نحن تصف رواية<em> في الجسم الحي</em> تقنية التصوير أن الأزواج الفئران خيالية الفلورسنت مع ويندوز داخل الجمجمة وعالية الدقة المجهر 2 الفوتون. هذا التصوير منصة دراسات الإيدز من التغيرات الدينامية في أنسجة المخ والأوعية الدموية الدقيقة، على مستوى وحيدة الخلية، بعد الشتائم المرضية وغير قابلة للتكيف لتقييم تسليم المخدرات داخل الجمجمة والتوزيع.
لقد نجح في مزاوجة المحددة سابقا داخل الجمجمة نافذة (ICW) تكنولوجيا 1-4 مع حيوي داخلي المجهري متحد البؤر 2 الفوتون لتطوير منصة رواية التي تسمح لتصور مباشرة طويلة الأجل للتغيرات بنية الأنسجة intracranially. التصوير في قرار خلية واحدة في الأزياء في الوقت الحقيقي يوفر المعلومات الحيوية التكميلية وراء تلك التي يوفرها التحليل النسيجي نقطة النهاية القياسية، والتي تبدو فقط في "فرقعة شوت 'المقاطع العرضية من الأنسجة.
إنشاء هذه التقنية التصوير حيوي داخلي في الفئران خيالية الفلورسنت، ونحن قادرون على صورة أربع قنوات في وقت واحد الفلورسنت. من خلال دمج خلايا fluorescently المسمى، مثل GFP + نخاع العظام، فمن الممكن لتتبع مصير هذه الخلايا دراسة على المدى الطويل الهجرة والاندماج والتمايز داخل الأنسجة. مزيد من خلية مراسل الثانوية، مثل mCherry دبقي خط الورم، والتكامل يسمح لcharacterization من الخلية: التفاعلات الخلية. ويمكن إبراز التغيرات الهيكلية في المكروية الأنسجة من خلال إضافة الأصباغ داخل الحيوية والأجسام المضادة، على سبيل المثال CD31 الأجسام المضادة الموسومة والجزيئات ديكستران.
وعلاوة على ذلك، نحن تصف مزيج من نموذجنا التصوير ICW مع الحيوانات الصغيرة الدقيقة irradiator التي توفر أشعة المجسم، وخلق منصة التي من خلالها يمكن تقييم التغيرات النسيجية الحيوية التي تحدث بعد إعطاء إشعاع المؤين.
القيود الحالية من نموذجنا تشمل انتفاذ من المجهر، الذي يقتصر على عمق يصل إلى 900 ميكرون من سطح القشرية الفرعية، مما يحد من التصوير إلى المحور الظهري من الدماغ. وجود عظم الجمجمة يجعل ICW إجراء تقني أكثر تحديا، بالمقارنة مع النماذج الدائرة أكثر رسوخا والاستفادة المستخدمة حاليا لدراسة الأنسجة الثديية ومنصات الدهون 5-7. بالإضافة إلى ذلك، ICW الأقليمايديس تحديات عديدة عندما الاستفادة المثلى من التصوير.
فهم أفضل للتغيرات الهيكلية والبيولوجية التي تنشأ في الدماغ استجابة لمختلف الأمراض، والتدخلات العلاجية هو أمر حاسم لتحسين استراتيجيات العلاج. ومع ذلك، واحدة من التحديات الراهنة في دراسة هذه التغييرات الهيكلية والبيولوجية، ولا سيما فيما يتعلق الأمراض داخل الجمجمة، هو عدم إمكانية الوصول إلى الأنسجة وعدم القدرة على دراسة التطور الزمني وتطور ديناميكية التغيرات في الجسم الحي في الإعداد. جيل من "نافذة" التكنولوجيا قد ثبت سابقا ناجحة في دراسة تغيرات الأنسجة اللينة من خلال التنمية الورم 5-7. تطوير نماذج ICW يبرهن على أن تكون أكثر تحديا من الناحية الفنية، ونظرا لضرورة لإزالة عظم الجمجمة دون الإضرار على التحريض عدوى في الأنسجة الدماغية الكامنة. وقد حاول الأوراق السابقة لرقيقة الجمجمة لتصور 8-10 الأنسجة ومع ذلك، لانتاج عالية ايم قرار واضحمطلوب الأعمار إزالة كاملة من عظم الجمجمة 11. كرر طويلة الأجل التصوير (30 يوما +) أصبح في الآونة الأخيرة فقط خيارا مجديا من خلال التصوير 1،11، وقد تم دراسة أطر زمنية أقصر سابقا 5.
على مدى العقد الماضي كان هدفا رئيسيا لتوضيح أصل الجدد الأوعية الدموية المحفزات المرضية التالية، ولا سيما في استجابة لتشكيل الورم والتقدم، لتوفير أهداف علاجية جديدة لعلاج الأورام. لا يزال الكثير من الجدل حول مصدر الأوعية الدموية الجديدة في الدماغ أثناء التطور ورم أو الإشعاع التالية. تقليديا وقد اعتبر الأوعية الدموية يحدث من خلال الأوعية الدموية، وهي العملية التي تشكل سفن جديدة من تنبت من السفن الموجودة من قبل 12. دراسات أكثر حداثة ومع ذلك، تشير إلى أن عملية الجنينية يفترض في السابق من تكون الأوعية قد يكون لعب دورا أكثر كبيرا في تشكيل الأوعية الدموية المرضية. VAsculogenesis ينطوي على تجنيد من نظرائهم أرومة وعائية الكبار من نخاع العظم والتي بدورها ثم تشارك مباشرة في تشكيل جديد البطانة سفينة 12-14. تراكم الأدلة يشير إلى أن يتم تعبئة الخلايا البطانية السلائف من نخاع العظام للشروع في دي نوفو تشكيل سفينة ردا على الوسطاء أنكجنيك 15-17. ومع ذلك، توفر هذه الدراسات أدلة متناقضة للمساهمة المباشرة لهذه نخاع العظم الخلايا المشتقة (BMDCs) إلى البطانة السفينة مع نسبة مساهمة متفاوتة مع نوع من التحفيز المرضية والاستجابة للعلاج 18-21.
لذلك، وإنشاء الطرق التجريبية استنساخه التي تسمح عالية الدقة التصوير حيوي داخلي لتكرار دراسة طويلة الأجل لعملية التكامل BMDC في الأوعية الدموية للورم، واستجابة للعلاج لا يقدر بثمن. تفشل التقنيات القياسية النسيجي لتوفير تقنية المعلومات الديناميكيةاملعلومات اللازمة لتحديد البقاء على المدى الطويل، التفاضل والتكامل من الخلايا التي تؤدي إلى neovasculature وبالتالي لا يمكن أن تثبت بشكل قاطع آليات التفاعل الخلية.
لقد أظهرنا باستخدام نهجنا التجريبية أن هناك درجة متفاوتة من تجنيد BMDC بعد كل من الإشعاعات المؤينة داخل الجمجمة ونمو الورم، والتوظيف التي هي ومع ذلك، موقع علم الأمراض محددة وليس غزوا من الأنسجة داخل القحف كامل 11،22. لقد أظهرنا أن تجنيد يتبع نمطا وقت حساس يتضح من التصوير المتكرر لحيوان واحد 11،22. وبالمثل، في الجسم الحي التصوير يمكن أن توفر أيضا التعمق في محاكاة الخلايا السرطانية حيث الخلايا السرطانية الموسومة fluorescently ولا يمكن تصوير وتعقب مع البينية الحيوية CD31 الأجسام المضادة لخلايا بطانة الأوعية الدموية لتسليط الضوء على إمكانية transdifferentiation الخلايا السرطانية مباشرة لتشكيل البطانة الخاصة به.
<pالطبقة = "jove_content"> ومما يعزز براعة هذا النموذج من قبل القدرة على صورة 4 قنوات الفلورسنت، وتوفير عدد من مجموعات شاملة لدراسة متفاوتة عملية الخلوية والبيولوجية. ونحن قادرون على intravitally صورة CFP (الأزرق)، GFP (الخضراء)، الكرز / طلب تقديم العروض (الحمراء)، وAlexa647/APC (بعيدة الحمراء)، في وقت واحد في حقل واحد مرارا وتكرارا على مر الزمن. يمكن للباحثين تعديل وراثيا خلايا للتعبير عن fluorochromes لكل من القنوات وكذلك الأصباغ الشراء والأجسام المضادة لتسليط الضوء على التغييرات الهيكلية ذات أهمية خاصة. حتى الآن الأصباغ والأجسام المضادة التي يشيع استخدامها في دراسات تشمل CD31 وديكستران التي على حد سواء تسليط الضوء على الأوعية الدموية الدقيقة وتغيرات في الأنسجة 1،11،23،24، على الرغم من أننا تستخدم القناة بعيدة الأحمر لهذا الغرض على حد سواء متاحة للاستخدام في الآخر القنوات المذكورة. وبالمثل، تم الأصباغ الأخرى بما في ذلك Sytox أورانج، التي ستسلط الضوء على مجالات موت الخلايا المبرمج، وعلامات مثل تلك من Visen شركة، جمعية مهندسي البترولتصميم cifically للاستخدام في الجسم الحي. وبالإضافة إلى قنوات الفلورسنت التي يشيع استخدامها الأربعة المذكورة، وهو الجيل الثاني التوافقي (SHG) قناة يمكن إضافة والأمثل لصورة ألياف الكولاجين الذاتية للنموذج 7، تصور الغشاء القاعدي المحيطة الأوعية الدموية.للتدليل على التكيف من نموذجنا، فضلا عن التفاعلات خلية خلية المذكورة أعلاه، فإننا تمكنا من دراسة التفاعلات خلية المخدرات. لقد نظرت إلى مثبطات المخدرات مثل AMD3100، مثبط SDF-1، ودوره في إشارة شبكات متورطة في تجنيد BMDC 11. وبالمثل قمنا المهندسة وراثيا من الخلايا U87 xenografts دبقي للتعبير عن VEGFTrap، مثبط VEGF 25، جنبا إلى جنب من خلال IRES إلى جزيء GFP. باستخدام RFP + BM نحن قادرون على دراسة دور VEGF له على تجنيد BMDCs إلى الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة قمنا الاستفادة من نموذج لدراسة حركية الدواء تبحث في MEChanism وراء الورم ترسيم المخدرات فلوريسئين 26، على المستوى الخلوي. من خلال استخدام مخصص بنيت في منزل irradiator حيوان صغير كنا قادرين على الاندماج المجسم الإشعاع تسليمها لتقييم مدى استجابة الورم على حد سواء وBMDCs للعلاج.
من خلال استخدام لدينا رواية حيوي داخلي طريقة الباحثون التصوير والتبصر في التغييرات في الوقت الحقيقي وحيدة الخلية التي تحدث في مختلف الأمراض والنظم، والمساعدة في توضيح العديد من ميزات وظيفية والبيولوجية من التغيرات النسيجية.
القنوات الثلاث المذكورة في جميع الصور هي حتى الآن قابلة للتبديل لمدة ثلاث علامات من الفائدة في نماذج أخرى، وأوراق الباحثين مع مجموعة لا تقدر بثمن من الأدوات لتبدو عديدة وأنواع الخلايا والتفاعلات. مطلوب التخطيط لضمان أن جميع علامات وأنواع الخلايا قد نجح في مزاوجة جزيء مضان مراسل في قناة متميزة.
بالإضافة إلى القنوات الثلاث القياسية المستخدمة هنا كنا أيضا قادرة دمج قناة CFP الرابع (الشكل 4A) والكولاجين مقرها SHG قناة 7 (الشكل 4B). ويمتد هذا إمكانية النظر في التفاعلات الخلوية في الجسم الحي، وبالإضافة إلى ذلك يسمح لل مستخدم للقيام سكان خلط لدراسة التفاعلات خلية خلية محددة مع الاحتفاظ قناتين للعلامات أخرى. على سبيل المثال، ولقد بحثنا في خلايا الورم (RFP) والخلايا الجذعية السرطانية (CFP) في نسبة 1:3 لديه مصلحة في مقارنة intratum بهمالتفاعلات عن طريق الفم (الشكل 4A). لاحظنا أن 7 أيام آخر غرس السكان المختلطة وأيدت هذه النسبة، ويمكن أن ينظر إليه على حد سواء لا يزال السكان الخلية.
يوفر قناة CFP المسائل التقنية ويرجع ذلك إلى التداخل مع قناة GFP في كل من الإثارة وانبعاث الأطياف وعلى هذا النحو يتطلب معالجة التصوير آخر لتحديد CFP صحيح + الخلايا من تلك التي هي في الواقع GFP +. يمكن أن يتم تجهيز التصوير آخر خارج على المجاهر 2 الفوتون بنيت في زايس LSM البرمجيات مباشرة بموجبها يتم طرح صورة من الصورة GFP CFP الناتجة في الخلايا CFP الحقيقية للتخلف عن الركب (الشكل 4A). فرضية لنسبة الطرح يعتمد على صور مشرقة على قدم المساواة وهذا يرجع إلى CFP الليزر (458 نانومتر) الاستشعاع كلا CFP والخلايا GFP بينما GFP الليزر (488 نانومتر) مرتفع جدا ليتألق الخلايا CFP. بالإضافة إلى الحراجية المعتمدة كنا أيضا قادرا على استخدام الاجهزة التي تم نشرها مسبقا أن ننظر إلى SHGالمستويات، وحتى تصوير ألياف الكولاجين التي تشكل الغشاء القاعدي المحيطة الأوعية الدموية، (الشكل 4B).
وقد اتخذت التكيف آخر من هذا النموذج الاستفادة من العرف بنيت irradiator الحيوانات الصغيرة التي لديها القدرة على استخدام الإشعاع المجسم الموجهة لأشرق أقسام الأنسجة صغيرة مثل 2 ملم في القطر. من خلال استهداف نافذة مع التشعيع فمن الممكن أن ننظر إلى الإشعاع قد أثر على النسيج الأساسي. لقد نشرت مؤخرا دراسة تبحث في تأثير الإشعاع لديها على أنسجة المخ العادي فيما يتعلق تجنيد BMDCs إلى الأوعية الدموية، وتبحث على وجه التحديد دورها في التغيرات النسيجية الإشعاع آخر. وجدنا أن توظيف BMDCs كان كل من الوقت والجرعة التي تعتمد في الأنسجة الطبيعية 11.
فمن الممكن لدراسة آليات التسليم والتكامل من التداوي توفير المخدرات غير الموسومة مع علامة فلوري. خلالبحثنا تمكنا لتتبع إنتاج VEGFTrap، عقار مضاد للعائية الذي يمنع جميع الإشارات VEGF في المنطقة المحلية الإنتاج 25. عن طريق تعديل وراثيا الخلايا السرطانية لدينا للتعبير عن الجينات VEGFtrap مقرونا IRES إلى EGFP (الشكل 4Ci) واستخدام BM RFP 'المانحة' كنا قادرين على صورة EGFP: إنتاج VEGFtrap، والتفاعل BMDC والأوعية الدموية في وقت واحد (الشكل 4Cii). وهذا يبرهن على براعة النموذج والقنوات المتاحة. بل هو أيضا ممكنا أن ننظر إلى حركية الدواء بسبب وعد من قرار وحيد الخلية. يستخدم فلوريسئين (GFP +) لتحديد الأورام أثناء عملية جراحية لاستئصال ضمان تحقيق أقصى 26. عن طريق حقن الوريد في حين التصوير من الممكن أن تثبت أن ترسيم لا يحدث من خلال امتصاص نشطة من فلوريسئين في الخلايا السرطانية نفسها، ولكن بدلا من ذلك من خلال مجموعة من المخدرات في منطقة اللحمية مع خميسIME، التي اطلعت عليها عدم المشاركة في توطين 10 دقيقة بعد الحقن من فلوريسئين (الشكل 4D).
وعموما يجمع استراتيجيتنا تقنيات الرواية والموجودة لتحقيق منصة تجريبية فريدة من نوعها، وهو أمر مفيد في دراسة التفاعلات الخلوية الحيوية. وقد أثبتت هذه الاستراتيجية لتكون نهجا لا تقدر بثمن لدراسة عالية الدقة التطور الدينامي وحيدة الخلية من BMDC، ورم الأوعية الدموية في الدماغ وطبيعية في الاستجابة للعلاج، intracranially. حيوي داخلي التصوير يمكن أن توفر فهما أفضل من المنظمين الجزيئي للتجنيد BMDC والهجرة والتمايز في داخل الجمجمة الدماغ الأوعية الدموية للورم وكذلك العديد من العمليات الحيوية الأخرى قابلة للتكيف مع مجالات البحوث الأخرى. العوامل المفترضة تثبيط التي تنظم BMDC في تركيبة مع الاستراتيجيات العلاجية الأخرى يمكن أن تساعد في التعرف على التوقيت الدقيق من العلاجات اندماجي. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها لهذه الاستراتيجية العديد من العلاقات العامة في المستقبلojects الاستفادة ليس فقط في الجسم الحي الأصباغ تلوين حيوي داخلي، ولكن أيضا مثبطات الجزيئية الصغيرة والجسيمات النانوية التي يتم الموسومة fluorescently مما يسمح للباحثين لتتبع التوزيع وأنماط الهجرة من العلاجات أكثر استهدافا وكذلك تبدو بشكل طولي في حركية بهم.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر مرفق المجهر الضوئي المتقدمة في مستشفى الأميرة مارجريت، ولا سيما جيمس Jonkman لما قدموه من مساعدة في الإعداد الأولي من القنوات على المجهر 2Photon. فإن الكتاب أود أن أنوه استهداف المكانية والزمانية والتضخيم من الإشعاع الاستجابة (STTARR) برنامج ووكالات التمويل التابعة لها. نشكر الدكتور بيتر تونغ، Dr.Iacovos مايكل وDr.Andras ناجى لتوريد البلازميدات VEGFTrap وللتصحيحات مخطوطة وردود الفعل. لقد كان الدعم المستمر والمناقشة من الموظفين في BTRC لا تقدر بثمن، ونود لإحياء ذكرى Dr.Abhijit جوها لله المدخلات العلمية. وقد تم تمويل العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة والمنح CIHR.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |