Modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Résumé

Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle: l'injection d'une suspension de cellules cancéreuses dans le mur caecal ou la transplantation d'un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Ce modèle est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.

Résumé

Le modèle de tumeur sous-cutanée traditionnelle est de moins de idéales pour étudier le cancer colorectal. Des modèles de souris orthotopique de cancer colorectal, qui disposent de plus en plus les cellules cancéreuses à leur emplacement naturel, de reproduire la maladie humaine avec une grande fidélité. Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle. Les deux techniques sont similaires et nécessitent une anesthésie de la souris et la laparotomie pour l'exposition du caecum. Une technique consiste à injection d'une suspension de cellules du cancer colorectal dans le mur caecal. Les cellules cancéreuses sont d'abord mises en culture, récoltés quand subconfluentes et préparée comme une suspension cellulaire unique. Un petit volume de cellules est injecté lentement pour éviter les fuites. L'autre technique consiste à la greffe d'un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Une souris avec une tumeur sous-cutanée préalablement établi colorectal est euthanasié et la tumeur est enlevée en utilisant une technique stérile. La pièce est divisée tumorale en petits morceaux pour la transplantation d'une autre souris. Avant la transplantation, le mur du cæcum est légèrement endommagé afin de faciliter l'infiltration des cellules tumorales. Le temps de développer des tumeurs primaires et des métastases hépatiques varie en fonction de la technique, la lignée cellulaire, et des espèces de souris utilisée. Ce modèle de souris orthotopique est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.

Protocole

Préparation des cellules I.

1. Cellules du cancer colorectal sont mis en culture et récoltés lors subconfluentes.
2. Une suspension cellulaire unique est préparé en tampon phosphate salin et conservé sur glace.

II. Préparation tumeur

1. Une souris avec une tumeur sous-cutanée préalablement établi colorectal est euthanasié.
2. La tumeur est enlevée sous-cutanée à l'aide technique stérile et divisées en 2-3 morceaux mm
3. Les morceaux de tumeur sont conservés dans un tampon phosphate salin sur la glace.

III. Préparation de la souris

Remarque: Dans notre laboratoire, nous utilisons inhalation d'isoflurane à anesthésier la souris, ou alternativement, on peut utiliser des anesthésiques injectables pour obtenir le même effet

1. La profondeur de l'anesthésie est évaluée à l'aide pincement de l'orteil. Il ne faut pas retirer reflex avec pincement de l'orteil.
2. Les antibiotiques peuvent être donnés à ce point.
3. La souris anesthésiées, qui a été préalablement rasée, est correctement positionné.
4. L'abdomen est préparée avec une solution de Betadine.
5. L'abdomen et du site opératoire sont drapées d'une manière stérile.

IV. Laparotomie

1. Une petite incision est faite dans la peau
2. La musculature paroi abdominale est saisi et soulevé
3. La cavité abdominale est entré et une seule lame des ciseaux est utilisé pour pousser le contenu intra-abdominal suite
4. L'incision est prolongée à 2-3 cm

Exposition V. du cæcum

1. Le caecum avec sa pochette finissant aveugle est identifié et extériorisé
2. Le cæcum est isolé du reste de la souris en utilisant une pré-coupés, gaze stérile
3. Saline chaude est utilisée pour conserver l'humidité du caecum

VI. L'injection de cellules dans le mur caecum

1. Un G 27 ou une aiguille fine est utilisée pour injecter un volume de 50 ul de cellules dans le mur caecal
2. L'aiguille est retirée
3. Le site d'injection est inspecté pour s'assurer qu'aucun des fuites
4. Le caecum est retourné à la cavité abdominale

VII. La transplantation de la tumeur sur le caecum

Remarque: En plus de l'injection de cellules dans le mur caecal, une approche alternative consiste à transplanter des tumeurs sur le cæcum

1. Un chiffre de 8 points est placé sur le caecum en utilisant 6-0 ou 7-0 de suture de taille
2. Le mur du cæcum est légèrement endommagé
3. Ensuite, la pièce tumeur est positionné
4. Le point est lié bas
5. Le caecum est retourné à la cavité abdominale

VIII. Fermeture de la paroi abdominale de souris et de récupération

1. Le mur de la souris abdominale est refermée en utilisant trois points de suture interrompue en utilisant 3-0 ou 4-0 de suture de taille
2. Alternativement, on peut utiliser un simple point courir
3. Post-opératoire des analgésiques et un bolus de liquide peut être donnée à ce stade
4. La souris est autorisé à remettre de l'anesthésie.

Remarque: avec des anesthésiques inhalés cela prend généralement 30 secondes

IX. Résultats - tumeur primitive et métastase hépatique

Tumeur primitive - montré in situ (A) et avec des preuves de la néovascularisation (B); sur la coloration H & E, les tumeurs sont localement invasives (C)

Métastases hépatiques - montré ex vivo (D)

Discussion

Bien que des modèles de souris de tumeurs sous-cutanées sont faciles à établir et à surveiller, il est clair que ce modèle ne peut pas répliquer le site original anatomique du cancer colorectal. En raison de la différence dans le micro, les cellules du cancer colorectal poussant sous la peau a été démontré que le changement de leur phénotype et échouent presque toujours au progrès et à métastaser ^1,2. En fait, la réponse tumorale au traitement peut varier considérablement selon que les cellules cancéreuses sont implantées dans un...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieux de culture cellulaire et composants			varient selon la lignée cellulaire utilisée
Solution saline tamponnée au phosphate	BioWhittaker	17-512F	également vendue par plusieurs autres fournisseurs
Tubes de centrifugation de 15 mL, en polypropylène	Corning	430790
Plaques de 6 puits avec couvercle	BD Biosciences	353046
Pinces à iris, droites, à extrémités striées	World Precision Instruments, Inc.	15914	il est préférable d'avoir une paire de ces instruments
Ciseaux de dissection à iris, droits, effilés	World Precision Instruments, Inc.	14393
Porte-aiguille (ordinaire)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Porte-aiguille (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	les instruments doivent être stérilisés périodiquement en autoclave, mais peuvent également l'être par trempage dans du Cidex
Fil de suture 6-0 ou 7-0			pour le caecum ; gracieuseté du Département de chirurgie, UCSF
Fil de suture 3-0 ou 4-0			pour la paroi abdominale ; gracieuseté du Département de chirurgie, UCSF
Machine à anesthésie / Isoflurane	J.A. Baulch and Associates	3206	également vendue par plusieurs autres fournisseurs
Plaque chauffante jetable, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Ruban orange, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	pour immobiliser la souris anesthésiée
Tondeuse Pro-Cord/Cordless Trimmer	Oster Professional Products	78997-010	pour raser le pelage de la souris
Bétadine	Fisher Scientific	19-027132	peut également être achetée dans n'importe quel magasin de fournitures médicales
Compresse 2 x 2, 3 plis	Johnson & Johnson	7635	peut également être achetée dans n'importe quel magasin de fournitures médicales
Champ stérile, barrière, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	peut également être acheté dans n'importe quel magasin de fournitures médicales
Applicateurs à embout coton, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	peuvent également être achetés dans n'importe quel magasin de fournitures médicales
Seringue de 10 cc, embout Luer lock	BD Biosciences	309604
Seringue de 1 cc, tuberculine, embout lisse	BD Biosciences	309602
Aiguille 27 1/2 G	BD Biosciences	305109
Aiguille 30 G	BD Biosciences	305106