Article de méthode

Bacterial Detection & identification au moyen de capteurs électrochimiques

DOI :

10.3791/4282

⸱

23 avril 2013

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1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

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Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Résumé

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Les capteurs électrochimiques sont largement utilisés pour la mesure rapide et précise de glucose dans le sang et peuvent être adaptés à la détection d'une large variété d'analytes. Les capteurs électrochimiques fonctionnent par transduction d'un événement de reconnaissance biologique en un signal électrique utile. La transduction de signal se produit par couplage de l'activité d'une enzyme d'oxydo-réduction pour une électrode ampérométrique. spécificité du capteur est soit une caractéristique inhérente de l'enzyme, la glucose-oxydase dans le cas d'un capteur de glucose, ou un produit de couplage entre l'enzyme et un anticorps ou une sonde.

Ici, nous décrivons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour détecter directement et identifier les bactéries. Dans tous les cas, les sondes décrites ici sont des oligonucléotides d'ADN. Cette méthode est basée sur hybridation sandwich de capture et de détection des sondes avec cible ARN ribosomal (ARNr). La sonde de capture est fixée à la surface du capteur, tandis que la sonde de détection est lié à horseradish peroxydase (HRP). Quand un substrat tel que le 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) est ajouté à une électrode avec des complexes de capture-cible-détecteur lié à sa surface, le substrat est oxydée par le HRP et réduit par l'électrode de travail. Cette redox cycle conduit à la navette d'électrons par le substrat de l'électrode à la HRP, produisant le flux de courant dans l'électrode.

Introduction

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Utiliser ARNr comme une molécule cible pour la détection et l'identification bactérienne a un certain nombre d'avantages. L'abondance de l'ARNr dans les cellules bactériennes prévoit une limite de sensibilité aussi bas que 250 bactéries par millilitre, sans la nécessité d'amplification de la cible 1. ARNr bactérien contient des séquences spécifiques d'espèces uniques qui sont accessibles à l'hybridation avec des sondes d'ADN. En conséquence, un ensemble de capteurs électrochimiques peut être utilisée pour identifier des bactéries inconnues, où chaque capteur est fonctionnalisé avec une sonde de capture spécifique d'espèce différente. Capteurs de contrôle positifs doivent être inclus pour une cible d'oligonucléotides synthétiques qui «ponts» de la capture et des sondes de détection pour créer un signal de calibrage interne.

Les capteurs électrochimiques ont une large gamme d'applications de recherche fondamentale et translationnelle. Par exemple, le dosage décrit ici a été utilisé pour mesurer précisément l'effet de E. phase de croissance coli sur les RRNA et le nombre de copies pré-ARNr, qui est d'un grand intérêt pour les chercheurs qui s'intéressent à la physiologie bactérienne 2. La sensibilité du test de détection électrochimique est déterminé par le rapport signal sur bruit. Une variété d'amplification du signal et des méthodes de réduction du bruit ont été explorées. Nous constatons que l'amélioration de la chimie de la surface du capteur est essentielle pour réduire la liaison non spécifique de la sonde de détection et / ou enzyme HRP. En particulier, une monocouche mixte de alkanedithiols et mercaptohexanol a été trouvée pour réduire le fond, en recouvrant la surface de l'électrode plus complètement, tout en conservant l'accessibilité de la sonde de capture pour l'hybridation de la cible 3. Ces traitements chimiques de surface sont particulièrement importants pour les essais portant sur des échantillons biologiques complexes.

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Protocole

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1. Fonctionnalisation des capteurs électrochimiques

  1. Préparer la sonde de capture thiolée à une concentration de 0,05 um à 300 um 1,6-Hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM EDTA et incuber dans l'obscurité à la température ambiante pendant 10 min . L'incubation de la sonde de capture thiolé avec HDT assure que le groupe thiol sur la sonde de capture est réduite, ce qui entraîne des résultats plus cohérents.
  2. Appliquer un courant d'azote à l'or nu 16 puce de réseau de capteurs (s) pendant 5 secondes pour éliminer l'humidité et / ou de particules.
  3. Appliquer 6 pl du mélange de sondes de capture HDT-thiolé à l'électrode de travail de l'ensemble 16 des capteurs du réseau de capteurs et de stocker la puce de capteur (s) dans une boîte de Petri couverte à 4 ° C pendant une nuit. Des sondes de capture thiolées se lient directement à l'électrode d'or à nu et la HDT agit pour empêcher suremballage des sondes de capture et de les maintenir dans une conformation étendue qui favorise l'hybridation avec la cible.
  4. Leaprès jour, laver la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  5. Appliquer 6 pi de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (SMI) à l'électrode de travail de l'ensemble des 16 capteurs et incuber pendant 50 min. Ceci et toutes les incubations de puces de capteurs qui suivent sont réalisées dans une boîte de Petri couvert à la température ambiante. MCH agit comme un agent de blocage, de remplissage dans les fentes, où la sonde de capture thiolé ou HDT n'est pas présent sur la surface de l'électrode.

2. Préparation des échantillons

  1. Transférer 1 ml de culture bactérienne dans la phase logarithmique de croissance (DO600 ≈ 0,1) dans un tube à centrifuger et centrifuger à 16000 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant de culture. Le culot bactérien peut être traitée immédiatement ou stocké à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
  2. Soigneusement remettre le culot bactérien dans 10 pi de 1 M NaOH en appliquant la pointe de la pipette au bottom du tube de centrifugation et de pipetage de haut en bas plusieurs fois. Incuber la suspension à température ambiante pendant 5 min.
  3. Neutraliser le lysat bactérien en ajoutant 50 pl de 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 2,5% de sérum-albumine bovine mM (BSA) et 0,25 d'une sonde de détection de fluorescéine modifié. Incuber le lysat neutralisé pendant 10 min à température ambiante. Sondes de détection fluorescéine modifiés s'hybrident avec des molécules cibles d'ARNr bactériens.

3. Capteur électrochimique Assay

  1. Laver le SMI de la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  2. Appliquer 4 de lysat bactérien neutralisé à l'électrode de travail de chacun des 14 capteurs et incuber pendant 15 min. Complexes sonde-cible s'hybrident détecteur de sondes de capture immobilisées thiolés.
  3. Appliquer 4 l de 1 nM de transition oligonucléotide à 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 2,5% de BSA et 0,25 μ M fluorescéine modifié sonde de détection à 2 capteurs de contrôle positif (utilisé pour la normalisation du signal) et incuber pendant 15 min.
  4. Laver la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  5. Appliquer 4 ul de 0,5 U / ml anti-fluorescéine-HRP à 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 0,5% de caséine à l'électrode de travail de l'ensemble des 16 capteurs et incuber pendant 15 min. L'anti-fluorescéine-HRP se lie aux sondes de détection de fluorescéine modifiés immobilisés.
  6. Laver la puce du capteur avec déminéralisée H 2 O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
  7. Appliquer un film autocollant bien à la surface de la puce du capteur et la charge dans le support de la puce capteur. Pipette 50 ul de substrat TMB sur les 16 capteurs et fermer le support de puce capteur.
  8. Obtenir amperometry et les mesures de voltampérométrie cycliques pour les 16 capteurs en utilisant le lecteur de puce Hélios. Courant ampérométrique est proportionnelle à la vitesse de TMB réduction sur la surface du capteur (voir Figure 1).

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Résultats

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Nous décrivons un dosage électrochimique qui est structuré de manière similaire à un test ELISA sandwich. Comme le montre la figure 1, la cible d'ARN ribosomal (ARNr) l'hybridation avec des sondes de capture et de détection est développée par une réaction d'oxydo-réduction catalysée par HRP conjugué à des fragments d'anticorps anti-fluorescéine qui se lient à la liaison 3 'fluorescéine sur la sonde de détection. Un élément important de la sensibilité du dosage est la chimie de surface de l'électrode en ...

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Discussion

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Le test de détection électrochimique décrite ici permet la détection rapide de cibles d'acides nucléiques. La sensibilité et la spécificité dépendent en partie de l'énergie libre de l'hybridation cible-sonde, qui à son tour dépend de la longueur et la teneur en GC de la capture et sondes de détection. Nous effectuons généralement les étapes d'hybridation à température ambiante (~ 20 ° C) 5, 6. Toutefois, les étapes d'hybridation (3.2 et 3.3) peuvent également être effectuées à des températ...

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Déclarations de divulgation

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Tous les auteurs sont des inventeurs sur les brevets se rapportant aux méthodes décrites. Un de ces brevets a été autorisé à Qvella Corporation. BMC et DAH ont participation dans Qvella Corporation. VG est le président de GeneFluidics, qui est le fabricant de la puce de réseau de capteurs électrochimiques, montage puce et lecteur de puce décrit dans cet article.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par l'accord de coopération Award AI075565 (à DAH) de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et par le Fonds Wendy et Ruby Ken pour l'excellence en urologie pédiatrique recherche. BMC est le Judith et président Robert Winston en urologie pédiatrique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
6-mercapto-1-hexanol (MCH)Sigma451088Conserver à température ambiante
1,6-hexanedithiol (HDT)SigmaH-12005Conserver à température ambiante
Sondes de capture thioléesOperon N/AStocker à 100 &mu ; M en TE 0,1x à -20 ° ; C
Sondes détecteurs modifiées à la fluorescéineOperonN/AStore à 100 &mu ; M en TE 0,1x à -20 ° ; C
Pont OligonucléotideOpéronN/AMagasin à 100 &mu ; M en TE 0,1x à -20 ° ; C
Anti-Fluorescéine-HRP, Fab fragmentsRoche11 426 346 910Magasin à 4 ° ; C
Helios Chip ReaderGeneFluidicsGFR-2009
Sensor Chip MountGeneFluidicsGFR-003
Autocollant de puits de filmGeneFluidicsLivré avec des puces de capteur
Or nu 16 puces GeneFluidics SC1000-16X-BStocker en 100 % N2 à température ambiante
Albumine sérique bovineSigmaA7906Magasin à 4 ° ; C
1M Tampon phosphate, pH 7,2 0,35M NaH2PO4, 0,65M K2HPO4, ajusté à pH 7,2
Caséine bloqueuse dans PBS Pierce37528Diluer avec un volume égal de tampon phosphate 1M, pH 7,2, conserver à 4 ° ; C
Table 1. Réactifs et équipements.

Références

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  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
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  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

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Mots-clés

ARN ribosomalhybridation en sandwichperoxydase de raifortsubstrat TMBpuce r seau de capteurssonde de capturesonde de d tectionconjugu la fluoresc ine

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