Summary
척추 안정화, 변동성을 최소화하기위한 일관된 실험 척수 손상을 제조하는 것이 필요하다. NYU / MASCIS 임팩터 장치와 함께 사용자 정의 안정 장치를 사용하여, 우리는 성인 쥐에서 재현 헤미 contusive 자궁 경부 (C5) 척수 손상을 발생 여기에 적절한 장비 및 절차를 설명했다.
Abstract
임상 관련 동물 자궁 경부 척수 손상 (SCI) 모델은 잠재적 인 치료법을 개발 및 테스트에 필수적이다; 그러나, 신뢰할 수있는 자궁 SCI 제조 인해 척추의 안정화 방법의 부족 만족하기 어렵다. 척추를 안정화하는 종래의 방법은 자궁 경부 가시 돌기에 부착 된 클램프를 통해 주동이와 꼬리 경추을 중단하는 것입니다. 그러나, 이러한 방법의 안정화는 경부 척추 프로세스가 효과적으로 클램프 (도 1)로써하기에는 너무 짧다로서 수득 동안 진탕 조직을 예방하지 못한다. 여기서 우리는 완전히 충격 손상의 동일한 레벨 경추를 안정화시키는 새로운 방법을 소개한다. 이 방법은 매우 효율적으로 일관 SCIS의 생산을 향상 충격 부위에서 척추의 이동을 최소화한다. 우리는 장비 (그림 2-4)의 시각적 인 설명을 제공, 방법S 및 경부 척추골 5 성인 쥐 (C5)의 안정화를위한 단계별 프로토콜은 추궁 (도 5)를 수행 한 후 contusive SCI를 생성한다. 우리 만 NYU / MASCIS 임팩터 장치를 이용하여 자궁 경부 헤미 타박상을 설명했지만,이 척추 안정화 기술은 척수의 다른 영역에 적용 할 수 있고, 또는 다른 장치들에 SCI 적응 될. 척추 안정화를 통해 척수 노출과 고정을 개선하는 것은 척수에 일관성과 신뢰성을 부상을 생산하는 가치가있을 수 있습니다. 이것은 척추 안정화 방법은 또한 다양한 신경 생물학 연구에서 이광자 현미경을 사용하여 영상화 세포 트레이서 정위 주사에 사용될 수있다.
Introduction
대상 척수 조직에 일관성과 복제 기계적인 힘은 기능 및 조직 학적 변화를 최소화하고 성공적인 contusive 척수 손상 (SCI) 모델 1-7을 설정하는 것이 중요합니다. 척수의 목표 영역에인가되는 힘의 양이 척추 안정화 이용 방법에 따라 달라진다. 충격 플런저 및 척수의 접촉시 목표 척추의 변속 위치는 생성 된 부상 력을 변경한다. 자궁 contusive SCI 모델은 인간의 SCI 케이스의 대략 50 %는이 레벨 8에서 발생하고, 몇 개의 SCI 연구는 동물 자궁 상해 모델 9-14를 사용하여 수행되었다, SCI 다른 형태보다 더 임상 적 모델이다. contusive SCI 모델은 종종 상처 사이트 프로세스 척추 전방 및 후방 클램핑함으로써 안정화의 일부 형태를 이용할 수 있지만,이 혼합물은 자궁 SCI를 제조하는 것은 곤란하다. &# 160;이 데모에 도시 된 바와 같이, 우리가 개발 안정화 방법은 품질 및 타박상 손상의 재현성을 모두 증가 할 수 있다는 점에서 유리하다. 후궁 절제술에 인접한 지느러미 가시 돌기가 주동이의 꼬리 클램핑에 의해 발생할 수있는 충격력에 따라 산출 척추 1) 다양성 : 특히, 척추 안정화의이 방법은 단점과 다른 모델의 문제를 수정하기위한 시도로 설립되었다. 척추의 변속도는 충격 및 척추 안정화되고 (도 1) 사이의 척추 관절의 수에 의존한다. 따라서, 더 많은 관절 척추 덜 안정하게 관여; 2) 지느러미 가시 돌기는 극돌기 골절 또는 프로세스 빠지는 클램프의 결과로서 약하고 클램프 실패 원인이고; 3) 이러한 척추에 가시 돌기는 C3가 흉추 베르가 비교 (T1)에 척추골 사이에 매우 짧다전통적인 클램프를 사용하여 어렵게 브레는 경추 안정화 가시 돌기를 파악.
여기에서 우리는 성인 여성 흰쥐에서 C5 contusive SCI를 생산 척추를 안정화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 방법은 뉴욕 대학 / 다기관 동물의 척수 손상 연구 (NYU / MASCIS)을 포함하여, 다른 contusive SCI 장치와 다른 척추 및 척수의 수준 및 접합체의 안정화에 사용할 수있는 충격기 (15) (그림 2) 정밀 시스템 및 계측, LLC 무한 호라이즌 (IH) 장치 (16), 오하이오 주립 대학 / 전자 척수 손상 장치 (1) 및 SCI 연구에 광범위하게 사용할 수있게 루이빌 부상 시스템 장치 (LISA) 17.
Protocol
자궁 경부 척추 박판 1. 노출
- 70 % 에탄올로 수술 표면을 청소, 가열 패드로 미리 예열. 수술 영역에서 멸균 거즈, 면봉, 및 멸균 된 수술 도구를 배치하기 전에 무균 수술 드레이프와 표면을 커버. 수술 도구의 간 수술 살균을위한 마이크로 비드 살균기를 사용합니다.
- 케타민 (87.7 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (xylazine) (12.3 ㎎ / ㎏)을 복강 내 (IP)와 쥐를 마취. 마취의 적절한 평면은 동물 발가락 핀치 자극에 반응을 중단 할 때 도달된다. 피하 0.01 ~ 0.05 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 5 ㎎ / ㎏ 카프로 펜 이전 수술에 주입. 프레 놀핀은 수술 후 첫 4-7일를 들어, 하루에 한 번씩 매일 8-12 시간과 카프로 펜을 투여해야한다.
- 수술 중에 각막의 건조를 방지하기 위해 동물의 눈을 보호 연고를 적용한다.
- 등쪽에 수술 영역을 면도가위와 머리 뒤쪽에 중반 흉부 지역에서 쥐의 표면. HEPA 필터가 장착 된 진공 청소기를 사용하여 면도 털 제거.
- 수술 스크럽 후 70 % 이소 프로필 알코올 물티슈 지역을 청소로 면도 영역에 베타 딘 솔루션을 적용합니다.
- 중반 흉부에 꼬리 쪽 머리의 기지에서 피부에 3 ~ 4 센티미터 중간 선 절개를 수행하기 위해 메스 블레이드를 사용합니다.
- 아래 목에서 동면 그랜드와 근막과 피하 근육 앞쪽의 중간 선을 식별; 승모근의 실수로 중간 선을 따라 다른 근육 출혈을 줄일 수 있습니다.
- 근육 기초 지방 조직의 두 지역의 중간 선을 찾기; 극돌기 도달 흉추 T2의 레벨까지 작은 조직 권취 장치를 사용하여 엄격히 정중선을 따라 미부 paraspinous 근육을 절단, 분리 근육층.
- 확인하고 생을 활용 T2 극돌기에 연결된 근육을 절단해부학 적 랜드 마크 등의 구조.
- 경추의 가시성을 개선하기 위해 T2 극돌기의 연골 팁을 제거합니다.
- 가시 돌기 및 C4-T1의 라미에서 측면으로 척추 주위의 근육을 분리; 그러나, 출혈을 방지하기 C3 얇은 판에 피복 예비 근육.
- 횡 척주의 양쪽 측면을 향해 C4-T1에서 라미 위에 근육을 잘라.
- 척추 라미이 노출 된 후, 안정제 U 자형 통로에서의 복부 표면에 동물을 놓는다.
- T1, C7, C6, 그리고 마지막으로 C5에 T2 랜드 마크에서 rostrally 가시 돌기를 계산하여 C5 척추를 확인합니다.
2. 척추를 안정화하고 충격 부상을 수행
- 라 테라 아래 팔의 톱니 모양의 가장자리를 배치하여 동물을 중단 안정제 개의 스테인리스 팔을 위치C5-6 척추 (그림 1C)의 L 패싯. 장소 (그림 2B)에서 척추와 팔을 확보 한 후, 척추가 레벨을 중심으로 확인하기 위해 안정 장치를 조정합니다. 마지막으로, 안정제의 나사를 조여 팔을 잠급니다.
- C5의 얇은 판의 마진을 식별 할 수 C4-5과 C5-6에서 척추 프로세스와 라미 사이의 인대를 잘라.
- SCI (도 5C-E)를 대상으로 마이크로 rongeur를 사용하여, C5에서 오른쪽 박판의 절반을 얻어 클립. 후궁 절제술 후, 부상 장치 아래에 안정제와 동물을 운반 할 것. 정확하게 횡 마이크로 매니퓰레이터 (도 3)를 사용하여 대상 척추의 플런저를 정렬 마운트 (도 3A-C)의 안정 화제와 함께 동물을 고정.
- 고배율, 뒤없이 노출 등쪽 척수 표면 C5 및 C6 후근 엔트리 영역 (DREZs)를 찾으rotomy. 두 식별 DREZs의 중간에서 반쯤 정중선 및 척수 (도 5b)의 측면 에지 사이의 플런저를 목표로한다.
- 2.5 mm 직경의 끝 (도 3A 및 B)와 NYU / MASCIS 임팩터 장치를 이용하여, 10g로드 X 12.5 mm 높이 강하 (도 2a)에 의해 C5 헤미 - 타박상 (도 5B & E)을 생산한다.
- 시각적으로 척수 (그림. 5E, 화살표)에 멍에 의해 부상을 확인하고 NYU 소프트웨어 12,17 (그림 6)에 의해 제공되는 부상 매개 변수를 확인합니다.
- 봉합 근육과 멸균 4-0 vicryl 봉합사와 연부 조직은 다음 수술 스테이플 (EZ 클립)로 피부 절개를 닫습니다.
- 수술 부위에 항균 연고를 적용합니다.
- 수화에 대한 동물에 멸균 0.9 % 식염수를 피하 5.0 ml의 관리를 선택합니다.
- 더위에 동물을 배치- 제어 매일 변경 침구 (제공 촉촉한 음식) (가열 패드에 뜨거운 물 padcage 재순환) 환경), 케이지의 바닥에 배치 쉽게 액세스 할 수 있도록 긴 주둥이와 물 한 병. 홈 케이지에 동물을 반환하기 전에 충분한 회복을 위해 치료를 제공합니다.
- 이것은 일방적 인 자궁 contusive 부상이기 때문에, 동물 가능성이 부상 후 처음 몇 주 동안 회복하기 시작 일시적으로 동측 앞다리의 기능을 잃을 것이다. 그러나 반대측 기능 따라서 동물이 먹고 손상없이 마실 수 있어야한다, 그대로 유지하고, 운동과 정리에 경미한 손상이 있어야합니다.
Representative Results
이 프로토콜을 다음과 같은시, 일관되고 재현 자궁 헤미 contusive SCI (그림 5 & 6) 생산된다. SCI위한 레벨의 같은 척추의 측면 프로세스를 안정화시키는 안정 화제 척추의 사용은 만족스러운 결과를 허용한다. 이 방법을 사용하여, 대상 C5 척추뿐만 아니라, 인접하는 C4 및 C6뿐만 견고하게 고정된다.
NYU / MASCIS 소프트웨어는 X 축 및 Y 축에 설정 그래프 판독을 제공하고 척추 안정화 방법의 사용을 지원하며, 장치 (도 6). 안정화의 방법은 표적 조직 및 척주 (도 1)의 하향 변속 발생할 수 부상 변동성을 감소시킨다. 부상 후, C5 및 C6 DREZs 사이를 중심으로 명확한 일방적 인 푸른 빛이 도는 혈종이 표시 (그림 5E)입니다. 이러한 부상 매개 변수는 동물에서 애니에 일치NYU / MASCIS 소프트웨어가 제공하는 판독에 따라 말 (그림 6).
자궁 헤미 타박상이 명확 앞다리 적자를 생산,이 모델은, 도달 (13)을 정리 등의 앞다리의 기능 능력을 평가하기위한 이상적입니다 및 조작 18 ~ 19 개체. 사지 모터 적자가 덜 눈에 띄는 바소에 따라, 비티와 Bresnahan (BBB) 전위의 득점 규모 4는이 모델에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 손상 후 기능적인 결과는 쥐가 "때리는"전시되는 동측 앞발 신근 적자에서 가장 눈에 띄는 모든 자리의 주먹 (18) 근육이 수축. 같은 부상 정도와 척수의 수준에 노출 된 모든 동물은 정확한 부상에 따라이 프로토콜에 도시 동측 앞다리, 비슷한 적자를 전시한다. 동물은 잘못 적자 13,18의 매우 다른 증상과 기간에 제시 할 수있다 부상.
조직 학적으로,이 모델은 척수의 부상 측면에서 거의 독점적으로 포함 상당한 병변과 공동 형성을 선도, 부상의 사이트로 부상 진원지와 주동이의 꼬리에 광범위한 회색과 흰색 물질의 손상을 생산하고 있습니다. 대규모 신경 죽음 (18)와 병변의 경계에서 큰 주로 성상 세포 기반의 폐해 흉터 형성한다.
그림 1 : 다른 클램핑 방법에 contusive SCI 동안 척추 유연성의 그림입니다. 그림 A와 B 쇼 유연성 또는 가시 돌기가 부적절한 영향과 일치하지 않는 데이터를 허용, 등쪽으로 고정 된 척추의 "수율". 에 표시된 그림에 미치는 영향 (빨간 점선에 따라 훨씬 더 많은 유연성을 표시클램프 멀리 후궁 절제술 및 부상의 사이트에서만큼 큰 곡선 화살표) B에 도시에 비해 (작은 곡선 화살표). 그림 C는 안전하게의 횡단 과정에서 강화 안정화 팔 우리의 기술 장치와 측면 안정화를 보여줍니다 충격 부위가 수행 될 척추. 관심있는 척추가 완전히 안정화로이 절차를 수행하는 동안 척추의 더 유연성이 없습니다.
그림 2 : NYU / MASCIS 임팩터 및 사용자 정의 안정화 컨테이너입니다. 그림 A는 부상 정도에 대해 여러 개의 막대 높이를 설정 (삽입)와, 부품 및 NYU / MASCIS 척수 손상 장치의 기능이 표시됩니다. 그림 B와 C가 들어있는 U-모양의 컨테이너를 설명래트, 안전하게 수술 부상 중에 척추의 안정화 안정화 톱니 아암 (YP 장 설계 및 제조).
그림 3 : 사용자 정의 NYU / MASCIS 충격기의 시스템 및 측면 microadjuster 장착 그림은 척수 손상의 U 자형 쥐 안정제의 사용자 정의 설치 시스템의 다른 구성 요소에 대해 자세히 설명합니다.. B도. 부상 래트 척수의 정확한 정렬을위한 결정적인도에서 횡 microadjuster을 참고 C가 (B)없이 안정 화제의 또 묘사를 제공하고 다른 중요한에 대해 U 자형 래트 컨테이너 (C)와 부상 장치의 구성 요소 (장착 시스템 설계 및 YP Z에 의해 생산걸림).
도 4 :. 수술 안정화 장치 및 첨부의 개별 구성 요소의 측정은 사용자 안정화 시스템의 각 구성 요소의 치수 및 스케일 (A, C, 및 D)을 표시하도록 강조된다. 흉부 안정화 아암 (B)는 다른 척추 수술에 사용하기위한 모델이 소자의 응용 가능성을 표시하도록 도시된다.
그림 5 : 외과 랜드 마크와 자궁 경부 헤미 타박상 척수 손상에 대한 준비. 그림 A와 B는 적절한 IMPA에 대한 올바른 랜드 마크를 묘사노출 된 쥐의 척수에 CT 정렬. 적절한 탄착점은 C5 및 C6 척수 신경 뿌리 (주동이 - 꼬리)과 중심선 및 척수 (B)의 측 방향 에지 사이에서 직접적이다.도 CE 쇼, 고배율에서의 원하는 절반을 노출시키는 공정 주의 일방적 인 후궁 절제술을 통해 부상 자궁 경부 척수,. 또한, D 수치와 E 직전와 척수의 타박상 부상 후 코드를 보여줍니다. 눈에 보이는 출혈에 미치는 영향 (검은 색 화살표)에 의해 발생 (E)를 참고.
그림 6 :. NYU / MASCIS 충격기와 영향 다음 받아 들일 수없는 데이터 판독 대 수용의 예. 상단 그래프 (A)와 상위 데이터 세트 (C) (B) 및 오류 부적절한 안정화에 의한 부적절한 영향에 의해 생성 된 데이터를 보여 (C). 빨간색 화살표로 표시하고 밑줄로, 초기 높이 표시 상당한 오류를 기록하고 충격기 드롭의 시간을 시작합니다. 이 소프트웨어는 또한 오류가 이러한 매개 변수 (패널 C의 바닥) 검출 된 경고를 제공합니다.
Discussion
여기에서 우리는 C5에서 일방적 contusive SCI를 제조하는 경추 안정화 방법을 설명했다. 이 안정화 방법은 해부학 적 외상의 정밀도를 높이고 일관된 기능 적자 13,18을 생산하고 있습니다. 가시 돌기 클램프의 등쪽에 의존하는 다른 모델, 극돌기 손상 또는 척추로부터 클램프의 박리의 위험성이 매우 높다. 이 모델은 상당한 척추 이동과 타박상 힘과 척추와 척추 열 (그림 1A 및 B)의 유연한 자연에서 산출 할 수있다. 알터에게 플런저 조직 접촉 시간과 예상치 못한 부상 힘의 결과 (그림 1A-B & 6B)를 산출 조직. 1)이 방법이 완전히 아래 C5를 중심으로 척추를 안정화 : 우리의 기술 척추 안정화는 또한 수술 준비에 다른 혜택을 제공laminectomies (도 1C)의 정확도를 증가 수술 현미경; 2) 동물 SCI 장치에 동물을 다시 마운트 절차를 회피하고 시간을 절약 맞춤 장착 부속물 수술 위치에서 직접 취해질 수 U 자형 내에 장착 안정제; 다른 측정 값은 변동을 감소시키고 3)의 부상 레벨을 안정화시키고 척추 크게 직접 호흡에 의한 신체의 움직임을 감소시킬 수있는 손상의 의도 된 위치에 꼬리 지느러미와.
이 안정화 방법을 이용하는 주요 장점은 감소 된 양의 산출, 또는 충격시 척수 및 열의 복부 운동이다. 타박상 손상 간단한 물리학에 기초하여, 충격력 에너지는 충돌 부위에이 에너지를 흡수하는 코드가 이상적 척수로드에서 전송된다. 그러나 코드 아래 척추 수익률로는 가능한 경우등쪽 가시 클램핑 방법 (도 1A 및 B)에서, 실제 수율 힘의 정도에 따라 감소되는 코드 및 변수에 적용 하였다.
이 비디오가 자궁 contusive SCI 모델의 전체 과정을 설명하지만,이 문서의 본질은 특히 SCI 연구를 위해, 우리는 우리의 실험실에서 다양한 용도로 사용하는 척추 안정화 방법을 소개합니다. 이 안정화 장치 및 방법의 수정 된 버전 (23) 상에 마우스 SCI 사용되고있다. 척추 안정화의이 간단한 방법은 SCI 연구에 매우 유용하며, 우리는 이전에 흉부 타박상뿐만 아니라 열상 SCI 모델을 수행하려면이 방법과 장비를 사용했다. 또 다른 연구소는 최근이 저널에 22 자궁의 부상에 대해 안정화 이런 형태의 변화를 설명했다. 요약하면, 우리는 여러 surgic이 신규 척추 안정화 방법을 소개후궁 절제술로 인한 부상 생산에 이르기까지 재현 실험 SCI를 생성하는 등의 절차. 이 안정화 방법은 치스 테르 나디 라티 나 마그나, 반 절단 및 절개 부상에서 인트라 척수 주입, 세포 이식, CSF 컬렉션 등의 다양한 실험을 위해 적응 된 바와 같이 본 안정 장치의 장점은, 경추 척수 좌상에 한정되지 않는다 생체 내 이미징 흉부 타박상 부상, 이광자 현미경 및 척수 전기 생리 기록을 채용. 실험 변동성을 척추 수술과 부상 절차의 품질 증가 및 감소 부상 및 복구의 진정한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이, 그리고 SCI의 파괴적인 장애에 대한 다른 치료의 효과를 화면 것입니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 [X-MX에 NS36350, NS52290 및 NS50243] 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 마리 Hulman 조지 기부 기금; 인디애나 주; 및 1F31NS071863 CLW에 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 (NRSA)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Webster Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | |
| Antiobiotic Ointment | Webster Veterinary | 07-877-0876 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Surigical Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Scissors (blunt dissection) | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11024-18 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher Scientific | 10015-00 | |
| EZ Clips | Fisher Scientific | 59027 | |
| Sterile sutures | Fine Science Tools | 12051-10 | |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Surgical Stabilizer | Custom Manufactured | N/A | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
| Vertebral Stabilization Bars (clawed endfeet) | Custom Manufactured | N/A | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
| NYU/MASCIS Impactor Device | Custom Manufactured | W. M. Keck Center for Collaborative Neuroscience Rutgers, The State University of New Jersey e-mail: impactor@biology.rutgers.edu |
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