L'imagerie moléculaire à la cible transplanté des cellules progénitrices musculaires

Résumé

A moyen non invasif pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes est décrite. La méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes dont l'expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie. Ici, nous utilisons un Fluc gène rapporteur pour cibler les cellules par imagerie par bioluminescence.

Résumé

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie grave maladie neuromusculaire héréditaire qui touche 1 personne sur 3.500 garçons, et est caractérisée par une dégénérescence progressive des muscles ^{1, 2.} Chez les patients, la capacité des résidents cellules satellites du muscle (SC) pour régénérer fibres musculaires endommagées devient de plus en plus inefficace ^4. Par conséquent, la transplantation de cellules souches musculaires (PPM) / myoblastes chez des sujets sains est une approche thérapeutique prometteuse pour la DMD. Une limitation majeure à l'utilisation de la thérapie de cellules souches, cependant, est le manque de technologies d'imagerie fiables pour suivi à long terme des cellules implantées, et pour en évaluer l'efficacité. Ici, nous décrivons un non-invasive et en temps réel approche pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes. Cette méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes (la luciférase de luciole [fluctuations], la protéine fluorescente rouge monomère [RDRF] et SR39 thymidine kinase [sr39tk]) dont expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie ^{9, 10.} Une variété de modalités d'imagerie, y compris par émission de positons (TEP), émission à photon unique tomographie (SPECT), imagerie par résonance magnétique (IRM), l'imagerie optique et haute fréquence 3D échographie sont maintenant disponibles, chacune avec des avantages et des limites ^11. Bioluminescence d'imagerie (BLI) des études, par exemple, ont l'avantage d'être relativement peu coûteuse et à haut débit. C'est pour cette raison que, dans cette étude, nous nous servons de la luciférase de luciole (fluctuations) séquence du gène rapporteur contenue dans le gène de fusion et l'imagerie par bioluminescence (BLI) pour la localisation à court terme des myoblastes C2C12 viables suite à une implantation dans une souris modèle de la DMD (dystrophie musculaire sur le chromosome X [mdx] souris) ^12-14. Surtout, BLI nous fournit un moyen d'examiner la cinétique de PPM étiquetés post-implantation, et sera utile pour suivre les cellules de façon répétée sur time et après la migration. Notre approche gène rapporteur permet en outre de nous de fusionner plusieurs modalités d'imagerie dans un unique sujet vivant; étant donné la nature tomographique, fine résolution spatiale et sa capacité à évoluer jusqu'à plus grands animaux et les humains ^10,11, PET constituera la base des travaux futurs que nous suggèrent peut faciliter la traduction rapide des méthodes mises au point dans les cellules à des modèles précliniques et aux applications cliniques.

Protocole

1. Entretien et Propagation de myoblastes C2C12

1. Plaque de myoblastes C2C12 dans un flacon de ⁷⁵ cm2 et maintenir les cellules dans le sérum glucose à haute Dulbecco modifié Eagle (HG-DMEM) supplémenté avec du sérum de veau fœtal (SVF) à une concentration finale de 10%. Ne laissez pas les cellules à devenir confluentes, à tout moment, car cela appauvrissent la population myoblastique. Milieu doit être changé tous les autre billet journée:. Moyennes toujours chaude à 37 ° C dans un bain d'eau avant de l'utiliser.
2. Lorsque les myoblastes à environ 80% de confluence, les cellules de passage à un nou....

Résultats

À 50-60% de confluence, myoblastes C2C12 ont été transitoirement transfectées avec le gène de fusion susmentionné construction reporter composé de la luciférase de luciole [fluctuations], la protéine fluorescente rouge monomère [RDRF] et SR39 thymidine kinase [sr39tk] (figure 1A). L'efficacité de transfection a été calculé par microscopie à fluorescence (figures 1B, C), ce qui rend l'utilisation de la séquence RDRF dans notre construction de r.......

Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit une rapide et fiable imagerie moléculaire, l'approche gène rapporteur de myoblastes cibles non invasive / PPM après la transplantation. Bien que cette étude démontre la localisation à court terme des pays partenaires méditerranéens transplantés via bioluminescense imagerie (BLI), la manière dont les cellules sont ciblées peuvent, en effet, être facilement appliquée à une évaluation longitudinale de la prise de greffe des cellules, grâce à l'implantation de ce.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Myoblastes C2C12	ATCC
Eagle modifié par Dulbecco à moyen	Life Technologies	12800-017
sérum de veau fœtal	Life Technologies	12483020
0,25% de trypsine-EDTA	Life Technologies	25200-72
Solution saline équilibrée de Hanks	Sigma Aldrich	H6648
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019
Nikon Eclipse TE2000-5	Nikon Instruments Europe BV
Xenolight D-luciférine	PerkinElmer	122796	40 mg / ml dans du PBS