Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA'ların görselleştirilmesi

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir

Abstract

Ökaryotlarda salgılanan ve membran proteinleri endoplazmik retikulum (ER) yüzeyine lokalizedir kodlamak haberci RNA'lar (mRNA) çoğu. Bununla birlikte, bu mRNA'ların görselleştirme zor olabilir. Bu mRNA yalnızca bir kısmını ER ilişkili olduğunda özellikle doğrudur ve bu organel kendi dağıtım olmayan hedefli (yani "özgür") transkript tarafından engelleniyor. Aynı anda ER bütünlüğünü korurken ER-ilişkili mRNA izlemek için, biz, hücreler seçici olarak plazma zarının bir permeabilizes digitonin ekstraksiyon çözeltisi için kısa bir maruz kalma ile muamele edildiği bir yöntem geliştirilmiştir ve bu nedenle sitoplazmik içeriğini kaldırır adres . Bu yöntem in situ hibridizasyon (FISH) flüoresan ile birleştiğinde, biri açıkça floresan mikroskobu ile ER-bound mRNA'ların oluşturulabiliyor. Bu protokol kullanılarak yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri için ya da ER-bağlantının derecesini tespit edilebilirve hatta sayılabilir. Bu süreç içinde bir mRNA ER etkileşimlerinin doğası araştırmak için bu testte kullanılabilir.

Introduction

Ökaryotlarda mRNA kodlama çeviri 3,4 sırasında ribozomlar ve translocons arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla salgılanan ve membran proteinlerinin eş Çevrimsel sinyal tanıma parçacık 1,2 ER hedeflenebilir ve ER korunabilir. Ancak, mRNA hedefli ve ribozomlar veya çeviri birinin ER bağımsız üzerinde muhafaza edilip edilemeyeceğini çok yakın zamanlara kadar belli değildi. Önceki çalışmalar hücresel fraksiyonlama teknikleri kullanılarak ER ile çeviri bağımsız mRNA ilişki olup olmadığını değinmeye çalıştık. Sert kimyasal koşulların potansiyel hassas mRNA-ER dernek kesebileceği ER türetilmiş veziküller, ribozomların kesmek için gerekli olduğu için, bu çalışmalarda 5-8 delil sağlayan, sonuçsuz ve 9,10 karşı ribozomal bağımsız mRNA ER ankraj .

Bu sorunları aşmak için bir proto geliştirdikcol yalıtmak ve görüntü ER bağlı mRNA'ların için. Bu prosedür, aynı anda ER morfoloji ve ilişkili moleküllerin tüm koruyarak etkin bir şekilde hücre (ER-bağlı olmayan mRNA dahil), tüm içerik sitoplazmik kaldıran bir hafif çıkarma tedavi, içerir. Bu protokolü kullanarak biz mRNA'ların bir alt hedef ve sonra bağımsız ribozomlar veya çeviri 11 ER muhafaza olduğunu göstermiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ekstraksiyon için Materyallerinin Hazırlanması

  1. Hücre Hazırlanması
    1. Deney öncesinde en az bir gün için asit ile tedavi edilen lameller üzerine Tohum doku kültürü hücreleri. Bu iki hücre hatları salgılanan protein güçlü üretim sergilemek ve iyi tanımlanmış bir ER sahip olarak biz, COS-7 veya U2OS kullanın. Yüksek ekstraksiyon verimi elde etmek için, hücrelerin deney gününde lamel confluency% 80 geçmemesi gerektiğini unutmayın.
    2. Belirli bir eksojen mRNA araştırılmaktadır, hücreler transfeksiyon standart protokoller kullanılarak ilgilenilen geni ihtiva eden plasmidler ile tohumlama bir gün sonra, transfekte edilir. Hücreler daha sonra ekstre etmeden önce en azından 18 saat için mRNA ifade etmek için izin vardır.
  2. Çeviri İnhibitörleri ile Hücreleri Tedavisi
    1. ER ile mRNA'ların dernek bakım sağlam ribozomların etkisini test etmek için, hücrelerin dernek bozabilir çeviri inhibitörleri ile tedavi edilebilirmRNA 11 ribozomların.
    2. (4-metil-2 ,6-dinitroanilino -) - bu tür homoharringtonin (HHT), pactamycin ya da 2 gibi bir çeviri başlatma inhibitörü, aynı anda için meşgul ribozom izin verirken, N-methylpropionamide (mdmp), transkript ile ilişkilendirilmesi yeni ribozom önlemek Çeviri 12-14 tamamlayın. Memeli hücrelerinde en proteinler için çeviri oranı ne olursa olsun, kodon kullanım veya mRNA uzunluğu 15, ikinci başına 5 amino asit olduğu için, 30 dakikalık bir muamele 27,000 nükleotidler (proteinler için kodlama yapan sürece açık okuma çerçeveleri ile mesajların ribozom kapalı temizlemek gerekir ) 9,000 amino asitler sürece.
    3. Böyle puromisin gibi İnhibitörleri doğmakta zincirin erken ejeksiyon teşvik etmek ve böylece polysomes 12 bozabilir. Ancak tamamen mRNA ile puromisin-tedavi ribozomların dernek bozmaya, EDTA gibi magnezyum şelatörlerin digitonin ekstraksiyon tamponu 11 eklenmelidir.
      4. <li> Bu deneyde, hücreler 200 uM puromisin, 5 uM HHT, veya ekstraksiyon önce 30 dakika için kontrol aracı ile tedavi edilir.
  3. Digitonin Ekstraksiyon Tampon hazırlanması. Ücretsiz (yani sitoplazmik, non-ER-ilişkili) transkript engel olmadan ER-yerelleştirilmiş mRNA'ların görselleştirmek için, biz seçici digitonin, 3β-hydroxysterols ile tercihen etkileşime bir steroid glikozit ile hücre geçirgenliği. Düşük konsantrasyonlarda, digitonin seçici 'leakiness' 16 sebep plazma zar bölümleri permeabilizes. Aksine, kolesterol yoksul ER zarı ve çekirdek zarı, 16,17 değişmeden kalır.
    1. Digitonin (Sigma Aldrich) tozu% 5 ağırlık / hacim deiyonize su içinde çözülür ve bu stok çözelti küçük miktarlar halinde bölünüp edilir ve -20 ° C'de saklanır Bizim tecrübelerimize göre, birden fazla donma-çözülme döngüleri çözünmüş digitonin verimini azaltır.
    2. Bir stok solüsyonuCHO 10x tampon (1x çalışma çözeltisi konsantrasyon: 115 mM Kac, 25 mM HEPES pH 7.4, 2.5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 150 mM sakaroz), RNase içermeyen reaktiflerle hazırlanır ve -20 ° C'de depolanır Bir çalışma çözeltisi (1 x tampon CHO) RNase içermeyen su ile stok çözelti seyreltilmesi ile hazırlanır ve 4 ° C'de saklanır

2. Digitonin Ekstraksiyon

  1. Ekstraksiyon Çözümleri hazırlanması
    1. Düz bir yüzeye sahip ısıtma bloğu ısıtılır ila 40 ° C ile ekstraksiyon sırasında bu sıcaklıkta tutulur.
    2. RNase içermeyen bir çalışma düz bir yüzey oluşturmak için, ısıtma bloğu Parafilm M (Bemis Company, Inc) taze bir parça ile bir miktar su ve üste konan ile nemlendirilir. Parafilm levha ve ısıtma bloğu arasındaki hava kabarcıkları RNaz içermeyen eldiven ve Kimwipes (VWR) kullanılarak düzgünleştirilir.
    3. 1x CHO tampon, bir su banyosu içinde inkübe edilerek 37 ° C'ye kadar ısıtılır.
    4. 6 oyuklu plakalar yıkamak için kullanılırve hücreler sabitleyin. 3 kuyuda her satırı bir kapak kayma için kullanılır. Satırdaki birinci iki kuyu için ısıtılmış CHO tampon, 2 ml ilave edilir. Son olarak da için, tespit çözelti 2 ml (PBS +% 4 paraformaldehit (Elektron Mikroskop Bilimleri)) ilave edilir. Hücreleri çıkarılması için hazır olana kadar Bu kaset 37 ° C inkübatör saklanabilir.
    5. Digitonin ekstraksiyon çözeltisi hemen önce kullanmak için sıcak CHO tamponu ile% 0.025 için stok digitonin çözüm seyreltilmesi ile hazırlanır. Yine puromisin işlenmiş hücreleri için, ekstraksiyon tamponu ilave verimli ribozomların 11 bozmaya 20 mM EDTA içermelidir unutmayın. Ekstraksiyon çözeltisinden 100 ul damlaları çıkarma hemen önce, parafilm kaplı bir ısıtma bloğu üzerine yerleştirilir.
  2. Digitonin Ekstraksiyon ve Hücre Fiksasyon
    1. 37 ° C inkübatör gelen hücreleri çıkarın.
    2. Ayıklama işlemi sırasında, lamelleri Jewler forsepsi yardımı ile işlenir. Ileforseps lamel pick up ve büyüme orta yıkamak için de içeren ikinci sonra birinci ve CHO tampon içine batırın.
    3. Hızla bir Kimwipe ile lamel arka tarafı kapalı aşan tampon kapalı kurulayın ve hemen ekstraksiyon çözeltisi üzerine, aşağı bakacak lamel, hücre yan yerleştirin.
    4. 10 saniye sonra, forseps ile lamel pick up ve hemen hücre yan sıra içeren% 4 paraformaldehid sabitleme tampon, yukarı bakacak, aktarın.
    5. Oda sıcaklığında, en az 15 dakika için sabitleştirici içinde örnek inkübe izin verin.
  3. Unextracted Kontrol Hücrelerinin hazırlanması. Bir unextracted kontrol numunesinin hazırlanması için iyi bir fikirdir, sitoplazma içinde mRNA toplam miktarını belirlemek için.
    1. Lamelleri üzerinde yetiştirilen hücreler digitonin ayıklama adım (2.2.3) atlanır olması dışında, (bakınız Bölüm 2.2) yukarıdaki gibi hazırlanır.
    2. Tespit edildikten sonra, un-Ayıklanan hücreler PBS permeabilize gerekir +% 0.1 TritonX-100 oda sıcaklığında 15 dak.

3. BALIK Boyama

  1. Floresan in situ hibridizasyon probları için tasarlama
    1. Ilgili bir mRNA sekansı bu gibi birincil RNAstructure 5.0 18 olarak RNA ikincil yapı tahmini yazılımı kullanılarak katlanır. MRNA kıvrımlar görsel önemli ikincil yapıların serbest yaklaşık 50 nükleotid belirlemek için değerlendirilir.
    2. Bu bölgenin ters tamamlayıcı prob 5 'ucu (Integrated DNA Technologies firmasından satın alınmıştır) bağlanmış bir Alexa546 florofor ile sentezlenir.
    3. Prob -20 ° C'de muhafaza edilebilir 100 uM'lik bir stok konsantrasyonu RNase içermeyen su ile seyreltilir
  2. FISH probları ile Boyama
    1. Digitonin-Çıkartılan hücrelerinin daha fazla geçirgenliği gerektirmez, ancak,% 0.1 2 ml ile bu sabit örnekleri tedavi Not Triton X-100 ile seyreltilirPBS FISH boyamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika için, bir arka plan sinyali azaltmaya yardımcı olur.
    2. Slaytlar sonra herhangi bir kalıntı paraformaldehit veya Triton X-100 uzaklaştırmak için PBS ile iki kez yıkanır.
    3. Hücreler daha sonra 1X sodyum sitrat tampon (150 mM NaCl ve 15 mM sodyum sitrat) içinde% 25 ile% 60 formamid ile iki kere yıkanır. Genel olarak, uzunluğu 50-60 nükleotid olan belirli FISH probları için,% 60 formamid kullanılır, ancak oligo (dT) FISH sonda ile poli (A) mRNA boyama için, formamid seviyesini% 25 düşürülür.
    4. Boyanma oda hazırlamak için, 150 mm'lik bir Petri kabı alt su ile kaplıdır ve parafilm bir parça su üzerinde yüzen edilir. Böylece su parafilm tabağın tabanına bağlı sağlayan, çanak fazla döndürerek çıkarılır. Hava kabarcıkları elle Kimwipes ile kaldırılır.
    5. Her bir lamel lekeli edilebilmesi için, eşit üzerine çıkar FISH prob ihtiva eden bir çözelti hibridizasyon 100 ul damla pipetleboyama odasında afilm. Stok FISH probunun bir çalışma konsantrasyonu için hibridizasyon tamponu içinde% 25 ile% 60 formamid (1 x SSC, 100 mg / ml dekstran sülfat, 1 mg / ml maya tRNA, 5 mM vanadil ribozit kompleks,% 25-60 formamid) ile seyreltilir 0.2 uM. Formamid miktarı, kullanılan özel sonda için optimize edilmiş ve SSC yıkama tamponu içinde olduğu gibi aynı konsantrasyonda (adım 3.3.3 bakınız) mevcut olması gerektiğine dikkat edin.
    6. Lamel bu gibi doku kültürü kuluçka makinesi gibi bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta boyama oda içinde FISH çözelti üzerine hücre yan yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir ve 5-24 saat için kuluçkalanır.
  3. Lekeli örnekleri Çamaşır ve montaj
    1. Bir RNaz ücretsiz yıkama alanı hazırlamak için, böyle bir laboratuar tezgah olarak düz bir yüzey üzerine parafilm bir şerit, uzandı. Parafilm yüzeye ıslak, düz olduğundan emin olmak için, üstüne parafilm yerleştirin ve elle Kimwipes ile herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.
    2. Boyama odasıdırinkübatör çıkarıldı ve bir düz yüzey üzerine yerleştirilir. Lamelleri sonra her lamel kenarında FISH yıkama tamponu yaklaşık 500 ul pipetleme tarafından süzülüyor edilir. Çözüm kılcal hareket yoluyla lamel ve parafilm arasındaki çekilecektir.
    3. Her bir lamel için, yıkama tamponu 1 ml (1 x SCC% 25-60 formamid, 3.3.3 adım bakınız) yıkama alan parafilm (adım 3.4.1) üzerine pipetle konulur.
    4. Forseps kullanılarak, lamelleri boyama oda çıkarılır ve her bir yıkama tamponu damla üzerine yerleştirildi ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Yıkama işlemi 3 kez tekrarlanır.
    5. Cam slaytlar% 70 etanol ile yıkandı ve Kimwipes ile kurutulur.
    6. Her lamel için, montaj çözümü (DAPI Fluoromount G, Güney Biotech) 25 ul slayt üzerine pipetle konulur. Bu çözüm 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), lekeleri DNA içerir ve çekirdeklerin görselleştirme sağlar unutmayın.
    7. USIng forseps ile Kimwipes, lamel arka kurutulur ve aşırı FISH yıkama tamponu örnek kurutma olmadan kapalı bulanıklaşmıştır. Her lamel sonra montaj solüsyonu damla üzerine, aşağı bakacak hücre yan yerleştirilir.
    8. Atlı sonra numuneler etiketlenir ve 4 mağaza olabilir ° C

4. Görüntüleme ve Ölçülmesi

  1. Görüntüleme
    1. Bir Epifloresans mikroskop görüntüsü FISH boyama sonrasında hücreler için kullanılır. Transfekte hücre uygun kanal parlak floresan sinyal tarafından untransfected hücreleri ayırt edilebilirler. İdeal olarak, her bir alınan alanın aynı zamanda ölçümü için arka plan floresan belirlemek için kullanılmak üzere bir untransfected hücre içerir.
    2. Için FISH ve DAPI kanalın her alanın görüntüleri elde edilir. Hücreler protein işaretleri ile birlikte-lekeli Ek olarak, eğer, immünofloresans kanalın bir görüntü de elde edilir. Digitonin çıkarma de kullanılabilir dikkat edinizER-bağlı ribozomlar ve protein 11 görselleştirmek için.
    3. Alanlar arasındaki floresans yoğunlukları karşılaştırıldığında olabilir emin olmak için, her bir kanal için maruz kalma süresi deney her set için sabit kalmalıdır.
    4. Yine farklı lamelleri üzerine hücreleri arasındaki floresan yoğunlukları mukayese edilebilir olmasını sağlamak için, FISH sinyal epiluminescence yoğunluğu veya çürüme gün-gün değişiklikleri görüntüleme tek bir oturuşta lamelleri her minimize edilmelidir.
  2. Niceleme. ER yerelleştirilmiş mRNA miktarını ölçmek için, Nikon NIS Eleman yazılımı kullanın. Bununla birlikte bu tür ImageJ gibi diğer görüntü analiz programı kullanılır.
    1. Nikon NIS ELEMANI görüntü analizi aracını kullanarak, hücre çevre ve çekirdek İlgi (ROI) ayrı Bölgesi olarak özetlenmiştir.
    2. Her bir ROI, floresan yoğunluğu (I T total hücre yoğunluğu ve ben için N içinNükleer yoğunluk) ve alan (A T ve A N) kaydedildi ve bir excel elektronik tablo ihraç edilmektedir.
    3. Her bir görüntü için, arka plan floresan yoğunluğunu (I B) olmayan bir transfekte edilmiş bir hücre yoğunluğu kayda tarafından belirlenir. Poli (A) mRNA düzeyleri analiz ediliyor ise, bir hücre serbest bölge seçilir.
    4. ER toplam miktarı (ekstre hücreleri) ve sitoplazmik (unextracted hücreleri) floresan formül ile hesaplanır:
      [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B]
    5. Nükleer boyanma yoğunluğu de hesaplanır ve çeşitli tedaviler arasında iç kontrol olarak da kullanılabilir. Çekirdekler digitonin tedavi 17 veya ribozom bozulması 11 etkilenmez yana, nükleer mRNA miktarı bu tedavilerin her biri arasında sabit kalmalıdır. Aşağıdaki formül kullanılır nükleer floresans hesaplamak için:
      [A N] [I N - IB]
    6. ER-hedefli olan sitoplazmik mRNA yüzde 30-40 unextracted hücreler (tekrar 4.2.4) elde edilen ortalama sitoplazmik floresans bölünmesiyle 30-40 çıkarılan hücrelerin ortalama ER floresans (Madde 4.2.4) alınarak hesaplanabilir . Bu ayıklanır ve unextracted hücreleri, hazırlanan lekeli ve paralel görüntülü önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ER-ilişkili olan mRNA yüzdesi, plasental alkalin fosfataz (ALPP) ya da sitokrom P450-8B1 (CYP8B1) ya da digitonin ile ekstre edilmiş ve daha sonra çözülmüştür, ya da direkt olarak tespit edildi içeren plazmitler ile birlikte transfekte edilmiş COS-7 hücreleri belirlemek için (bkz. Şekil 1, karşılaştırın "Ctrl Çıkarılan" için "Ctrl Unextracted"). Nükleer olmayan floresan örnekleri ve ER-ilişkili mRNA fraksiyonu (Şekil 2) hesaplanmıştır her ikisi de ölçüldü. Tüm veriler açıkça ALPP ve CYP8B1 her ikisi için, sitoplazmik mRNA yaklaşık% 60 ER ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu mRNA'ların hem ER-lümen işlenir proteinleri kodlayan bu yana, bizim sonuçları gibi mRNA'ların ER yüzeyinde tercüme edildiği düşüncesi ile uyumludur.

COS-7 hücreleri transfekte ribozom disosiyasyon sonra bu transkript ER-dernek, izlemek tr vardısonra çıkarılan sabit ve her mRNA (temsili görüntüler için bakınız Şekil 3 ER-ve nükleer ilişkili mRNA ölçümü için, bkz. Şekil 1) karşı spesifik FISH probları kullanılarak boyandı 30 dakika kontrol ortamı, puromisin veya HHT ile eated. Ribozomlar puromisin veya HHT (Şekil 2-3) ile demonte edildikten sonra sadece ALPP değil, CYP8B1 mRNA, ER korunur unutmayın. Önemlisi nükleer mRNA düzeyi ya mRNA için değişik tedavi örnekleri (Şekil 3) arasında değişmemiştir. Bu sabit nükleer BALIK sinyal ER fraksiyonunda floresans yoğunluğu değişiklikleri mRNA veya FISH boyama farklı stilde değişikliklere bağlı olmadığını gösterir.

Bu sonuçlar bu tür ALPP transkript olarak ER-hedefli mRNA, bir alt kümesi sökme ribozom sonra bu organel yüzeyi üzerinde muhafaza olduğu sonucuna varılmıştır.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Şekil 1
Şekil 1. ALPP değil, CYP8B1 mRNA bağımsız ribozomlar ve çeviri ER ile ilişkili kalır. COS-7 hücreleri ya ALPP (üst sıra) veya CYP8B1 (alt satır) genleri içeren plazmit ile transfekte ve için mRNA ifade için izin verildi 18-24 saat. Hücreler daha sonra DMSO kontrol ortamı ("Ctrl"), puromisin ("Puro") ya da 30 dakika için HHT ile muamele edildi. Hücreler ya direkt olarak sabitlenir ("unextracted"), ya da birinci sabit sonra ekstre edildi. Kontrol ve HHT ile tedavi edilen hücreler tek başına digitonin ile ekstre edildi iken, Puro ile tedavi edilen hücreler digitonin ile EDTA ile ekstre edilmiştir dikkat ediniz. Hücreler belirli FISH probları kullanılarak mRNA için lekeli ve görüntülendi. Ölçek bar = 20 mikron.

lways "> Şekil 2,
Şekil 2. ALPP ve CYP8B1 mRNA için ER-Esas seviyesinin belirlenmesi. Transfekte COS-7 hücreleri ya doğrudan sitoplazma içinde mRNA toplam seviyesi (bakınız Şekil 1, hücreler "Ctrl Unextracted") belirlemek için sabit veya birinci ekstre edilmiş ve sonra tespit edildi ER-ilişkili mRNA (bkz. Şekil 1, hücreler "Ctrl ayıklanır") miktarını belirlemek için. Her deney için 30-40 ekstre hücrelerin ortalama ER-ilişkili floresan ER-bağlı mRNA (y-ekseni) bir fraksiyonu elde 30-40 unextracted hücrelerin ortalama sitoplazmik floresan ile ayrılmıştır. Her bir çubuk ortalama değer ve üç bağımsız deneyin standart hatayı temsil eder.

Şekil 3
Şekil 3,. ER-asso kantifikasyonuALPP ve ribozom ayrışma sonrasında CYP8B1 mRNA ciation. transfekte COS-7 hücreleri özel FISH probları ve görüntülü (Şekil 1, "Çıkarılan" hücreler bakın) kullanarak mRNA için lekeli kontrolü orta veya çeşitli çeviri inhibitörleri, ayıklanır, sabit, ile tedavi edildi. ER ve çekirdeğinde mRNA floresan yoğunlukları ölçüldü. Her çubuk, üç bağımsız deneyin, arka plan ve kontrol ile tedavi edilen hücrelerin ER (y-ekseni) içinde floresan ile normalize fazla 30 hücre ortalama entegre yoğunluk oluşan her birinin ortalama ve standart hatayı temsil eder. Ribozom kesintileri ER ayırmak CYP8B1 mRNA neden olsa da, nükleer mRNA düzeyleri etkilenmez olduğunu unutmayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çeşitli Subselüler sitelere mRNA'ların lokalizasyonu, mRNA localisation proteinler ile transkript etkileşimi aracılığıyla, bir hücre içi ve yerel gereksinimler nihai hedefe proteinlerin doğru sıralama için ve gen ekspresyonu ince ayar için önemli bir yaygın bir olgudur bölge 19,20.

Tahlil kullanılarak burada açıklandığı gibi, bu salgı proteinleri kodlayan mRNA ribozom ya da çeviri varlığında veya yokluğunda, ER muhafaza edilebilir olup olmadığı sorusu revisited. Aslında biz, bu mRNA'ların bir alt kümesini bu etkinlik 11 olduğunu ortaya koymuştur. Örneğin, bu çıkarma protokolü kullanılarak, ALPP ve CYP8B1 mRNA, her iki kontrol olarak ER yüzeyinin muamele COS-7 hücreleri (Şekil 1-2) üzerinde lokalize olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, çeviri inhibitörleri puromisin veya HHT, sadece ALPP, ancak CYP8B1 mRNA ile tedavi sonra hücreler,fonksiyonel enzimler ve çeviri (Şekiller 1, 3) yokluğunda ER ile ilişkili kaldı. Buna ek olarak, daha önce ALPP mRNA pactamycin 11 ile tedavi edilen COS-7 hücreleri içinde ER-bağlı kaldığı bulundu. Bu çeşitli tedaviler ilişkili ribozomların mRNA temizlemek için farklı mekanizmalar yoluyla hareket olduğundan, ALPP ve ER-dernek herhangi bir ilaç için bazı dolaylı hücresel yanıtın sonucu olması olası değildir. Bu çeviri inhibitörleri etkili olduğunu doğrulamak için, onlar 35 yeni sentezlenen proteinlerin içine G-metionin ile birleşmesiyle inhibe olmadığını test etmek için de yararlı olur. Örneğin, mdmp-muamele (100 uM, 15 dk) sadece COS-7 hücreleri içinde tüm protein sentezi (XA Cui ve AF Palazzo, yayınlanmamış gözlem)% 40-60 engellediğini bulduk. Sonuç olarak, bu ilaç etkin bir şekilde hedefleme ve bakım için çeviri gerektiren mRNA'ların ER-yerelleştirme bozmayan (XA Cui ve AF Palazzo, yayınlanmamış gözlemler).

Bir sitoplazmik proteini kodlayan bu nedenle daha fazla olduğunu mRNA ER-hedefleme kodlanmış sinyal dizisi veya transmembran etki bağımlı değildir sağlamak için, bir eksojen transkript değiştirebilir. Nitekim, daha önce sinyal sekansı ve bölgelerde kodlama transmembran hem yoksun ALPP mRNA bir sürümü hala ER 11 yerelleştirilmesine mümkün olduğunu göstermiştir.

Aynı zamanda, mRNA nükleer ihracat 21 analiz etmek için kullanılan diğer testler ile bir araya geldiğinde, burada sunulan yöntem yüzeyine çekirdek diğerine (örneğin, bir bölme mRNA taşıma kinetiğini ve gereksinimlerine tanımlamak için kullanılabilir olması dikkat çekicidir ER). Nitekim, çeviri inhibitörleri ile tedavi edilen COS-7 hücre çekirdeğinin içine ALPP geni içeren plazmid microinjecting, biz daha önce bu yeni yapılan ALPP gösterdimRNA'ların bağımsız çeviri veya ribozom-dernek 11 ER hedeflenir.

Biz tamamen bu mRNA hedefli ve ER demirlemiş nasıl anlamıyorum rağmen, bu organel mRNA reseptörleri içeren olasıdır. Gerçekten de kısa bir süre önce, bağımsız olarak tercüme 11 ER üzerinde muhafaza edilmesi ALPP mRNA yeteneği için gerekli olan kadar büyük bir pozitif yüklü zar-bağlı protein, P180 tespit edilmiştir. Bununla birlikte, diğer reseptör mRNA ER 11 yüzeyi üzerinde mevcut olması gerekir olasıdır. Tekniği yardımı burada özetlenen ile, memeli hücrelerinde mRNA yerelleştirme düzenlenmesine yardımcı moleküler mekanizmaları birçok belirlemek ve incelemek için umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma XAC ve AFP Ulusal Bilim ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi bağışları ile desteklenmiştir

References

  1. Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
  2. Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
  3. Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
  4. Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
  5. Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
  6. Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
  7. Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
  8. Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
  9. Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
  10. Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
  11. Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
  12. Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
  13. Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
  14. Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).
  15. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
  16. Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
  17. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
  18. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  19. Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  20. Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
  21. Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 70 Biyokimya Genetik Moleküler Biyoloji Genomik mRNA lokalizasyonu RNA digitonin ekstraksiyon hücre parçalanması endoplazmik retikulum salgı mikroskopi görüntüleme floresan BALIK hücre biyolojisi
Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cui, X. A., Palazzo, A. F.… More

Cui, X. A., Palazzo, A. F. Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (70), e50066, doi:10.3791/50066 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter