellules progénitrices neurales progénitrices oligodendrocytes en dérivés (AOP)

Le protocole estolate des cellules progénitrices du système nerveux central est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Les cellules souches du système nerveux central ont été isolés à partir du télencéphale d'un cerveau de 8 semaines de gestation du fœtus, obtenus conformément aux directives du NIH.

  1. Accroître la population multipotentielle des cellules progénitrices neurales sur PDL flacons revêtus en milieu neurobasal additionné de 25 ng / ml de bFGF et 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) (figure 1A). Ne les utilisez pas si élevé que le passage 11 (p11).
  2. Commencent à se différencier les cellules progénitrices neurales lorsque la culture est d'environ 70% de confluence.
  3. Assurez milieu de différenciation des oligodendrocytes complète à l'aide du DMEM sans sérum / JAMBONS milieu F12 01:01 complétée par la sérum albumine bovine, de L-glutamine, la gentamicine, composants N2, T3, Chut, NT-3, bFGF et PDGF-AA (tableau 1) . Ce milieu sera définie comme moyen oligo des facteurs de croissance (oligo moyenne + GF).
  4. Retirer Progenmédias Itor des flacons, rincer les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (PBS), puis ajouter du milieu oligo + GF (détails décrits en 2.3) pour commencer la différenciation des oligodendrocytes. Seules les cellules engagées dans la lignée oligodendrogliome va croître (figure 1B). Culture des cellules dans ce milieu pendant 3 semaines.
  5. Chaque semaine, lorsque les cellules sont à confluence, passage de 90-95% les utilisant de la trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml pour un flacon T75). Transférer le support d'ensemble à partir des cellules à un passage dans un tube conique de 50 ml, ce milieu conditionné est utilisé pour étancher la trypsine. Assurez-vous de ne pas dessécher les cellules. Ensuite, ajoutez la trypsine.
  6. Incuber les cellules à la trypsine pendant 5 min à température ambiante, en tapotant doucement le flacon plusieurs fois pour aider le détachement des cellules.
  7. Étancher la trypsine en ajoutant 4-5 ml de milieu conditionné dans le ballon avec les cellules individuelles.
  8. Transférer le milieu et les cellules de la même 50 ml tube conique. Centrifuger le milieu et les cellules à 1200 rpm (~300 xg) pendant 5 min à température ambiante.
  9. Aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire, doucement basculer le tube, puis ajouter du milieu frais oligo + GF. Doucement moyen pipette et de cellules de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire uniforme.
  10. Compter le nombre de cellules de transfert, et 2.5e6 dans chaque nouvelle PDL revêtu T75 ballon.

3. Étape finale dans la différenciation des oligodendrocytes

  1. Après 3 semaines de culture en oligo moyenne + GF, lorsque les cellules sont à confluence de 70-80%, démarrez le processus final de différenciation (figure 1C).
  2. Préparer le milieu de la même manière que le moyen oligo + GF, mais sans adjonction de quatre GF: Shh, NT-3, bFGF et du PDGF-AA. Ce milieu sans le GF quatre seront définis comme moyen oligo - GF.
  3. Aspirer le milieu oligo + GF du flacon, rincer une fois avec du PBS puis ajouter un volume total de 16 ml de milieu, dont ¾ (12 ml) est un oligo moyennes - GF et ¼ (4 ml) est PDN milieu conditionné par 6-10 Jours). L'utilisation d'un milieu conditionné provenant PDN n'est pas critique pour le processus de différenciation ou de la survie des cellules. Nous avons en fait constaté que seulement le contact direct avec les cellules de l'AOP PDN dans des expériences de co-culture a eu un effet sur la durée de la survie PDO. Le temps de survie moyen en oligo - GF pourrait être prolongée jusqu'à deux ou trois semaines si les cellules AOP sont co-cultivées avec des cellules PDN. Le protocole de différencier des cellules souches neurales dans PDN est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Retrait du facteur de croissance à partir des résultats de milieux de culture en culture progressivement différenciées des cellules avec plusieurs processus (figure 1D).

4. Essai de cytométrie en flux

Le test de cytométrie en flux compare l'acquisition de marqueurs oligodendrocytes au cours du processus de différenciation par rapport à ceux de leur population parentale.

  1. Utilisez pro neuronesgéniteurs que le contrôle. Semences cellules PDO à 2,5.10 6 cellules dans deux flacons T75 recouvertes de poly-D-lysine en oligo moyenne + GF.
  2. Une semaine plus tard, remplacer moyenne avec oligo milieu frais + GF dans des flacons en tant que culture de contrôle pour la viabilité cellulaire, tandis que d'autres flacons ont oligo moyennes - GF.
  3. Pour dissocier les cellules AOP dans les médias utilisent 20 U / ml de papaïne et la trypsine pas. En effet, la papaïne a un doux effet sur les cellules au cours de la dissociation préserver la morphologie cellulaire.
  4. Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Earle (EBSS) dans un flacon à la papaïne. Placer la fiole à 37 ° C pendant 10 minutes, ou jusqu'à ce que la papaïne est totalement dissous et la solution apparaît clairement. C'est la solution la papaïne utilisée pour dissocier les cellules.
  5. Ajouter 0,5 ml de EBSS à une désoxyribonucléase I (DNase) flacon (tableau 1). Mélanger doucement. Ajouter 0,25 ml de cette solution dans le flacon de la papaïne dissous. Cette préparation contient une concentration finale d'environ 20 U / ml et la papaïne 00,005% DNase.
  6. Lieu papaïne solution (comme décrit ci-dessus) sur les cellules et incuber à 37 ° C pendant 15-30 min, à surveiller le détachement des cellules à l'aide d'un microscope. Arrêter la réaction avec 5 ml de milieu avec ou sans GF et centrifuger à 1200 tours par minute pendant 7 min.
  7. Transfert culots cellulaires des deux flacons en deux différents tubes de 5 ml en polypropylène et lavez-les avec le milieu physiologique normal (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES et 10 mM glucose) additionné de 1 mg / ml sérum-albumine bovine (BSA + NPM).
  8. Effectuer surface immunomarquage à 4 ° C pendant 20 min en utilisant de manière appropriée spécifiques et titré les anticorps primaires pour A2B5, O4, GalC (tableau 2).
  9. Laver les cellules avec NPM + BSA à 4 ° C pendant 5 minutes et les incuber avec des anticorps secondaires à 4 ° C pendant 20 min (tableau 2).
  10. Pour colorer les antigènes intracellulaires, y compris la nestine, protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), classe III et êtreta;-tubuline, protéine basique de myéline et (MBP) (tableau 2), fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% (PFA) pendant 20 min à température ambiante et perméabiliser avec de l'éthanol 70% froid pendant 15 min à -20 ° C.
  11. Laver les cellules avec du PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires (tableau 2).
  12. Faire la distinction entre les cellules intactes et les débris subcellulaire lors de l'analyse par cytométrie en flux, colorer les cellules avec 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dichlorhydrate (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. En optimisant le protocole ci-dessus, nous avons effectué toutes les expériences de contrôle appropriés pour confirmer la spécificité de chaque réactif immunologique. En bref, pour les anticorps directement marqués, le contrôle négatif approprié était un anticorps directement conjugués de la classe même isotype d'immunoglobulines (ou sous-classe) et conjugué fluorochrome comme anticorps primaire (c.-à-isotype contrôle). Pour immunomarquage indirect des anticorps primaires, le contrôle négatif approprié wcomme anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome l'intérêt que spécifiquement ciblé la classe d'immunoglobulines (ou sous-classe) de l'hôte dans lequel l'anticorps primaire a été généré. Lorsque anticorps primaires de plusieurs hôtes (souris, lapin, poulet) ont été utilisés ensemble, nous avons utilisé l'anticorps secondaire ciblant l'anticorps primaire de chaque hôte et chaque anticorps secondaire utilisé est généralement contre-adsorbé contre les immunoglobulines des autres hôtes pour minimiser les contre- accueillir immunoréactivité. Les contrôles positifs inclus immunomarquage direct ou indirect des préparations cellulaires connues pour exprimer les antigènes d'intérêt en utilisant soit des réactions immunologiques directs ou indirects avec les anticorps primaires spécifiques de ces antigènes. Les méthodes d'optimisation ci-dessus ont été effectuées une fois pour chaque type d'immunocoloration expériences. Immunoréactions de contrôle n'a pas révélé croisée significative épitope immunoréactivité des anticorps primaires et secondaires. La cytométrie en flux a été réalisée sur uniformesuspension des cellules marquées par fluorescence en utilisant une cellule SE FACVantage trieur (BD Biosciences, San Jose, CA) équipé de trois lasers qui fournissent des longueurs d'onde d'excitation accordés à 488 nm, 647 nm, et une large UV (351-364 nm) (Figure 2) .

5. Immunofluorescence

Remarque: Pour les expériences d'immunofluorescence, PDO sont plaqués en oligo moyenne + GF ou oligo moyennes - GF à 2.5e5 plaques à 6 puits revêtus de PDL. Les cellules sont fixées à 2% de PFA à différents moments après le retrait des facteurs de croissance. L'anticorps tache est réalisée sur plaques de 6 puits en plastique au lieu de lamelles de verre.

  1. Retirez le support et ajouter les 2% de PFA. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Jeter PFA. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, à 5 min à chaque fois. Veillez à ne pas dessécher les cellules.
  2. Perméabiliser les cellules pour les marqueurs intracellulaires qui utilisent la solution de triton 0,25% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
  3. Pour éviter la liaison non spécifique des cellules de bloc, fou 10 min avec HHG (1 mM de tampon HEPES, de sérum de cheval à 2%, et de sérum de chèvre à 10% dans une solution saline équilibrée de Hank). Diluer anticorps primaires spécifiques (tableau 2) à une concentration prédéterminée dans HHG. Placez anticorps dilué sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur l'agitateur ou à 4 ° C pendant la nuit.
  4. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois. Diluer appropriées Anticorps secondaires (tableau 2) couplées à un fluorochrome à une concentration prédéterminée dans HHG. Placer le mélange dilué d'Anticorps secondaires sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur un agitateur dans l'obscurité.
  5. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois.
  6. Pour éviter photoblanchiment ajouter 10 ul de prolonger l'or avec du DAPI dans les cellules et placer une lamelle de verre sur le dessus d'eux. Visualisez les cellules marquées à l'aide d'un microscope à fluorescence Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (figure 3).

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Résultats

Il est très important de commencer le processus de différenciation à partir d'un 70% -80% culture confluente de cellules progénitrices de neurones (figure 1A). De nombreuses cellules meurent après avoir changé le milieu de culture des progéniteurs à moyen oligo car il inclut des facteurs de croissance spécifiques. Ceci indique que la croissance des cellules progénitrices neurales ne s'engagent pas à un phénotype oligodendrogliome ne seront pas pris en charge par le nouveau média (figure ...

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Discussion

Ce protocole décrit la façon de calculer les oligodendrocytes à partir de fœtus humains primaires cellules progénitrices neurales et de caractériser leur phénotype en utilisant la cytométrie en flux à la fois et immunofluorescence. L'expansion et la croissance des progéniteurs neuronaux du système nerveux central du fœtus a été très bien décrit 1-4. Cependant, l'obtention d'oligodendrocytes humains suffisants pour une expérimentation in vitro reste difficile, même si il est possi...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros au National Institutes of Health, NINDS. Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Laboratoire de médecine moléculaire et de neurosciences, Rick Dreyfuss pour aider à la microscopie et Pamela C. Tamiser pour son aide à l'édition.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue La concentration finale
DME / HAMS F12 01:01 Omega scientifique DM-251 1X
Albumine bovine Sigma A9418 1%
Gentamicine Qualité des produits biologiques 120-098-031 50 pg / ml
L-Glutamine Qualité des produits biologiques 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
Composants N2 Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng / ml
Shh R & D System 1314-SH/CF 2 ng / ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng / ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng / ml
PDL Sigma P6407 50 pg / m
PFA Sciences microscopie électronique 15712 2%
Trypsine Qualité des produits biologiques 118-087-721
La papaïne Worthington LK003178 20 U / ml
Flacons DNase Worthington LK003172 0,005%
EBSS Worthington LK003188
Or ProLong
avecDAPI 		Invitrogen P36931

Tableau 1. Réactifs.

Primaire Abs (tout à 1 ug / ml) Isotype espèces Source Secondaire Abs
Cytométrie en flux
A2B5-biotine Souris IgM Cadeau J. Nielson Streptavidine PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Souris IgM Cadeau de J. Nielson
A2B5 Souris IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Souris IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Souris IgG 3 Millipore, MA gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Poulet IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestine Souris IgG 1 Messam et al. 2000 28 gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Lapin IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
tubuline βIII Souris IgG 2 Covance, CA gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochimie
tubuline βIII
(1:1,500) 		Souris IgG 2a Covance, CA gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Lapin IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50) 		Poulet IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Souris IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1: 100)
GalC
(1:10) 		Lapin IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Anticorps tableau 2 (Abs) utilisés pour la cytométrie en flux et des dosages immunocytochimie conjugués d'anticorps: PE, la phycoérythrine; PETR, la phycoérythrine-Rouge Texas; AMCA, amino-méthyl-coumarine-acétate; Cy, cyanine, FITC, l'isothiocyanate de fluorescéine Ig:.. Immunoglobuline. . AF: Alexa Fluor; gαm: chèvre anti-souris; gαrb: chèvre anti-lapin; dαck: donkey anti-poulet.

Références

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