La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Résumé

Aqueuses systèmes biphasiques ont été utilisés pour les populations de motif simultanément de multiples cellules. Cette méthode est simple et rapide pour un patron de cellules tire parti de la séparation de phases de solutions aqueuses de glycol de polyéthylène et de dextrane et la tension interfaciale qui existe entre les deux solutions de polymères.

Résumé

Technologies patron de cellules qui sont rapides, faciles à utiliser et abordables seront nécessaires pour le développement futur des hauts dosages de cellules débit, plates-formes pour l'étude des interactions cellule-cellule et des systèmes de l'ingénierie tissulaire. Ce protocole détaillé décrit une méthode pour générer des co-cultures de cellules en utilisant des solutions biocompatibles de dextrane (DEX) et de polyéthylène glycol (PEG) que phase séparée lorsqu'ils sont combinés au-dessus des seuils de concentration. Cellules peut être configurée en une variété de configurations en utilisant ce procédé. Un motif d'exclusion de cellules peut être réalisée par des gouttelettes d'impression DEX sur un substrat et à les recouvrir avec une solution de PEG contenant des cellules. La tension interfaciale entre la solution formée polymère provoque deux cellules de tomber à l'extérieur de la gouttelette DEX et former un dégagement circulaire qui peut être utilisé pour les essais de migration. Îlots de cellules peut être modelée par la distribution d'une phase riche en cellules DEX dans une solution de PEG ou en recouvrant le DEXde gouttelettes avec une solution de PEG. Co-cultures peuvent être formées directement par la combinaison d'exclusion de cellules avec DEX île de motifs. Ces méthodes sont compatibles avec une variété d'approches de manipulation des liquides, y compris micropipetage manuel, et peut être utilisé avec n'importe quel type de cellules adhérentes.

Introduction

Aqueuses systèmes à deux phases (ATPSs) se forment lorsque des solutions de deux polymères incompatibles sont mélangés à des concentrations suffisamment élevées. Séparation de phase est influencée par divers facteurs, dont la masse moléculaire et la polarité des polymères, la température de la solution, le pH et la composition ionique de la solution aqueuse de solvant ^{1, 2.} Le point où les deux solutions de polymère séparés est déterminée par les propriétés physico-chimiques du système de phase choisi, mais se produit généralement à des concentrations faibles de polymère (moins de 20% en poids / poids) sous des conditions non dénaturantes, permettant ATPSs à être utilisé pour la biotechnologie applications ^3-9.

De loin, l'ATPS plus étudiés est le polyéthylène glycol (PEG) / dextran (DEX) du système. Les ATPS formés par ces polymères biocompatibles et peu coûteux a été décrit pour la purification de biomolécules au moyen de partitionnement moléculaire ^{2, 10.} Partitionnementse produit lorsque les molécules ou particules supplémentaires qui ne contribuent pas au système de phase sont mélangés avec du PEG et DEX. Sur la base de leurs affinités relatives pour chaque DEX ou PEG, les molécules ou particules seront de préférence résider dans une des deux phases ou à l'interface. Une autre propriété de l'ATPS PEG / DEX est l'existence de la tension interfaciale entre les phases polymères deux. ATPSs formés par PEG et DEX affichent généralement des tensions interfaciales qui sont beaucoup plus bas que les autres liquide-liquide à deux phases des systèmes tels que le pétrole et l'eau, mais les forces de tension interfaciale encore exercer des effets sur de petites particules telles que les virus, les cellules et les agrégats de protéines ^{2 , 11-13.} Enfin, depuis le plus haut poids moléculaire du PEG et DEX séparé à de faibles concentrations (moins de 5% en poids / poids de polymères de haut poids moléculaire variétés) en présence de concentrations physiologiques de sels, il ya peu ou pas d'effets délétères sur les cellules de mammifères incorporé au sein de ces systèmes^14-16.

Récemment, les propriétés interfaciales et des effets de partitionnement de ATPSs ont été appliquées par notre laboratoire pour ¹⁴ patron de ^{cellules, 16-20.} Cela a été accompli par micromodelage une solution plus dense DEX sur des substrats de culture cellulaire en présence de PEG. Lorsque les cellules sont incorporées dans la phase PEG, ils sont exclus de pénétrer dans les gouttelettes de DEX en raison de PEG / DEX tension interfaciale ^20. Lorsque les cellules sont en motif dans la phase DEX, ils sont conservés à la surface du substrat de culture cellulaire par tension interfaciale et de cloisonnement ^{16, 17, 19.}

Contrairement à d'autres méthodes pour la modélisation cellulaire, patron de cellules ATPS est facile à apprendre et ne nécessite que des connaissances rudimentaires sur les polymères eux-mêmes, et la possibilité d'effectuer une culture cellulaire et d'utiliser une micropipette. D'autres méthodes pour la modélisation cellulaire impliquent souvent un équipement spécialisé et de formation qui ne sont pas facilement convertis en ee sciences de la vie. Par exemple, certaines méthodes (microcontact impression ou impression jet d'encre), les cellules motif indirectement par l'application de modèles de biomolécules d'adhésion cellulaire à un substrat de culture que par la suite servir de sites de fixation ^{21 cellules, 22.} Bien que les approches indirectes sont utiles pour certains types de cellules, elles exigent un haut degré de compétences de l'utilisateur et de l'équipement spécialisé pour la fabrication de l'outil de structuration, et peuvent manquer de spécificité en fonction du type de cellule / biomolécules modèle particulier. Alternativement, les cellules peuvent être déposés auprès de la spécificité modèle haut au moyen d'approches de structuration directs qui comprennent flux laminaire motifs, pochoirs et ^23-26 impression jet d'encre. Cependant, ces techniques nécessitent en outre l'expertise des utilisateurs et des équipements spécialisés, et peuvent endommager les cellules au cours du processus d'impression. Bien que ces approches produisent généralement des modèles précis de cellules, de patron de cellules pour être un outil utile dans les sciences du vivant, il doit être rentable unee simple à mettre en œuvre.

Nous rapportons ici un protocole détaillé pour la production des cultures de cellules en utilisant les motifs ATPSs décrits dans nos applications précédemment publiées. Utilisation Micropipettes seulement, les utilisateurs peuvent générer des zones d'exclusion de cellules ou des îles de cellules pour des essais de migration. Ce résultat est obtenu au moyen de PEG / DEX tension interfaciale qui conserve soit des cellules dans la phase DEX ou exclut les cellules déposées dans la phase PEG de DEX. En combinant ces deux techniques de dessin fondamentales, il est possible de générer rapidement des co-cultures de cellules comme les fibroblastes de cellules de foie co-cultures. Méthodes de structuration, les paramètres de l'ATPS et les résultats attendus sont décrits en détail.

Protocole

1. Caractérisation Phase System: seuils déterminant pour la séparation de phase

1. Préparer des solutions contenant du PEG et DEX dans le tampon désiré ou milieu de culture cellulaire comme le montre la figure 1 (points violets) dans 15 ml ou 50 ml tubes coniques. Ci-après, le PEG et DEX se référeront à 35 kDa PEG et 500 kDa DEX; cependant, les concentrations critiques vont changer en fonction des deux polymères utilisés. Noter la masse de PEG et de DEX dans chaque solution. Forte concentration des solutions de polymères peut prendre plusieurs heures à se dissoudre. Vortex peuvent être utilisées pour des solutions sans sérum. Pour les médias contenant des protéines ou du sérum, placer les tubes sur une scène à bascule jusqu'à ce que les deux polymères sont complètement dissous. Noter le poids des médias utilisés pour dissoudre les polymères et prendre note des concentrations initiales.
2. Une fois que les polymères sont complètement dissous, les solutions doivent apparaître nuageux. C'est la première indication que la séparation de phase a eu lieu. Pour confirmer cela, permettre à l'des solutions de polymère au repos dans une position verticale à la température ambiante pendant 20 min. Centrifugation à 1000 xg peut être utilisé pour accélérer le processus de séparation de phase. La phase inférieure dense sera DEX-riche et la phase supérieure sera PEG-riche.
3. Ajouter lentement tampon supplémentaire ou un support pour les tubes. Petits incréments doivent être utilisés de manière à ne pas dépasser le point de séparation des phases.
4. Lorsque la solution devient limpide et non plus en phase sépare après centrifugation, le seuil de séparation de phase a été atteint. Enregistrer le poids final du tube.
5. En utilisant les pondérations précédentes enregistrées dans les polymères, en même temps que le poids final après ajout de médias, déterminer le% en poids / poids de chacun des deux polymères au cours de laquelle la séparation de phase ne se produit plus.
6. Tracer ces valeurs en% en poids / poids de PEG sur l'axe des y et% en poids / poids DEX sur l'axe des abscisses. Cette courbe, appelée courbe binodale, peut être utilisé pour déterminer la concentration de seuil de séparation de phase pour différentes concentrations dModules de PEG / DEX dans un milieu de culture cellulaire spécifique.

2. Configuration 1: Modélisation Exclusion (96 puits Format de plaque)

1. Préparer des solutions séparées de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire. Utiliser des solutions de l'ATPS au moins deux fois le point critique pour s'assurer que l'ATPS reste après que les polymères s'équilibrer par rapport à l'autre. Il ya une petite quantité de flux de DEX dans la phase riche en PEG et vice-versa, par conséquent, travailler trop près de la concentration critique peut entraîner la perte du système de phase en baisse des concentrations inférieures à point critique. De même, le transfert de la boîte de culture cellulaire à un incubateur à humidité et à température contrôlée peut modifier les propriétés de deux phases et de faire les deux solutions miscibles. Note: Certaines cellules peuvent être plus efficaces avec les formulations de l'ATPS autres. Formulations acceptables peuvent être choisis en fonction des courbes binodale déterminées à partir de la partie 1.
2. Récolter les cellules à utiliser pour l'exclusion patterning. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles. En option: marquer les cellules avec CellTracker ou d'autres non-cytotoxiques étiquettes pour la microscopie de fluorescence.
3. Sédimenter les cellules et resuspendre le culot dans un volume approprié de 5,0% PEG pour atteindre le nombre désiré de cellules d'exclusion. Par exemple, un puits d'une plaque de 96 puits nécessite 37.500 cellules de fibroblastes d'être remis en suspension dans 200 ul de PEG pour produire confluence le jour suivant. L'échelle de ces chiffres en fonction de d'autres types cellulaires et tailles substrat de culture.
4. Utiliser une micropipette, distribuer 0,5 pi de gouttelettes DEX sur un substrat de culture cellulaire sec. Gouttelettes plus grand volume de production plus grandes zones d'exclusion. Gouttelettes dont la taille varie de 0,1 à 1 ul sont recommandés pour micromodelage exclusion. En option: DEX gouttelettes peuvent être déposées 24 heures à l'avance et laisse se déshydrater à la température ambiante. Cela peut produire des modèles plus propres.
5. Distribuer 200 l de suspension cellulaire PEG dans til en bonne santé pour couvrir les gouttelettes DEX.
6. Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO _2. Assurez-vous que le plat n'est pas incliné lors de la manipulation et qu'il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes.
7. Retirer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 ul de milieu de culture.
8. Ajouter milieu de culture frais et revenir à l'incubateur.
9. Surveiller les cultures périodiquement pour observer le mouvement des cellules dans la zone d'exclusion.

3. Configuration 2: Modélisation Island (Format de plaque de 96 puits)

1. Préparer des solutions de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire, comme ci-dessus.
2. Récolter les cellules à utiliser pour des motifs île. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles.
3. Granulés et remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de 12,8% DEX pour obtenir la concentration désirée de cellules pour la modélisation île. Les concentrations de 5000 CElls / ul ou moins sont recommandées pour les types de cellules fortement adhérentes. Pour les cellules qui ont de la difficulté de fixer ou de cellules qui adhèrent faiblement, les concentrations de jusqu'à 10.000 cellules / ul peut être envisagée.
4. En travaillant rapidement pour éviter le dessèchement, Pipeter 0,5 pi de gouttelettes DEX sur un substrat de culture cellulaire sec, tel que décrit ci-dessus. Ne pas laisser sécher les gouttelettes. En option: 200 pi de solution de PEG peut être ajouté à la bien à l'avance. DEX gouttelettes peuvent alors être déposés dans la solution de PEG où ils se déposent au fond et contact avec la surface de culture. Cela peut produire des modèles plus propres îles.
5. Couvrir les gouttelettes DEX avec 200 ul de PEG.
6. Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO _2. Assurez-vous que le plat n'est pas incliné lors de la manipulation et qu'il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes.
7. Retirer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 ul de milieu de culture.
8. Ajouter culture fraîchemoyen et retour à l'incubateur.
9. Surveiller les cultures périodiquement pour observer le mouvement vers l'extérieur des cellules et la prolifération des îles.

4. Configuration 3: Exclusion des co-cultures (format plaque de 96 puits)

1. Préparer des solutions de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire, comme ci-dessus.
2. Récolter les cellules à utiliser pour l'exclusion et de motifs île. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles pour chaque type de cellule. En option: Certaines paires de cellules peuvent afficher des indices de prolifération radicalement différents. Pour éviter que les cellules exclus de la surpopulation des cellules insulaires configuration (en particulier pour les cultures à long terme), le traitement des cellules utilisées pour l'exclusion de la mitomycine C pendant 2 heures ou les irradier avant la récolte. Cela permettra d'éviter la prolifération. Colorants fluorescents CellTracker peut être utilisé pour distinguer les deux populations de cellules si nécessaire.
3. Sédimenter les cellules et remettre en suspension le culot de exclusion de motifs dans un volume approprié de PEG 5,0% pour atteindre le nombre désiré de cellules, comme ci-dessus. Reprendre le culot pour la modélisation île dans un volume approprié de 12,8% DEX pour obtenir la concentration désirée de cellules, comme ci-dessus.
4. Utiliser une micropipette, distribuer 0,5 gouttelettes ul de suspension cellulaire DEX sur un substrat de culture cellulaire sec. Ne pas laisser sécher les gouttelettes.
5. Couvrir les gouttelettes DEX avec 200 pi de suspension cellulaire PEG.
6. Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO _2. Assurez-vous que le plat n'est pas incliné lors de la manipulation et qu'il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes.
7. Retirer la solution de PEG et laver trois fois dans 200 pi de milieu de culture.
8. Ajouter milieu de culture frais et revenir à l'incubateur.
9. Surveiller les co-cultures d'observer l'interaction entre les populations de cellules. En option: Les contrôles peuvent être préparés en effectuant l'exclusion ou de la modélisation île individually, par co-culture des cellules qui n'interagissent pas ou en bloquant les voies d'intérêt dans une ou les deux populations de cellules avant ou après formation de motif.

Résultats

Pour sélectionner une combinaison appropriée de PEG et de DEX pour la modélisation cellulaire, il est important de déterminer la courbe binodale. Cette courbe délimite les points au niveau desquels peuvent se former une ATPS et peut varier d'un ensemble donné de polymères sur la base de la température, le pH et la teneur ionique. Pour la culture de cellules qui nécessitent formulations de milieu personnalisés, il peut être nécessaire de déterminer expérimentalement la courbe binodale. Ceci est accompli en générant une s...

Discussion

La méthode de l'ATPS micromodelage cellule nécessite une expertise très peu au-delà de la maîtrise des techniques de culture cellulaire et peut être rapidement maîtrisé. Les avantages de cette approche est qu'elle est peu coûteuse, rapide et compatible avec une variété de types de cellules et les formats de la culture. Pour ces raisons, notre protocole devrait être facilement adoptée par les sciences de la vie, en particulier ceux qui étudient la prolifération cellulaire, la migration et la chimiotaxie, et l'...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif	Fabricant
Dextran 500.000 kDa	Pharmacosmos, Danemark
Polyéthylène Glycol 35.000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Tracker cellule	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA