Analyse quantitative de l'autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Summary

L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Abstract

Cancer de la prostate est le plus grand sous forme de tumeurs malignes chez les hommes aux Etats-Unis Alors que la chirurgie comporte un risque important de l'impuissance et l'incontinence, les approches chimiothérapeutiques classiques ont largement échoué. L'hormonothérapie est efficace à un stade précoce, mais échoue souvent avec le développement éventuel de tumeurs hormono-réfractaires. Nous sommes intéressés à développer des produits thérapeutiques ciblant déficience métabolique spécifique des cellules tumorales. Nous avons récemment montré que les cellules tumorales de la prostate n'ont pas spécifiquement une enzyme (synthase argininosuccinate ou ASS) impliquée dans la synthèse de l'arginine ¹ acide aminé. Cette condition provoque les cellules tumorales de devenir dépendant de l'arginine exogène, et ils subissent un stress métabolique lorsque arginine libre est épuisée par l'arginine déiminase (DJA) ^{de 1,10.} En effet, nous avons montré que les cellules cancéreuses de la prostate de l'homme CWR22 Rv1 sont effectivement tués par ADI à l'apoptose caspase-indépendante et autopha agressifgy (ou macroautophagie) ^1,2,3. L'autophagie est un processus évolutif conservée qui permet aux cellules à métaboliser les protéines indésirables par répartition lysosomale durant la famine nutritionnel ^4,5. Bien que les composantes essentielles de cette voie sont bien caractérisés ^6,7,8,9, de nombreux aspects du mécanisme moléculaire sont encore mal connues - en particulier, quel est le rôle de l'autophagie dans la mort-réponse des cellules cancéreuses de la prostate après traitement ADI ? Afin de répondre à cette question, nous avons demandé une méthode expérimentale pour mesurer le niveau et l'ampleur de la réponse autophagie dans les cellules - et puisqu'il n'y a pas de marqueurs moléculaires connues qui peuvent suivre avec précision ce processus, nous avons choisi de développer une approche basée sur l'imagerie, à l'aide la microscopie à fluorescence 3D quantitative ^11,12.

Utiliser CWR22Rv1 spécifiquement les cellules marquées avec des sondes fluorescentes pour autophagosomes et des lysosomes, nous montrons que les piles d'images 3D acquises soit avec wimicroscopie à déconvolution defield (et plus tard, avec des super-résolution, microscopie structuré-illumination) peut capturer clairement les premiers stades de l'induction autophagie. Avec des applications d'analyse d'images numériques disponibles dans le commerce, nous pouvons facilement obtenir des informations statistiques sur nombre autophagosome et lysosome, la taille, la distribution, et le degré de colocalisation de n'importe quelle cellule imagé. Cette information nous permet de suivre précisément l'évolution de l'autophagie dans les cellules vivantes et permet à notre enquête continue sur le rôle de l'autophagie dans la chimiothérapie du cancer.

Protocol

1. Partie 1: Culture de cellules et d'étiquetage immuno-fluorescent

1. Cultivez CWR22 Rv1 cellules tumorales de la prostate de l'homme sur le verre de lamelles (# 1.5 ou 170 um d'épaisseur) placées dans des plaques 6 puits, avec RPMI (Mediatech, VA) contenant 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine / glutamine.
2. Induire l'autophagie en traitant des échantillons choisis avec l'arginine déiminase (ADI, 0,3 pg / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS).
3. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% (PFA, Fisher Scientific, NH) dilué dans du PBS, 100 pl par lamelle, pendant 10 min à température ambiante.
4. Laver les cellules 3x avec 1 ml HBS / BSA.
5. Perméabiliser cellules avec 0,05% de saponine (Sigma, MO) dans HEPES (HBS) / BSA, 100 pi par lamelle, pendant 15 min à température ambiante.
6. Avant d'immuno-marquage, des échantillons de blocs avec 2,5% de caséine (Sigma, MO) dans HBS / BSA, 100 pi par lamelle, pendant 1 heure à température ambiante.
7. Incuber les cellules fixées avec des anticorps primaires dilués dans 2,5% de caséine / HBS / BSA, 100 pi par coverslip, O / N à 4 ° C.
8. Laver les cellules 3x avec 1 ml HBS / BSA.
9. Incuber les cellules fixées avec des anticorps secondaires dilués dans 2,5% de caséine / HBS / BSA, 100 pi par lamelle, pendant 1 heure à température ambiante.
10. Laver les cellules 3x avec 1 ml HBS / BSA.
11. Monter les lamelles préparés sur des lames de microscope en verre régulièrement avec de l'or SlowFade ou prolonger réactif antifade Gold (Invitrogen, CA) contenant 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
12. Bords Seal lamelle vernis à ongles. Pour de meilleurs résultats d'imagerie, laisser le temps (idéalement O / N) pour les supports anti-décoloration de pénétrer à fond les cellules.
13. Surface de la lamelle propre avec du méthanol et / ou le chloroforme.
14. Ajouter l'huile d'immersion (indice de réfraction 1.520 lorsque l'imagerie à 37 ° C, ou lorsque 1.516 imagerie à température ambiante) à l'1,42 NA objectif 60X (Olympus, Japon).
15. glissière de position sur la platine du microscope et d'établir mise au point avec les cellules d'intérêt.

2. Partie 2: Préparation des cellules pour l'imagerie en direct

1. Cultivez CWR22 Rv1 cellules exprimant la protéine fluorescente verte couplé à chaîne légère 3 (LC3-GFP) dans des milieux de culture RPMI contenant 10% de FBS et 1% d'antibiotiques sur 35 mm de boîtes de culture à fond de verre revêtues de poly-D-lysine (MatTek, MA). Les cellules doivent être étalées à une densité suffisante pour faciliter la prolifération rapide, mais pas autant que les cellules sont envahies et agglomérées au moment de l'imagerie.
2. Traiter les échantillons de cellules sélectionnées avec ADI (0,3 pg / ml) dans du PBS.
3. Environ 1 heure avant l'imagerie, diluer 1,5 l de Lysotracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) avec 20 ml de RPMI. contenant 10% de FBS et 1% d'antibiotiques. Utiliser des solutions contenant des DJA pour les échantillons sélectionnés. Chauffer tous les médias à 37 ° C avant d'ajouter dans la boîte de culture.
4. Incuber les cellules avec du RPMI contenant Lysotracker Red DND-99 pour 15-45 min à 37 ° C.
5. Environ 30 minutes avant l'imagerie, allumer l'enceinte de l'environnement WeatherStation et laisser s'équilibrer à 37 ° C et 5% de CO ₂ (avec Humidifair IED).
6. Laver les cellules avec du PBS et remplacer le support à la norme RPMI contenant seulement 10% de FBS et 1% d'antibiotiques. Ajouter ADI à des échantillons comme indiqué.
7. Plats mont 35 mm lamelle à fond dans la culture adaptateur personnalisé (Applied Precision Inc., WA) et la position sur la platine du microscope. Utilisez l'huile d'immersion (indice de réfraction 1.520) sur la lentille de l'objectif 1,42 NA 60X, et positionner la boîte de culture monté sur la scène.

3. Partie 3: microscopie et analyse Déconvolution

Le protocole de cette section suppose l'utilisation de la DeltaVision Personal DV microscope de déconvolution et associé Softworx Application Suite (Applied Precision Inc., WA).

1. Activer le système de microscope, comprenant poste d'acquisition et de commande de l'instrument. Ouvrez l'application Resolve3D pour initialiser la platine du microscope et allumer la source de lumière au xénon. Laisser 10 min pour la source lumineuse pour se réchauffer et atteindre des conditions stables.
2. Ajouter unegoutte d'huile à immersion (indice de réfraction de 1,520 pour les échantillons vivantes à 37 ° C ou de 1,516 pour les échantillons fixes à TA) sur l'1,42 lentille 60X d'objectif NA, et échantillon de lame centrale (couvercle visage de glissement vers le bas) par rapport à la lentille d'objectif.
3. En utilisant soit éclairage sur fond clair ou externe et la mise au point grossière bouton de réglage, élever lentement la lentille d'objectif jusqu'à ce que le bourrelet de l'huile d'immersion est en contact avec le verre de recouvrement inverse. (De ce point, la couche de cellules devrait venir en discussion au sein de quelques tours de mise au point fine bouton de réglage). Lorsque vous travaillez avec des échantillons fixés sur les lames, il est recommandé d'éviter les cellules à l'intérieur ou à proximité de zones avec des bulles. Lors de la visualisation avec des échantillons vivants sur le plat à fond de verre, éviter de déplacer la lentille de l'objectif à l'extérieur de la limite de la lamelle de verre.
4. Autophagosomes peuvent être identifiés par le signal eGFP (vert). Les lysosomes sont identifiés par Lysotracker Rouge (échantillon en direct) ou anticorps fluorescents anti-Lamp1 (échantillon fixe). Les noyaux cellulaires sont identifiés par DAPI stAining (échantillon fixe).
5. Sélectionnez le champ de vision souhaité. Idéalement, les cellules doivent présenter une bonne signal fluorescent dans tous les canaux appropriés et suffisamment attachés et étalé sur la surface de la lamelle afin que le contenu intracellulaires sont faciles à visualiser. De petits ajustements à x latéraux, y et z-focus peuvent être contrôlés par l'ordinateur via l'interface Acquire3D. Réglez binning 1x1 ou 2x2 pour, selon le champ de vision souhaité (plus de cellules peuvent être vus sur le terrain lorsque binning est mis à 2x2).
6. Pour une image donnée à travers la partie centrale d'une cellule, définissez les paramètres d'exposition (par exemple, la puissance de transmission% et le temps d'exposition) tels que l'intensité maximale de pixel ne dépasse pas 3.000 points. En règle générale, la transmission de% doit être réglé aussi bas que possible, sans augmenter le temps d'exposition correspondant plus de 1 sec. Répétez cette procédure pour chaque couleur de fluorescence à imager et pour chaque champ séparé de vue pour obtenir les images de haute qualité.
7. Réglez le ulimites REPP et inférieure de la pile Z de par réglage de la mise au point juste un peu plus haut et en bas de l'échantillon de cellules, respectivement. Le nombre total d'images dans un pays donné Z-stack sera donc déterminé par ces limites et par l'espacement entre les couches (valeur par défaut: 0,2 um).
8. Afin de minimiser les artefacts de mouvement lors de l'acquisition de l'image, nous vous recommandons de régler le mode d'acquisition d'image de «longueur d'onde alors z-stack» pour les échantillons fixes, et «z-stack alors longueur d'onde" pour des échantillons vivants.
9. Images de fluorescence sont déconvoluées utilisant Softworx (Applied Precision, WA) et plus tard analysées à l'aide Volocity (Improvision, maintenant Perkin Elmer, MA).

4. Partie 4: Super-résolution, Structured-éclairage (OMX) Microscopie

Le protocole de cette section s'appliquent à l'utilisation du microscope à éclairage structuré OMX (Applied Precision, WA).

1. Allumez l'interrupteur principal et les lasers souhaités (410 nm, 488 nm et / ou 532 nm). Attendre 20 min pour les lasers à stabiliser thermiquement.
2. Ajouter l'huile d'immersion (indice de réfraction 1.516 pour les échantillons fixes à RT) sur la lentille de 1,42 NA objectif 60X. Si des bulles apparaissent dans la gouttelette d'huile, nettoyez l'objectif et ajouter de l'huile à nouveau.
3. Placez la lame échantillon sur la scène et, si nécessaire, laissez 10 min pour les cellules à s'installer sur la lamelle.
4. Initialiser le programme d'acquisition. Utilisez un éclairage par fluorescence pour ajuster la mise au point jusqu'à un contour net de la cellule peut être vu. (Il convient de veiller en tout temps à minimiser l'exposition de cellules à fluorescence excitation, jusqu'à l'acquisition de l'image réelle).
5. Une analyse de la mosaïque en spirale peut être acquise pour avoir un aperçu plus grandes zones de l'échantillon pour sélectionner des cellules ou des régions d'intérêt. Il est recommandé d'utiliser des temps d'exposition courts (1-10 msec) et de faible puissance d'excitation (0,1-1% transmission) lors de l'analyse de l'échantillon ou de trouver des cibles.
6. Identifier autophagosomes par GFP-LC3 fluorescence. Identifier les lysosomes par Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Protéine de la membrane des lysosomes associée) et les noyaux des cellules en utilisant DAPI (échantillons fixes).
7. Choisissez conditions expérimentales dont la longueur d'onde d'excitation, zone d'image (par exemple 512x512), l'épaisseur de la pile, le temps d'exposition, et le pourcentage de transmission laser. Pour des images super-résolues, vérifiez que l'option d'éclairage structuré est activée. Pour la microscopie de déconvolution sur l'OMX, sélectionnez l'option d'éclairage conventionnel.
8. Pour obtenir les meilleurs résultats de reconstruction, sélectionner des conditions expérimentales telles que le nombre maximum d'intensité se situe entre 10.000 et 15.000 lors de l'acquisition. Si photoblanchiment est un sujet de préoccupation, l'imagerie à une exposition plus faible (compte entre 5.000 et 10.000) peut être utilisé. Idéalement, les comtes ne doivent pas diminuer de plus d'un facteur de deux au cours de l'ensemble de l'acquisition, et une diminution de plus d'un facteur de quatre doivent être évités. Si nécessaire, réduire l'épaisseur de la pile afin d'assurer un comptage d'intensité prolongée. La caméra sature à 64.000 points, de sorte maximumintensité ne doit jamais dépasser cela. Pour obtenir de bons échantillons, nous avons trouvé les conditions expérimentales être de 10 ~ 50 ms temps d'exposition à la transmission de laser de 1%. Échantillons et lumineuses photostable qui peuvent être imagés à plusieurs reprises sont préférés. Une tache stable est nécessaire pour time-lapse, images super-résolues.
9. Pour réduire le bruit, la vitesse de lecture 95MHz (option de vitesse moyenne) et le temps d'acquisition de 2 millisecondes ou plus est recommandée. Augmentation des artefacts sont obtenus dans le imagée reconstruit, lorsque l'échantillon se déplace lors de l'acquisition. Grâce à cet effet, de courtes expositions sont recommandés pour les cellules non adhérentes ou rapide.
10. imagerie multicanal peut être réalisée simultanément ou successivement. Rendements mode séquentiel moins diaphonie et est donc recommandé.
11. Pour réduire photoblanchiment, il est généralement recommandé d'image avec des longueurs d'onde d'excitation premières (532 nm, 488 nm, puis 410 nm). Cependant, les résultats expérimentaux présentés dans la figure 3, cet ordre a été inverséd (soit 48 nm, 532 nm et 410 nm) due à la photostabilité de cet exemple particulier.
12. Définir la limite supérieure / inférieure de la Z-stack en déplaçant la platine du microscope jusqu'à ce que le haut / bas des cellules est légèrement floue. La distance souhaitée entre chaque image doit être maintenu constant à 0,125 um pour l'imagerie super-résolution, en tant que logiciel de reconstruction prendre cette valeur par défaut.
13. Reconstruire des piles d'images à l'aide de Softworx (Applied Precision, WA) et d'analyser l'utilisation Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA).

Results

La séquence d'image le montre la figure 1 montre les changements physiques qui se produisent dans les cellules CWR22 pendant les 80 premières minutes de l'induction autophagie. Dans cette étude et d'autres (non représenté), nous avons observé constamment: (1) le déplacement du noyau du centre de la cellule, (2) la réduction des points d'adhésion focale, et (3) la translocation général de autophagosomes et des lysosomes vers le centre de la cellule. En outre, nous avons également observé une légère augme...

Discussion

Bien que l'observation directe des cellules marquées avec des sondes fluorescentes contre LC3 est largement acceptée comme une méthode standard pour confirmer la réponse autophagic ^6, l'imagerie 3D quantitative du même système (comme nous l'avons fait) fournit des informations sans précédent et les détails sur le processus complexe de l'autophagie cellulaire . En particulier, nous observons que des centaines (voire des milliers) de autophagosomes dans les cellules vivantes sont formés dans 80 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arginine Deiminase (ADI)	DesigneRx
HEPES	Sigma	H4034
Caséine	Sigma	C5890
Paraformaldéhyde	Fisher	4042
Saponine	Sigma	S4521
Alexa anti-souris 555	Invitrogen	A21422
Alexa anti-lapin 647	Invitrogen	A21244
LysoTracker Rouge DND-99	Invitrogen	L7528
anti-Lamp1	DSHB	H4A3
anti-Cadhérine	Signalisation cellulaire	#3195
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936
35 mm plaque inférieure en verre revêtu de poly-d-lysine	MatTek	P35GC-1.5-1.4-C
N°1, lamelle de 22 mm	Corning	#2865-22
Lames de microscope	Globe Scientific	1324G