Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

Résumé

Une méthode est présentée pour la reconstitution du modèle nucléosomiques tableaux de histones recombinantes et d'ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Nous décrivons également comment les expériences de la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, et la microscopie à force atomique (AFM) sont utilisés pour mesurer l'ampleur de nucléosomique saturation de tableau après reconstitution.

Résumé

Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d'une molécule d'ADN sont appelés tableaux nucléosomiques. Tableaux nucléosomes sont obtenus dans une des deux façons suivantes: purification à partir de sources in vivo ou in vitro de reconstitution histones fondamentales recombinants et de l'ADN répétées en tandem de positionnement des nucléosomes. Cette dernière méthode a l'avantage de permettre à l'ensemble d'un uniforme plus de composition et tableau nucléosomique positionné précisément. expériences de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique des informations d'élasticité d'environ la taille et la forme des macromolécules en analysant la vitesse à laquelle ils migrent à travers la solution sous la force centrifuge. Cette technique, en même temps que la microscopie à force atomique, peut être utilisé pour le contrôle de qualité, en veillant à ce que la majorité des matrices d'ADN sont saturés avec des nucléosomes après reconstitution. Nous décrivons ici les protocoles nécessaires pour reconstituer quelques milligrammes de longueur et de composition dtableaux nucléosomiques efined appropriés pour les études biochimiques et biophysiques de la structure et la fonction de la chromatine.

Introduction

Génomes eucaryotes n'existent pas d'ADN nu, mais sont compactés et organisées par des protéines liées. Ces complexes d'ADN et de protéines sont connues comme la chromatine. L'unité de répétition de base de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué d'histone octamère et 146 paires de bases d'ADN enroulé autour de l'octamère d'histone environ 1,6 fois ^1. L'octamère d'histones est composé de deux exemplaires de chacun des histones H2A le fondamentales, H2B, H3, et H4. Octamères histones fondamentales qui sont répétitive espacés le long d'une molécule d'ADN sont appelés tableaux nucléosomiques.....

Protocole

Une. Assemblée des recombinants de base histones dans octamères

Justification: La première étape de nucléosomique tableau reconstitution est de préparer indigènes base histones octamères de lyophilisés histones recombinantes. protéines histones sont combinés en des quantités molaires égales et assemblés en octamers des histones par dialyse les échantillons à partir d'un tampon de dénaturation dans du tampon de repliement.

1. Purifier et lyophiliser histones recombinantes (H2A, H2B, H3, H4) comme décrit ^13.
2. Dissoudre environ 5 mg de chaque noyau histone lyophilisée dans 3 ml de tampon dépliage (6 M de guani....

Résultats

Pour illustrer le protocole nous avons reconstitué à partir de matrices histones nucléosomiques recombinants de base de Xenopus et de l'ADN comprenant des 12 séquences répétées en tandem de 207 bp de la séquence de positionnement 601 (601 ²⁰⁷ x 12). Nous avons d'abord assemblé octamers natives de histones fondamentales lyophilisées et ensuite purifié par des octamères FPLC en utilisant une colonne S200 (Figure 1A). Grands complexes élues tôt de la colonne S200. Les histones s.......

Discussion

Modèle tableaux de nucléosomiques sont un outil très utile pour l'étude in vitro de la structure et la fonction de la chromatine. Par exemple, ils ont été largement utilisés pour étudier le mécanisme de la condensation de la chromatine de la fibre dans une solution ^{de 30 à 34,} et a permis d'obtenir une structure aux rayons X d'un Tetranucleosome ^35. Plus récemment, ils se sont avérés utiles à déchiffrer les effets structurels de variantes noyau d'histone spécifique, des mut.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(3-Aminopropyl)triéthoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Tube de dialyse	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Colonne	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrateur centrifuge	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Tube de dialyse	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Ultracentrifugeuse analytique	Beckman-Coulter