Article de méthode

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d'imagerie

DOI :

10.3791/50025

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12 décembre 2012

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1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

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On décrit une méthode pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Tout d'abord, l'imagerie optique intrinsèque de signal est utilisé pour obtenir une carte fonctionnelle. Puis microscopie à deux photons est utilisée pour l'étiquette et les neurones d'image dans un domaine micro-de la carte.

Résumé

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Dans le cortex visuel primaire de non-rongeurs mammifères, les neurones sont regroupés en fonction de leur préférence pour les fonctions de relance comme l'orientation 1-4, direction 5-7, dominance oculaire 8,9 et la disparité binoculaire 9. Sélectivité orientation est la caractéristique la plus largement étudiée et une application continue avec une mise en quasi-périodique pour l'orientation préférée est présent sur ​​l'ensemble du cortex visuel primaire 10,11. Intégrant les apports synaptiques, cellulaires et le réseau qui conduisent à des réponses de stimulation sélective de ces cartes fonctionnelles nécessite l'hybridation des techniques d'imagerie qui couvrent sub-micron au millimètre échelles spatiales. À l'imagerie optique intrinsèque signal conventionnel, la disposition générale de cartes fonctionnelles sur toute la surface du cortex visuel peut être déterminé 12. Le développement in vivo de microscopie à deux photons à l'aide de calcium colorants sensibles permet de déterminer la SYNAPTentrée ic arriver à épines dendritiques individuelles 13 ou enregistrement d'activité simultanément à partir des centaines de différents corps cellulaires neuronaux 6,14. Par conséquent, en combinant l'imagerie signal intrinsèque à la résolution spatiale submicronique de microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer exactement quels segments dendritiques et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte fonctionnelle de tout dans le néocortex. Ici, nous démontrons une méthode à haut rendement permettant d'obtenir rapidement une carte d'orientation corticale et en ciblant un micro-domaine de cette carte fonctionnelle pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents chez un mammifère non-rongeur. Avec le même microscope utilisé pour l'imagerie à deux photons, nous avons d'abord générer une carte d'orientation à l'aide d'imagerie optique intrinsèque du signal. Ensuite, nous montrons comment cibler un micro-domaine d'intérêt en utilisant une micropipette chargée avec de la teinture d'étiquette soit une population de corps cellulaires neuronaux ou l'étiquette d'un seul neurone tels que des dendrites et des axones, les épines sont visibles dansvivo. Nos améliorations par rapport aux méthodes antérieures de faciliter l'examen des neurones relations structure-fonction avec sub-cellulaire résolution dans le cadre du néocortex architectures fonctionnelles.

Protocole

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1. Préparation chirurgicale

  1. Induire une anesthésie et surveiller en permanence le rythme cardiaque, la fin de la marée CO 2, EEG, et de la température. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Medical University of South Carolina et étaient basées sur celles que nous avons déjà publié 9,15.
  2. Exposer la surface dorsale du crâne en coupant la peau avec une lame de scalpel. Disséquer les tissus conjonctifs qui recouvrent l'os à l'aide d'une curette Brudon. Nettoyez l'os en utilisant des applicateurs à embout de coton et gaze de coton. Appliquez la cire à os (au besoin) pour le crâne, pour arrêter les saignements occasionnels à travers de petites veines émissaires.
  3. Attacher une plaque en titane ou en acier inoxydable tête en acier au crâne (sur la région d'intérêt où la craniotomie sera effectué) à l'aide de ciment dentaire mélangé avec de la peinture noire (voir Matériels). Une ouverture rectangulaire dans le centre de la plaque de tête permet d'accéder à la craniotomie et d'imagerie optique. Attacher une chambre de métal sur le dessus de la plaque de tête. Cette chambre se servir de réservoir de fluide pour l'imagerie avec la lentille d'objectif à immersion d'eau.
  4. Fixez la plaque de tête à un stade xy en utilisant des poteaux métalliques.
  5. Amincir une grande surface de l'os à l'intérieur de l'ouverture rectangulaire de la plaque de tête à l'aide d'une fraise de dentiste. La zone à être dilué doit s'étendre bien au-delà des limites de la craniotomie prévu. Le crâne épais de non-rongeurs mammifères doivent être éclaircis si des images haute résolution sont à acquérir auprès du néocortex, car sur le site de craniotomie, l'épaisseur de l'os va dicter l'épaisseur de la gélose entre la lamelle et la surface du néocortex (voir ci-dessous) .
  6. Percer un trou de 2 x 2 mm contour carré dans l'os de la craniotomie. Rincer la chambre périodiquement avec des produits frais liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour enlever des éclats d'os et de minimiser la dissipation de la chaleur vers le cortex sous-jacent. Appliquez la cire à os selon les besoins, pour arrêter les saignements occasionnels.
  7. Lift le volet osseux avec une pince n ° 3.
  8. Retirez tous, mais la couche inférieure de durée à l'aide d'une amende pince (# 5CO) et des ciseaux à ressort Vannas. La dure-mère en non-mammifères rongeurs est épaisse et opaque, mais peut être enlevé en couches distinctes. Le saignement est rare mais peut être arrêté avec Gelfoam et tout résidu de sang doit être doucement retiré de la couche restante de durée en utilisant une pince et un rinçage à l'ACSF. La dernière couche de dure-mère est transparente et les vaisseaux pie-mère doit être clairement visible à travers elle. En sortant de cette dernière couche de durée intacte lors de l'imagerie signal intrinsèque augmente le taux de réussite de chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes pour la phase d'imagerie à deux photons ultérieure de l'expérience (voir discussion).
  9. Appliquez une goutte d'eau tiède agarose à 2% (dissous dans ACSF) et placer immédiatement une lamelle sur la craniotomie. Vérifiez la craniotomie pour s'assurer que les pulsations respiratoires et cardiovasculaires sont minimes à l'aide d'un microscope chirurgical de dissection ou les oculaires des deux-microscope photonique à champ lumineux mode.

2. Intrinsèque du signal d'imagerie optique

  1. Ajouter gel-mousse imbibée d'ACSF autour de l'extérieur du couvre-objet pour empêcher l'agarose de séchage au cours de l'imagerie de signal intrinsèque.
  2. Fixer le signal de formation d'image CCD intrinsèque à la norme monture C orifice sur le dessus du microscope à deux photons (figure 1). Placez la source de lumière d'éclairage sur la table de l'air près de la scène xy (figure 1A). Positionner et fixer les guides de lumière sur la craniotomie et plaque de tête / chambre (figure 1B). Rétracter la dichroïque primaire et le miroir au-dessous de l'orifice de montage C de sorte que la lumière réfléchie rouge nécessaire pour des signaux intrinsèques passera directement de la craniotomie de la caméra CCD (figure 1C-D). Utilisation de l'objectif 4x air (0,13 NA, 17 mm WD), un champ de 2 x 2 mm de vue est disponible pour l'imagerie signal intrinsèque.
  3. Insérer un filtre de chaleur dans la light chemin pour éviter le cortex de chauffage. Utilisez un filtre qui laisse passer la lumière verte (546 nm centre λ) et enregistrer une image numérique de référence des vaisseaux sanguins de surface corticale.
  4. Déplacer le focus z à 500 um en dessous de la surface corticale. Utiliser un filtre rouge (630 nm centre λ) pour illuminer le cortex pour mesurer des signaux intrinsèques. Positionner les guides de lumière de telle sorte que la surface corticale est éclairé de façon uniforme. Protéger la craniotomie de la lumière produite par le stimulus visuel d'affichage. Présenter une séquence de stimuli visuels et d'enregistrer des images de réflectance de données. Pour générer une carte d'orientation à l'intérieur de 10 min, collecter des données correspondant à 4 répétitions d'une séquence de stimuli 8 (4 orientations et deux directions pour chaque orientation).
  5. Analyser les données de signal intrinsèque pour générer une carte en fausses couleurs orientation. Sélectionnez régions cibles potentielles pour les deux photons étiquetage des neurones, par exemple, l'orientation des singularités moulinet - points dans la carte oùtoutes les orientations préférentielles convergent (Figure 2A). Superposer la carte et l'orientation de l'image de la vascularisation de la surface corticale (figure 2B-C). Utiliser la mise en page de domaines fonctionnels et l'emplacement des bateaux de grandes surfaces pour sélectionner une cible en évitant les endroits les gros vaisseaux sanguins et des artérioles 15.

3. Chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes

  1. Préparer une solution de Pluronic 20% / DMSO en ajoutant 1 Pluronic g dans 5 ul de DMSO. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min pour dissoudre complètement le Pluronic. Laissez le mélange refroidir à température ambiante. Ajouter 4 pl du mélange Pluronic / DMSO dans un flacon de 50 mg de calcium de l'indicateur fluorescent Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Puis ajoutez 1 ul d'un colorant rouge (Alexa Fluor 594, solution mère 2 mM) et 35 ul de solution de la pipette (voir Matériel) pour une concentration finale de 1 mM OGB-1 AM. Soniquer la solution pendant une demi-heure dansun bain d'eau glacée, puis centrifuger avec un filtre de 0,45 um pour éliminer les impuretés.
  2. Tirez une pipette cône long avec un diamètre extérieur de 2,0 à 2.5 pointe um. Chargez 5 ul du mélange de colorants dans la pipette.
  3. Enlever la couche finale de durée pour faciliter l'insertion de pipette et obtenir la meilleure qualité d'images à deux photons.
  4. Déterminer l'emplacement exact sur la surface corticale que la pipette doit être placé de manière à atteindre son objectif dans la couche corticale 2/3. Notre cible prédéterminée corticale est une singularité moulinet dans le plan d'orientation (figure 2). La pipette doit être enfoncé dans le cortex à un angle de 30 ° pour passer entre la paroi de la chambre et l'objectif. Ainsi, pour marquer la zone cible 200 um en dessous de la surface corticale, la position d'entrée de pipette sur la surface corticale sera d'environ 350 um latérales de la position de consigne (figure 3 AB).
  5. Déplacer la table XY (sur lequel l'animal et le pmicromanipulateur ipette sont placés) au centre de la position de l'entrée de la surface corticale titre de l'objectif (figure 3C). Utilisez un objectif 20x ou 40x avec une distance de travail (WD) d'au moins 3 mm (voir Matériel) pour s'assurer que la pipette sera facilement entrer dans le cortex sans toucher l'objectif ou de l'os le long de la paroi de la craniotomie. Une fois la position d'entrée est centrée titre de l'objectif, relever la position Z de l'objectif de 2 mm (figure 3D). Avec l'épi-fluorescence verte de lumière activé pour visualiser le colorant rouge Alexa dans la pipette, l'utilisation de l'axe diagonal de la micromanipulateur pour déplacer la pipette jusqu'à ce que sa pointe est centrée (et concentrée) de l'objectif au dessus de la position d'entrée de la surface corticale ( Figure 3E).
  6. Abaissez la verticale pipette (le long de l'axe z) jusqu'à ce que la pipette atteint la surface corticale (figure 3F), tout en continuant à visualiser la pointe de pipette à travers le oculars du microscope. Utilisation éclairage sur fond clair, les vaisseaux sanguins de surface corticales et autres membranes méningées (pie-mère et arachnoïde) sont facilement visibles dans la pipette se rapproche de la surface corticale. Si la pipette ne pas atteindre la position souhaitée d'entrée, augmenter la pipette et recalibrer le ciblage sur la base des repères vasculaires sur la surface corticale.
  7. Retirez l'objectif, mèche excès de liquide céphalorachidien de la craniotomie et sécher l'os adjacent en utilisant des lances d'absorption non pelucheux. Appliquez une goutte d'eau tiède 3% d'agarose (dissous dans ACSF) pour stabiliser le cortex qui est visible à travers la craniotomie (figure 3G). Chez les non-rongeurs, agarose à 3% est nécessaire pour amortir les pulsations de l'absorption réussie de colorants fluorescents par des neurones. Pour l'imagerie optique intrinsèque signal de seulement 2% d'agarose est nécessaire parce que la combinaison de 2% d'agarose et la lamelle assure la stabilité nécessaire. Ici, pas de couvre-objet est utilisé pour l'étape de chargement afin de colorant 3% d'agarose estnécessaire. Après l'agarose est solidifié, insérer un objectif 40x (0,8 NA, 3,3 mm DEO) et re-remplir la chambre avec ACSF.
  8. Passez du champ lumineux à deux photons de visualisation et de localiser la pointe de la pipette. À l'aide de l'axe diagonal de la micromanipulateur, déplacer la pipette jusqu'à ce que son extrémité atteint la profondeur désirée dans le cortex (figure 3H). Occasionnelles bouffées d'éjection de pression du mélange de colorants (un peu psi, chaque impulsion 0,1 sec) aidera à prévenir la pointe de la pipette de colmatage. Car OGB-1 heures ne devient visible lors de l'entrée des cellules, le rouge Alexa colorant est critique pour la visualisation de la pointe de la pipette à l'intérieur du cortex.
  9. Avant d'essayer de charger des neurones dans la couche corticale 2/3 avec la pleine dose de colorant, re-concentrer sur l'objectif de la surface corticale pour confirmer la profondeur de la pointe de pipette et faire en sorte que la pointe se trouve à l'emplacement cible en fonction de la disposition des les vaisseaux sanguins de surface. Si la pipette est dans la couche 2/3, de petites bouffées du mélange de colorants devraient éclairer laespace extracellulaire et de révéler un ensemble dense de corps cellulaires circulaires que les ombres sombres.
  10. Pour le chargement de corps cellulaires neuronaux dans une sphère de diamètre 300-600 um cortex, injecter le mélange de colorants dans l'espace extracellulaire en utilisant 30-90 impulsions, chaque impulsion 1,0 s, 2-10 psi. Les impulsions de pression ne doit pas être si forte que le tissu se déplace. Après l'injection est terminée, attendez quelques minutes, puis retirer la pipette et objective. Attendez pendant 1 heure pour permettre à l'OGB-1 AM à être pleinement prises en livraison par les neurones.
  11. Retirer l'agarose utilisé pour la charge de colorant et rincer la chambre d'enregistrement. Mettez une petite goutte de 2-3% d'agarose sur la surface et placer rapidement une lamelle sur la craniotomie. Parce que les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière, évitez de surexposer le cortex de champ lumineux ou épi-lumière fluorescente. Insérer une grande ouverture numérique (1,0) 20x objectif dans la monture d'objectif et recentrer la région corticale marquée titre de l'objectif en utilisant la scène xy. Protégez la craniotomie de l'exdes sources de lumière, par exemple des traneous affichage stimulus visuel, en utilisant des couches multiples de matériau panne.

4. Une seule cellule électroporation de colorants fluorescents

  1. Pour étudier la morphologie dendritique, préparer une solution de 100 uM Alexa Fluor 594 (dilution 1:20 dans ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 actions). Pour l'imagerie fonctionnelle des dendrites d'un sel d'OGB peuvent être utilisées 16,17.
  2. Tirez une pipette cône de long avec un diamètre de buse de 1 um et charger 5 ul de colorant dans la pipette. Toutes les autres étapes de cibler un domaine fonctionnel sont identiques à la méthode de chargement en vrac (figures 1-3). Pour positionner la pointe de pipette adjacente à une membrane le corps des cellules neuronales, de surveiller l'augmentation de l'impédance d'électrode et d'appliquer des bouffées de pression de colorant pour éclairer l'espace extracellulaire et de voir les corps cellulaires comme des ombres au cours de deux photons d'imagerie.
  3. Lorsque la pointe de la pipette est adjacente à une membrane de cellule neuronale corps, utiliser le 800A Axoporator à appliquerImpulsions 1-3 (-8 à -10 V, 10 ms d'impulsion). Le remplissage immédiat du neurone avec le colorant est facilement visualisées avec microscopie à deux photons. Retirer la pipette et de recueillir des images haute résolution des dendrites et des axones in vivo.

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Résultats

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Pour illustrer la précision de nos méthodes de marquage colorant, nous avons ciblé le plus petit micro-domaine d'une carte fonctionnelle connue dans le néocortex non-rongeur. Peu ponctué toute la carte d'orientation dans le cortex visuel primaire sont des singularités. Ils se produisent en des points où convergent toutes les orientations privilégiées telles que les cartes en fausses couleurs de l'orientation préférée, les régions autour de la singularité regard comme "moulinets" (Figure 2A-B). Un moulin...

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Discussion

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Nous présentons une méthode pour cibler l'étiquetage des corps cellulaires neuronaux (ou dendrites et axones) dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Fusion d'imagerie optique intrinsèque du signal avec la microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer lequel des synapses et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte selon l'une quelconque fonctionnel, que ce soit les corrélats neuronaux de sélectivité avec l'emplacement du neurone dans un plan fonctionnel,...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du National Eye Institute R01EY017925 et R21EY020985 et le financement de la Fondation Dana et Whitehall au PK Nous remercions également Matthieu Petrella de l'aide pour les procédures chirurgicales, Grace Dion pour tracer les dendrites indiquées sur la figure 5A, et Pratik Chhatbar pour commentaires sur le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom de réactif / Matériel Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
1. Soutien de la vie / expérience de préparation
L'isoflurane Vet Webster NDC 57319-474-05
Vaporisateur isoflurane Midmark VIP 3000
Couverture chauffante Commentaires réglementé Harvard Apparatus 50-7079F
Moniteur ECG Digicare biomédicale LifeWindow Lite
Amplificateur EEG Systèmes AM 1800
Moniteur d'affichage EEG Hewlett Packard 78304A
En fin d'expiration CO 2 moniteur Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimiser la ventilation
Les bavures de perçage en carbure pour perçage os Henry Schein fin (0,5 mm pointe) et grossière (1,25 mm pointe)
Ciment pour plaque de tête / chambre Dentsply 675571, 675572
Black Powder Tempera Peinture Sargent Art Inc 22-7185 Ajouter au ciment pour améliorer la protection contre la lumière et réduire les reflets
Agarose - type III-A Sigma A9793 Pour minimiser les pulsations pendant le signal intrinsèque et à deux photons d'imagerie
Lamelle: 5 ou 8 mm de diamètre, 0,17 mm d'épaisseur Précision Monde eninstruments 502040, 502041 Pour minimiser les pulsations pendant l'imagerie, la lamelle peut être découpé selon les besoins
Curettes Brudon George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Nettoyage de surface du crâne
La cire à os Ethicon W31G Rapidement arrêter le saignement
Coton-tige Sciences microscopie électronique 72308-05 Surface de l'os propre et sec
Dumont # 5co forceps Outils Fine Science 11295-20 Prenez différentes couches de dure-mère ou pia
Vannas Ciseaux Spring Outils Fine Science 15000-03 Cut-mère
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 Pour arrêter le saignement sur la durée
Lances d'absorption Outils Fine Science 18105-01 Mèche ultra-rapide et non pelucheux du CSF
Matériau Blackout Thorlabs BK5 Bouclier craniotomie
2. Teindre préparation / injection
Le diméthylsulfoxyde (DMSO) Sigma D2650
Pluronic Sigma P2443
Oregon Green 488 BAPTA-une heures Invitrogen O6807 Indicateur de calcium
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Filtre centrifuge (0,45 um taille des pores) Millipore UFC30HV00 Pour éliminer les impuretés avant l'injection
Verre pipette extracteur Sutter Instruments P97
Verre borosilicaté filamenter capillaire (1,5 mm de diamètre extérieur) World Precision Instruments 1B150F-4 Pipette d'éjection Dye
Microloader Eppendorf 5242 956 003 Pour charger un colorant dans pipette
Micromanipulateur Sutter Instruments MP-285 Pour positionner la pipette
Contrôleur d'impulsion de pression Parker Hannifin PicoSpritzer III Pour l'injection sous pression de la teinture
Une seule cellule électroporateur Molecular Devices Axoporator 800A Pour l'électroporation de la teinture
3. Intrinsèque imaGing
Objectif 4x (0,13 NA, 17 mm WD) Olympe UPLFLN4X
Matériel intrinsèque / logiciel Optical Imaging Inc Imager 3001 / VDAQ VDAQ logiciel est utilisé pour l'imagerie épisodique
Caméra CCD Adimec Adimec-1000
Voyant d'alimentation source de KEPCO ATE 15-15M
Source lumineuse Optical Imaging Inc HAL 100 L'intensité lumineuse à la surface corticale est de 3-5 mW
Filtre vert (pour image vasculaire) Optical Imaging Inc λ = 546 nm (bande passante 30 nm) Pour une image de référence de la vascularisation de surface
Filtre Rouge (pour le signal intrinsèque) Imagi optiqueng Inc λ = 630 nm (bande passante 30 nm) Pour collecter des signaux intrinsèques
Heat filtre Optical Imaging Inc KG-1
4. À deux photons rig / imagerie
Microscope à deux photons et les logiciels Technologies des Prairies Voir Shen et al. 2012 pour trajet de la lumière, les filtres et la puissance du laser
Laser Ti: Saphir Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0,5 NA; 3,5 mm WD) Olympe UMPLFLN20X 0,5 NA objectif est utilisé uniquement pour l'alignement de la pipette au-dessus de la craniotomie (pas de deux photons d'imagerie)
20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) Olympe XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) Olympe LUMPLFLN40X/IR
Table pneumatique Newport ST-200 Isole la préparation de vibrations externes
XY Mike Machine Co. (Attleboro, MA) Sujet expérimental et micromanipulateur Sutter placés sur scène xy
Recettes
Artificielle liquide céphalo-rachidien NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4
Solution Pipeter 14 NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4

Références

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Mots-clés

Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

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