Artículo de método

Una novela de alta resolución

14.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/50363

⸱

16 de junio de 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Brain Tumor Research Centre, Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower, 2Ontario Cancer Institute, Princess Margaret Hospital, 3Neurosurgery, Toronto Western Hospital

En este artículo

Resumen

Se describe un nuevo In vivo Técnica de imagen que las parejas de ratones quiméricos fluorescentes con ventanas intracraneales y de alta resolución de la microscopía de 2 fotones. Esta imagen de la plataforma estudios auxiliares de cambios dinámicos en el tejido cerebral y la microvasculatura, a nivel de una sola célula, después de insultos patológicos y es adaptable para evaluar la administración de fármacos intracraneal y distribución.

Resumen

Hemos integrado con éxito previamente establecida ventana intracraneal (ICW), la tecnología de 1-4 con intravital microscopía confocal de 2 fotones para desarrollar una nueva plataforma que permite la visualización directa de largo plazo de los cambios en la estructura del tejido intracranealmente. Imágenes con una resolución única célula de una forma en tiempo real proporciona información complementaria dinámica más allá de la proporcionada por el análisis histológico de punto final estándar, que se ve únicamente en secciones transversales "instantánea" de los tejidos.

El establecimiento de esta técnica de imagen intravital en ratones quiméricos fluorescentes, que son capaces de imagen cuatro canales fluorescentes simultáneamente. Mediante la incorporación de las células marcadas con fluorescencia, tales como GFP + de médula ósea, es posible realizar el seguimiento del destino de estas células que estudian su migración a largo plazo, integración y diferenciación dentro del tejido. Además la integración de una célula reportero secundario, tal como una línea tumoral mCherry glioma, permite característicasrización de la célula: las interacciones celulares. Los cambios estructurales en el microambiente del tejido se pueden destacar a través de la adición de colorantes vitales intra-y anticuerpos, por ejemplo CD31 anticuerpos etiquetados y las moléculas de dextrano.

Por otra parte, se describe la combinación de nuestro modelo de formación de imágenes ICW con un animal de pequeñas micro-irradiador que proporciona irradiación estereotáctica, la creación de una plataforma a través de la cual los cambios dinámicos de tejido que se producen después de la administración de la irradiación ionizante pueden ser evaluados.

Las limitaciones actuales de nuestro modelo incluyen penetrancia del microscopio, que está limitada a una profundidad de hasta 900 micras de la superficie cortical sub, limitando de imágenes para el eje dorsal del cerebro. La presencia del hueso del cráneo hace que el ICW un procedimiento técnico más difícil, en comparación con los modelos de cámara más establecidos y utilizados actualmente se utilizan para estudiar el tejido mamario y almohadillas de grasa 5-7. Además, el ICW provides muchos desafíos durante la optimización de la imagen.

Introducción

Una mejor comprensión de los cambios estructurales y biológicos que surgen en el cerebro en respuesta a diversas patologías, y las intervenciones terapéuticas es crítico para la mejora de las estrategias de tratamiento. Sin embargo, uno de los retos actuales en el estudio de estos cambios estructurales y biológicos, en particular en relación con las patologías intracraneales, es la inaccesibilidad de los tejidos y la imposibilidad de estudiar la evolución temporal y la evolución dinámica de los cambios en un entorno en vivo. La generación de la tecnología de "ventana" ha demostrado previamente con éxito en el examen de cambios en los tejidos blandos a través del desarrollo del tumor 5-7. Desarrollo de modelos de ICW demuestra ser técnicamente más difícil, debido a la necesidad de retirar el hueso del cráneo sin dañar en instigar infección en el tejido cerebral subyacente. Trabajos previos han intentado adelgazar el cráneo para visualizar los tejidos 8-10 Sin embargo, para producir alta clara im resoluciónse requiere la eliminación completa de las edades del hueso del cráneo 11. Repetir a largo plazo de imágenes (30 + días) sólo recientemente ha convertido en una opción viable a través de imágenes 1,11, plazos más cortos previamente se han estudiado 5.

Durante la última década, un objetivo importante ha sido para dilucidar el origen de la neo-vascularización siguientes estímulos patológicos, en particular, en respuesta a la formación del tumor y la progresión, para proporcionar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de tumores. Mucha controversia se mantiene en torno a la fuente de nuevos vasos sanguíneos en el cerebro durante el desarrollo del tumor o después de la radiación. Tradicionalmente vascularización se ha considerado que se produzca a través de la angiogénesis, un proceso por el cual se forman nuevos vasos a partir de la germinación de vasos preexistentes 12. Sin embargo, estudios más recientes sugieren que el proceso embrionario previamente asumido de la vasculogénesis puede estar jugando un papel más importante en la formación de la vasculatura patológica. Virginiasculogenesis implica el reclutamiento de los homólogos Angioblast adultas de la médula ósea que a su vez están entonces directamente involucrado en la formación de nuevo endotelio de los vasos 12-14. La acumulación de pruebas indica que las células precursoras endoteliales se movilizan desde la médula ósea para iniciar la formación de vasos de novo en respuesta a mediadores oncogénicos 15-17. Sin embargo, estos estudios proporcionan pruebas contradictorias para la contribución directa de estas células derivadas de médula ósea (BMDCs) al endotelio de los vasos con el porcentaje de la contribución que varía con el tipo de estímulo patológico y respuesta al tratamiento 18-21.

Por lo tanto, el establecimiento de métodos experimentales reproducibles que permiten alta resolución intravital repetida de imágenes para estudio a largo plazo del proceso de integración BMDC en la vasculatura del tumor y en la respuesta a la terapia es muy valiosa. Técnicas histológicas estándar no proporcionan la información dinámicamación necesaria para determinar la supervivencia a largo plazo, la diferenciación y la integración de las células que dan lugar a la neovasculatura y por lo tanto no puede demostrar definitivamente los mecanismos de interacción de las células.

Hemos demostrado el uso de nuestro enfoque experimental de que hay un grado variable de reclutamiento BMDC siguiendo tanto la radiación ionizante intracraneal y el crecimiento del tumor, un reclutamiento que es, sin embargo, el sitio de la patología específica y no una invasión de todo el tejido intracraneal 11,22. Hemos demostrado que el reclutamiento sigue un patrón sensible al tiempo demostrada por la formación de imágenes repetidas de un solo animal 11,22. Del mismo modo, en la formación de imágenes in vivo también puede proporcionar información inestimable en mimetismo de células tumorales mediante el cual las células tumorales marcadas con fluorescencia se pueden obtener imágenes y rastreados con un anticuerpo intra-CD31 vitales para las células endoteliales para poner de relieve la posibilidad de transdiferenciación de células tumorales para formar directamente su propio endotelio.

La versatilidad del modelo se ve reforzada por la capacidad de la imagen 4 canales fluorescentes, proporcionando un número exhaustiva de combinaciones para el estudio de la variación de proceso celular y biológica. Podemos intravitally imagen CFP (azul), GFP (verde), Cherry / RFP (rojo) y Alexa647/APC (rojo lejano), al mismo tiempo en un solo campo repetidamente en el tiempo. Los investigadores pueden modificar genéticamente las células para expresar fluorocromos para cada uno de los canales, así como colorantes de compra y anticuerpos para resaltar los cambios estructurales de particular interés. Hasta la fecha, colorantes y anticuerpos utilizados en los estudios incluyen CD31 y dextrano que tanto destacado la microvasculatura y sus cambios en el tejido 1,11,23,24, aunque se utilizó el canal rojo lejano para este propósito ambos están disponibles para su uso en el otro canales mencionados. Del mismo modo, otros tintes incluyendo Sytox naranja, que pondrá de relieve las áreas de la apoptosis, y marcadores tales como los de la empresa Visen, han sido SPEcamente diseñado para su uso in vivo. Además de los cuatro canales fluorescentes comúnmente utilizados mencionadas, se puede añadir un canal de generación de segundo armónico (SHG) y optimizado para la imagen de las fibras de colágeno endógenas del modelo 7, la visualización de la membrana basal circundante vasculatura.

Para demostrar la capacidad de adaptación de nuestro modelo, así como las interacciones célula-célula antes mencionados, hemos sido capaces de estudiar las interacciones célula-fármaco. Hemos pasado revista a los inhibidores de la droga como AMD3100, un inhibidor de la SDF-1, y su papel en las redes de señalización que intervienen en la contratación BMDC 11. Del mismo modo que hemos manipulado genéticamente a cabo xenoinjertos de glioma U87 células para expresar VEGFTrap, un inhibidor de VEGF 25, en conjunto a través de un IRES a una molécula de GFP. Mediante el uso de RFP + BM somos capaces de estudiar el papel de VEGF tiene sobre la contratación de BMDCs a la vasculatura. Más recientemente, hemos utilizado el modelo para estudiar la cinética de drogas mirando a la MEChanism detrás de la droga fluoresceína tumor delineando 26, a un nivel celular. A través del uso de una costumbre-construido en la casa pequeña irradiador de animales que hemos sido capaces de integrar radiación entregada estereotáctica para evaluar la respuesta de tanto tumor y BMDCs al tratamiento.

A través de la utilización de nuestros nuevos intravital método de formación de imágenes investigadores podrán apreciar los cambios de una sola célula en tiempo real que se producen en diversas patologías y sistemas, ayudando a la elucidación de muchas características funcionales y biológicas de cambios en el tejido.

Protocolo

TODO EL TRABAJO animal ha sido objeto de una CUIDADO ANIMAL Y COMITÉ DE USO protocolo aprobado y ejecutado en observancia con los lineamientos, reglamentos y las agencias reguladoras.

Para tener una referencia de solución de problemas Tabla 2.

1. Bone Marrow Reconstitución (Opcional) Figura 1 (30 minutos de preparación, 5 min por ratón)

Toda la cirugía se debe realizar utilizando una técnica aséptica con equipo esterilizado en autoclave.

Un ratón donante reconstituir tres ratones de acogida.

  1. Anestesiar a los ratones receptores DNOSCID y posición, con el plomo para proteger la cabeza, en el interior del centro irradiador del Gammacell 40 'opresor'.
  2. Irradiar ratones DNOSCID con 2,5 Gy de irradiación corporal total (TBI).

Paso crítico: Optimización de la lesión cerebral traumática puede ser necesaria debido a la variación en la dosis requerida para el huésped inmune suficiente ceagotamiento ll en diferentes cepas de ratón.

Punto de pausa: los ratones de acogida pueden ser irradiados por adelantado, pero deben utilizarse dentro de las 24 horas de irradiación.

  1. La eutanasia a los ratones donantes de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales institucional. Limpie las extremidades posteriores y retire la tibia y el fémur de ambas, pelar todo el exceso de tejido de los huesos (Figuras 1ai, 1aii).

PASO CRÍTICO: huesos peroné no son viables para su uso debido a la luz muy estrechos.

  1. Retire las placas extremas de ambos extremos de cuatro huesos extraídos y eliminar a cabo utilizando una aguja de calibre 22 y 1 ml de PBS estéril hasta que son de color blanco en aspecto (Figura 1Aiii). Referencia Tabla 2.
  2. Mezclar la suspensión de médula ósea extraída (BM) y así sacar 300 l en tres agujas 27 G tuberculina. Extraído BM debe contener aproximadamente 2 x 10 7 células yes suficiente para 3 huéspedes ratones reconstituciones. Referencia Tabla 2.
  3. Inyectar la suspensión en la vena lateral de la cola de tres ratones DNOSCID previamente irradiados desde el paso 1.1 (Figura 1b). Referencia Tabla 2.

PRECAUCIÓN: Para comprobar la esterilidad del BM inyecta recomendamos plateando el restante BM y la cultura durante 24 horas para verificar si hay infección. Primera causa de muerte en este punto es la infección en los ratones recién reconstituido.

2. Intracraneal Generación Window - La figura 2 (30 min por ratón)

Toda la cirugía se debe realizar utilizando una técnica aséptica con equipo esterilizado en autoclave y bajo una lámpara de calor para mantener a los animales tibia (Figura 2A).

  1. Anestesiar a los ratones receptores DNOSCID con IACUC aprobado anestesia, inyección IP Avertin a 0,5 mg / g y la posición, con la ventaja de proteger la cabeza, en el interior del centro de laGammacell 40 'opresor' irradiador. Retire el cabello del cuero cabelludo. Además de aplicar el gel lacrimógenos para evitar la deshidratación corneal.
  2. Limpieza del cuero cabelludo primero con una solución de Betadine y luego con alcohol, a continuación, hacer una incisión desde el punto medio de los oídos a justo por encima de los ojos. Retire el cuero cabelludo 3 mm a cada lado de la primera incisión, dejando al descubierto el cráneo y puntos de referencia de la superficie del cráneo (Figura 2Bi).
  3. Eleve el periostio mediante la inyección de lidocaína al 2%: solución de epinefrina y disección de la superficie de cráneo (Figura 2 B II).
  4. Uso de 2,7 mm trépano de perforación, debilitar a un círculo de 2,7 mm en el cráneo sobre la corteza del hemisferio derecho entre lambda y bregma. No penetran en el hueso con la broca (Figura 2Biii). Referencia Tabla 2.

Paso crítico: si taladro atraviesa el cráneo de la superficie del cerebro se daña que influyen en los resultados con tra adicionaluma. Además sangrado excesivo se producirá la prevención de una ventana transparente que se genere.

  1. Retire la tapa ósea debilitada con unas pinzas de disección y gancho dental y la fuerza deliberada pero controlado (Figura 2Biii).
  2. (Opcional) Si mirando patología tumoral, inyectar elegido líneas de células tumorales (con el gen reportero fluorescente) en el centro de la ventana generado en el paso 2.5.
    1. Cargue 10 l 30 G Hamilton jeringa con la suspensión celular y la aguja de carga en un marco estereotáctico.
      Paso crítico: se necesita el número de teléfono para ser optimizado para las células tumorales en el uso y la línea de tiempo de crecimiento requerido. Por U87 culturas usamos 2 x 10 5 células en 10 l por ratón.
    2. Cargar ratón sobre el marco estereotáctico digital de alinear la aguja hasta el punto de la ventana generada centro.
    3. Baje la aguja hasta que toque la superficie cortical y restablecer las coordenadas digital.
    4. Bajoer la aguja de 3,2 mm en el tejido cortical e inyectar a 3 mm de profundidad.
    5. Retirar la aguja lentamente luego retire del ratón en el cuadro.
      PASO CRÍTICO: Se inyecta solución sobre la duración de 1 minuto y dejar la aguja en su posición después de la inyección para asegurar reducido el reflujo.
      Paso crítico: si se da menor hemorragia irrigar con solución salina estéril para 1-5 minutos para detener el sangrado superficial. Continúe con los pasos siguientes.
  3. Humedecer la superficie del cerebro con una gota de PBS estéril para mantener el tejido cerebral regada.
  4. Flotador un cubreobjetos de 3 mm sobre la superficie del cerebro para sellar completamente alrededor de la ventana de 2,7 mm generado. Referencia Tabla 2.
  5. Cráneo que rodea completamente seca luego aplicar Vetbond a todo el cráneo expuesto al tejido del cuero cabelludo resellado hasta los huesos del cráneo y el cubreobjetos en su lugar. NO aplique un exceso ya que se fuga bajo el cristal y disminuir el potencial de creación de imágenes.
  6. Mix polvo de acrílico dental fresca y solución, más o menos 30% (w / v), y se aplican sobre la parte superior de la Vetbond. Para garantizar un sello hermético se solapan ligeramente el acrílico en el cubreobjetos borde de vidrio (Figura 2Biv). Tabla de referencia 2.

PRECAUCIÓN: Dental acrílico es extremadamente peligroso por lo que recomendamos el uso de guantes y mascarilla durante todo el procedimiento.

PASO CRÍTICO: acrílico dental debe permanecer flexible durante el moldeo para asegurar un buen sellado y reducir el exceso. La acumulación de acrílico en la ventana se difuminar imágenes.

  1. Permitir que los ratones que se recuperan en una jaula caliente.

3. La radiación estereotáctica (Opcional) - Figura 3 (25 min por ratón)

Las variaciones existen en los diferentes irradiadores utiliza y como se exigirá dicha optimización. Se utilizó un irradiador de diseño personalizado.

  1. Anestesiar ratonesutilizando isoflurano en el 4% para la inducción seguido de 1,5-2% durante todo el procedimiento con 0,5-1 litros de O2 un minuto, y el lugar en que detiene la cabeza de encargo dentro de la irradiación estereotáctica (Figura 3Ai).
  2. Obtener un 360 ° del cono del haz de CT scan con el tubo de rayos X funcionando a 40 kVp y 0,05 mA a través de un filtro de aluminio de 2 mm. Utilice la imagen para guiar el movimiento de la etapa, la dirección de la radiación isocentro en el hemisferio derecho asegurándose de que es central en la dirección ventral dorsal.
  3. Inserte el colimador hemisférica mm x 8 mm bloque 11.

PASO CRÍTICO: colimadores pueden ser diseñados para muchas configuraciones diferentes y así se puede mejorar para incluir y excluir a diferentes partes del cerebro. 8 mm x 11 mm define una zona hemisférica del cerebro.

  1. Obtener individuales imágenes ortogonales CT tanto desde la parte superior (AP) y la parte inferior (PA) a través del colimador para mejorar aún más la colocación del cerebro, Anatestructuras óseas omical se pueden utilizar para la reproducibilidad.
  2. Cambio del filtro de aluminio para un tratamiento de cobre 0,93 mm filtra y administrar la mitad de la dosis de radiación deseada con el tubo de rayos X funcionando a 225 kVp y 13 mA desde la parte superior en una dirección AP.
  3. Volver pórtico a la posición inferior y administrar la segunda mitad de la dosis de radiación de nuevo con el tubo de rayos X funcionando a 225 kVp y 13 mA forma la parte inferior en una dirección PA.

Paso crítico: Es esencial para irradiar tanto desde la parte superior y la parte inferior para reducir el gradiente de temperatura ambiente a través del tejido del cerebro, sino que también ayuda con la alineación del isocentro al centro del cerebro.

4 En vivo dos fotones microscopía láser -. Figura 3 (1-3 horas por sesión)

Las variaciones existen en los diferentes microscopios utilizados y que se requerirá dicha optimización. Se utilizó un Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal microscopio.

  1. Anestesiar a los ratones con IACUC aprobado anestésico, inyección IP Avertin al 0,5 ventana mg / g y limpio que usa el aerosol de alcohol.
    1. (Opcional) Inyectar etiquetado 5-10 min colorante vascular antes de la imagen, en la vena de la cola antes de la imagen. Alexa647-dextrano utilizado en 0,35 mg / g o APC-CD31 usado en 0,2 mg / g. Ver Tabla 2.
    2. (Opcional) Inyectar fluoresceína a través de la vena de la cola a una dosis de 7,7 mg / kg, 5 min antes de la imagen, para delinear tumoral. Referencia Tabla 2.
  3. Canales de configuración en el microscopio confocal tal como se determina por el fluorocromo utilizado en el ratón quimérico generado. Tabla 1 demuestra los canales descritos en este modelo.
  4. Invertir ratón sobre la platina del microscopio móvil y estabilizar la cabeza en posición con moldeable plastilina. (Figura 3Aii) Tabla de Referencia 2.

Paso crítico: La ICW tiene que ser perpendicular al punto de láser y como tal debe ser colocada horizontalmente para asegurar la formación de imágenes es óptima.

  1. Encienda el primer láser de canal y utilizar para situar en el centro de la ICW.
  2. Use lentes de 5x y tomar una imagen de toda la ventana para utilizarlo como un mapa de imágenes de resolución más altos.
  3. Imágenes debería llevarse a cabo utilizando 10X y 20X lentes 'largo alcance' para obtener la mejor calidad de imagen.

PASO CRÍTICO: Canales y objetivos de la 2PLM debe establecerse mediante ingeniería celular in vitro antes de la proyección de imagen de modelos murinos para asegurarse de que ponen de relieve el fluorocromo correcta.

Fluorocromo CFP GFP / fluoresceína / FITC mCherry / RFP / DsRED APC / Alexa647 SHG Autofluorescence
Láser de excitación 458 nm 488 nm 543 nm 633 nm Camaleón láser 820 nm
Colección filtro 480-520 nm 500-550 nm 565-615 nm 650-710 nm 390-465 nm

Tabla 1. Configuración fluorocromo. Guías para el usuario para ver el láser de excitación y espectros de emisión colector utilizado para cada uno de los canales disponibles en el modelo.

Resultados

El paso opcional de la reconstitución de la BM de ratones DNOSCID debería resultar en una absorción de 80% de la BM fluorescente "donante" en el 100% de los ratones DNOSCID el "anfitrión", se requiere sin embargo la optimización de la lesión cerebral traumática para mejorar la reconstitución en otra no -immunocompromsed cepas. Si los ratones se reconstituye sin éxito que se enferman y mueren rápidamente después del procedimiento, los ratones debilitados pueden requerir suplementos de alimentación y las fuentes de agua.

La ICW vez terminado debe ser similar a la que se observa en la Figura 2Biv. Lo ideal es tener una cadena de acrílico que rodea el cubreobjetos de vidrio, ya que da fuerza a la unión con el cráneo. Ventanas perfectas son reproducibles y permiten la formación de imágenes repetidas hasta 8 semanas después de su generación (Figura 2 C). Las imágenes producidas por estas ventanas óptimas se verá como los que se observan en la figura 3Bi. Las imperfecciones en la generación ventana producirán imágenes de malala calidad, por ejemplo, burbujas de aire bajo la ventana evitará campos enteros de vista que se está estudiando, aparecerán áreas oscuras como el aire evita que la formación de imágenes con láser (Figura 3Bii). Con exceso de pegamento y acrílico sobre el cubreobjetos habrá un alto nivel de fondo fluorescencia y las áreas del campo está borrado como se ve en la Figura 3Biii, de manera similar, si hay suciedad en los pequeños puntos de ventana de fluorescencia de fondo serán visibles en el campo (Figura 3Biv).

El éxito de la ICW formación de imágenes está predeterminado por la integridad de la técnica quirúrgica, sin embargo, incluso ICWS óptimas pueden encontrar problemas durante la sesión de formación de imágenes. Como tal, existe un tipo y el grado de claridad de las imágenes generadas, como se ve en la Figura 3. La calidad de imagen publicación retratado en la figura 3C se produce cuando todo es óptimo. A pesar de que no es posible para todos los ratones, es factible esperar que 80% de la imagens generados a tener este aspecto. Una de las principales fallas en la configuración de la microscopía actual es el uso de rayos láser invertidos. Tienen que ser colocados en sus espaldas y esto se traduce en exceso de estrés y el malestar que puede conducir a la dificultad para respirar durante la proyección de imagen Ratones. Esto produce una imagen 'forrado' como respiración interfiere con el promedio que se produce durante la proyección de imagen, por lo que, cada fila de píxeles se crea una imagen cuatro veces y la media de las cuatro que se muestra en la imagen final. Cualquier movimiento durante el cálculo del promedio, como la causada por la dificultad para respirar, creará un artefacto que aparece como una línea en la imagen, como se ve en la Figura 3D. Los ratones que no son suficientemente anestesiado durante la exploración pueden encontrar este problema también. El efecto 'forrado' puede ser disminuido mediante la limitación de la imagen en promedio a, sin embargo, esto se convertirá en reducir la calidad de la imagen y no puede eliminar el problema. Alternativamente ratones pueden ser recolocados o juzgados cuando la respiración se ha normalizado. El uso of un 2PLM verticales negaría este problema ya que los ratones podrían ser reflejados "en la posición prona. Un problema adicional con la formación de imágenes en una 2PLM invertida incluye la accesibilidad limitada para el posicionamiento de la ICW una vez que el ratón está en el microscopio, y esto conduce a imágenes 'segmentados' como los que se observan en la figura 3E. Aquí el láser y el cubreobjetos no se posicionan perpendicularmente el uno al otro y, como tal, la formación de imágenes se produce en un ángulo. Esto da como resultado la generación de una imagen 'segmentado' donde no se crean imágenes de los lados del campo de visión. El problema se resuelve fácilmente con el reposicionamiento del ratón para asegurar el cubreobjetos es totalmente horizontal, una vez en el cabezal de montaje como se ve en la Figura 3Aii.

El modelo presentado aquí se utilizan específicamente para examinar el papel de BMDCs en la vascularización del tejido tumoral y demuestra la capacidad de utilizar tres canales diferentes al mismo tiempo (cereza, GFP, rojo lejano - Alexa647 y APC) Making la PPC y los grupos de autoayuda redundante para esta historia en particular. Hemos sido capaces de ratones de imagen longitudinal de hasta 8 semanas, el estudio de la contratación y la integración de las células de la MO en el sistema vascular a nivel de células individuales, sin efectos perjudiciales causados ​​por la ventana. Este modelo demuestra la facilidad de recogida de información dinámica de la fuente y la formación de la vasculatura y la interacción de diferentes tipos de células de interés, previamente perdidos a través del punto final análisis histológico.

Paso Problema Razonamiento Solución
1.4 Bone añicos Herramientas Blunt Recoger la médula ósea formar un ratón fresco con unas tijeras afiladas o hoja de bisturí fresco, fragmentos de hueso inhibirán inyección de TV
1.5 Extracción Low (bajo viscosity) Placas terminales hueso cortado demasiado distante; método de recolección de pobres Bones se deben cortar como proximal como sea posible y recoger con el hueso en el interior del tubo de recogida para evitar salpicaduras
El tiempo debe ser gastado para extraer el BM al máximo y con la atención
Si la piscina es necesario más de un ratón en 1 ml
Alta de extracción (alta viscosidad) Tampón de baja colección Diluir a cabo con solución adicional 0,1% BSA, divididos a tres ratones receptores hasta 500 l por máxima ratón
1.6 La inyección intravenosa inadecuado Malo vasodilatación y la visibilidad buque Mejorar la dilatación con lámpara de calor. Coloque el cursor en la inmovilización vena de la cola con una función en la fuente de luz para facilitar el acceso
1 Los ratones enfermos Infección Sacrificar los ratones de acuerdo con reglas de la institución. Asegúrese de colas se limpian antes de la inyección y comprobar la esterilidadextraída de BM en la cultura
Mueren Ratones Pobre absorción BM Revise% de absorción fluorescente BM del ratón muerto.
Optimizar TBI para la cepa de ratones que se utilizan
Aumentar la cantidad de inyección de BM (ejemplo, el uso de un ratón donante para dos receptores)
2.4 Hemorragia menor Dura violada durante la perforación Presión con almohadillas de gel y lavado continuo y solución salina estéril
Hemorragia mayor Cerebro dañado por la perforación Sacrificio ratón de acuerdo a las directrices de la institución
2.8 Aire burbujas bajo el cubreobjetos Mal contacto con la superficie cortical impide la colocación adecuada Quite el cubreobjetos y añadir PBS extra para flotar el cubreobjetos sobre la ventana para eliminar las burbujas
2.10 El deslizamiento de cubreobjetos durante encolado Acrmasa ylic es pesado, ejerciendo presión sobre el portaobjetos y el cubreobjetos mueve fuera del camino Pinzas debe ser usado para mantener cubreobjetos hacia abajo mientras se aplica Vetbond y acrílico
4.2 La inyección intravenosa inadecuado Malo vasodilatación y la visibilidad buque Mejorar la dilatación con lámpara de calor. Coloque el cursor en la inmovilización vena de la cola con una función en la fuente de luz para facilitar el acceso
4.4
Figura 3C 		Imágenes 'forradas' Dificultad para respirar o irregular Retire del ratón del marco y permitir recuperar
Aumente el nivel de anestesia administrada y ajustar la posición para garantizar cuello no es excesivamente flexionada o extendida para evitar respirar
Figura 3C Imagen "segmentado" Cerebro no es paralelo a los objetivos Ajuste la posición del portaobjetos para garantizar que es plana
Vessel no visualizó inyección intravascular no se ve Vuelva a realizar la inyección en vena de la cola alternativa, cola caliente para asegurar una buena vasodilatación
Fondo de alta Dirty cubreobjetos,
Burbujas de aire, de acrílico 		Limpie cubreobjetos con un paño húmedo de etanol al 70%, no en remojo como puede penetrar bajo acrílico y dañar el tejido cerebral

Tabla 2. Solución de problemas. Una guía para las medidas correctivas necesarias para las áreas problemáticas de los procedimientos.

figure-results-1
Esquemas 1. Diagrama de flujo experimental. Esto demuestra la cronología de los eventos a través de medidas experimentales 1-4. Los modelos de ratón se configuran más de una semana, agarantizar la BM reconstituye adecuadamente, y no se trata con medicamentos hasta el día 7 del tumor para asegurar que los injertos tumorales. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

figure-results-2
Figura 1. Reconstitución BM. (A) procedimiento de extracción BM i. Disección de los huesos de las extremidades traseras. Ii. Disecado fémur y la tibia de las patas traseras, limpiado y preparado para la extracción. Iii. Bones con placa final removido y aclarar a fondo, lo que demuestra la apariencia blanca de los huesos vacíos. (B) Los esquemas demostrando donde las venas laterales para inyección se colocan en la cola.

figure-results-3
Figura 2. Generación de ICW. (A) de configuración recomendada aséptica (B) i. Superficie del cráneo expuesto revela los puntos de referencia necesarios para la cirugía, ICW debe colocarse en el hemisferio derecho equidistante de la bregma y lambda. Ii. Periostieum levantó con una solución de lidocaína, lista para la extracción . iii. gancho dental necesario para la eliminación del fragmento de hueso generado con el taladro. iv. ICW Terminado con acrílico dental. (C) Tres ventanas ejemplo demuestran la reproducibilidad del método.

figure-results-4
Figura 3. 2PLM resultados esperados. Todas las imágenes muestran verde BM, tumor rojo, azul (pseudo color rojo lejano) vasculatura. (A) i. Demuestra el marco en la cabeza que mantiene el flujo de isoflurano en el interior del pequeño irradiador animal. El x 11 mm colimador 8 también se puede ver moverse a través del pórtico. Ii. Ratón en la posición invertida en el marco de la cabeza requerida para la formación de imágenes, plastercine moldeable asegura todas las ventanas pueden ser acomodados. (B) fotos demostrativos de los resultados de problemas con la generación de ventana a partir de i. una ventana óptima, ii. una ventana con las burbujas de aire atrapadas debajo, derrame acrílico iii sobre el cubreobjetos y iv. suciedad en la propia ventana. (C) pone de relieve los problemas que se producen con imágenes después de la generación con éxito de un ICW i. óptima formación de imágenes ii artefactos. respiracióncrear una imagen de 'forrado' iii. cubreobjetos no perpendiculares al láser genera una imagen "segmentado". Haga clic aquí para ver más grande la figura .

figure-results-5
La Figura 4. Usos funcionales y adaptaciones del modelo. (A) de procesamiento de imágenes posteriores PPC por lo que la imagen GFP se resta de la PPC en la imagen para revelar la imagen CFP cierto que puede ser sobrepuesto a los otros tres canales en blanco. Verde BM, tumor Red, White CSC, Azul (seudo color rojo lejano) vasculatura (B) Demostración de las fibras de colágeno que se pueden obtener imágenes con SHG. Verde dextrano, BM rojo, cian colágeno (C) i. células VEGFTrap en VITRo Demostrar la señal de GFP producida con el VEGFtrap. ii. Imágenes in vivo demuestra que las células VEGFtrap claramente y, además, destaca la facilidad de cambiar de canal para demostrar que el sistema que usted está viendo. Verde VEGFTRap + Tumor, Red BM, Azul (pseudo color rojo lejano) vasculatura. (D) Demuestra la colección de fluoresceína en el estroma del tumor y no en las células directamente, que se muestra por la falta de superposición de la señal verde con tumor rojo. Verde fluoresceína, tumor Roja. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Discusión

Los tres canales descritos en todas las imágenes hasta ahora son intercambiables para los tres marcadores de interés en otros modelos y hojas de investigadores con un valioso conjunto de herramientas para buscar un numerosos tipos de células y las interacciones. Es necesaria una planificación para asegurar que todos los marcadores y tipos de células se han integrado con éxito una molécula fluorescente reportero en un canal distinto.

Además de los tres canales estándar utilizados aquí también pudimos integrar un cuarto canal de PPC (Figura 4A) y una base de colágeno SHG canal 7 (Figura 4B). Esto extiende la posibilidad de ver las interacciones celulares in vivo y, además, permite la usuario para llevar a cabo mezclando población para estudiar las interacciones específicas célula-célula al tiempo que conserva dos canales para otros marcadores. Por ejemplo, hemos visto las células tumorales (RFP) y de las células madre del cáncer (CFP) en una proporción de 1:3 con un interés en la comparación de su intratuminteracciones orales (Figura 4). observamos que 7 días después de la implantación de la población mixta la relación fue confirmada y ambas poblaciones celulares aún se podía ver.

El canal de PPC proporciona problemas técnicos debido a la superposición con el canal de GFP tanto en excitación y espectros de emisión y, como tal, requiere de procesamiento de imágenes poste para definir la verdadera PPC + células de las que son realmente GFP +. Mensaje de procesamiento de imágenes puede llevarse a cabo en los microscopios 2-fotones construidas en el software Zeiss LSM directamente mediante el cual, la imagen de GFP se resta de la imagen PPC resultante en las células de la PPC verdadero ser dejados atrás (Figura 4A). La premisa para la relación de la resta es igualmente dependiente de imágenes brillantes y es debido a la PPC láser (458 nm) fluorescente tanto PPC y las células GFP GFP, mientras que el láser (488 nm) es demasiado alto para fluorescencia las células PPC. Además de la PPC, también hemos sido capaces de utilizar las configuraciones previamente publicados para mirar el grupo de autoayudaniveles y así representar las fibras de colágeno que constituyen la membrana basal circundante vasculatura, (Figura 4B).

Otra adaptación de este modelo se ha aprovechado de un irradiador de pequeños animales a la medida que tiene la capacidad de utilizar la radiación estereotáctica guiada para irradiar secciones de tejido tan pequeños como 2 mm de diámetro. Al dirigirse a la ventana con la irradiación es posible mirar a la radiación tiene efecto sobre el tejido subyacente. Hemos publicado recientemente un estudio mirando a la radiación tiene efecto sobre el tejido cerebral normal con respecto a la contratación de BMDCs a la vasculatura, buscando específicamente a su papel en los cambios posteriores de tejido de radiación. Encontramos que la contratación de los BMDCs era tiempo y dependiente de la dosis en el tejido normal 11.

Es factible para estudiar los mecanismos de entrega y la integración de la terapéutica que proporcionan el fármaco se etiqueta con un marcador fluorescente. Durantenuestra investigación hemos sido capaces de rastrear la producción de VEGFTrap, un fármaco anti-angiogénico que bloquea toda la señalización de VEGF en el área local de la producción 25. Por la modificación genética de las células tumorales para expresar el gen VEGFtrap junto con un IRES a EGFP (Figura 4Ci) y el uso de BM RFP 'donante' hemos sido capaces de la imagen de la EGFP: producción VEGFtrap, la interacción BMDC y la vasculatura simultáneamente (Figura 4Cii). Esto demostró la versatilidad del modelo y los canales disponibles. También es factible que mirar cinética del fármaco debido a la promesa de la resolución de una sola célula. Fluoresceína (GFP +) se utiliza para delinear los tumores durante la cirugía para garantizar la resección máxima se consigue 26. Mediante la inyección por vía intravenosa, mientras que la imagen es posible demostrar que la delineación NO se produce a través de la captación activa de la fluoresceína en las mismas células tumorales, pero en su lugar a través de la colección de la droga en la zona del estroma con time, visto por la falta de co-localización 10 min después de la inyección de la fluoresceína (Figura 4D).

En general, nuestra estrategia combina técnicas de nuevos y existentes para lograr una plataforma experimental único, lo que es ventajoso en el estudio de las interacciones celulares dinámicos. Esta estrategia ha demostrado ser un enfoque inestimable en el estudio de alta resolución evolución dinámica de una sola célula de BMDC, vascularización tumoral y normal del cerebro en respuesta a la terapia, intracraneal. Intravital de imágenes puede proporcionar una mejor comprensión de los reguladores moleculares de reclutamiento BMDC, la migración y la diferenciación en la vasculatura del tumor intracraneal cerebro, así como muchos otros procesos dinámicos adaptables a otros campos de investigación. Factores inhibidores putativos que regulan BMDC en combinación con otras estrategias terapéuticas pueden ayudar a la identificación de la sincronización precisa de las terapias combinatorias. Por otra parte, esta estrategia se puede adaptar a muchos futuro proyectos utilizando no sólo en vivo colorantes de tinción intravital, sino también pequeños inhibidores moleculares y nanopartículas que están marcadas con fluorescencia que permite a los investigadores rastrear la distribución y los patrones de migración de terapias más específicas, así como buscar longitudinalmente en su cinética.

Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al Fondo avanzada Microscopía Óptica en el Princess Margaret Hospital, en particular James Jonkman por su ayuda en la configuración inicial de los canales en el microscopio 2Photon. Los autores desean agradecer el Targeting espacio-temporal y amplificación del programa de respuesta a la radiación (STTARR) y sus organismos de financiación asociadas. Agradecemos al Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael y Dr.Andras Nagy para el suministro de los plásmidos VEGFTrap y para sus correcciones manuscritas y comentarios. El continuo apoyo y discusión de personal de la BTRC ha sido invaluable y nos gustaría para conmemorar Dr.Abhijit Guha por su aportación científica. El trabajo fue financiado por CIHR y subvenciones NIH.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo
NODSCIDratones Jackson Lab0013038 semanas de edad
Jackson Lab003516
ratones ACTB/DsREDJackson Lab005441
Gel LagrimalNovartisT296/2
2% Lidocaína-EpinefrinaBimeda MTC25SPUso neat
Vetbond3M1469SB
Kit acrílico autopolimerizableBosworth166260Uso ~30% (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647InvitrogenD22914Uso @ 0.6 mg/kg en solución salina
CD31-APCBDPharmingen551262Uso @ 0.3 mg/kg en solución salina
AK-fluor (fluoresceína) 10%AKORN inc.NDC 17478-253-10Uso @ 7.7 mg/kg en
de BetadineProductos Purdue NDC67618-150
Equipment
Pinzas finasVWR82027-402
Tijeras de disección finaVWR25870-002
Aguja 22GBD305156
27G Jeringa TB de 0,5 mlBD305620
Microtaladro de manoHerramientas de ciencia fina18000-17
Broca trephine de 2,7 mmHerramientas de ciencia fina18004-27
10 μ l Jeringa Hamilton 30GSigma Aldrich20909-U
Cubreobjetos de vidrio 3 mmWarner Instruments64-0720 CS-3R
Gafas de fluorescenciaBLSFHS/T01Marco de cabeza básico
Marco estereotáxicostoelting51950
Protector de ratón para inyección intravenosaBrain Tree LifescienceMTI
ratones B5/EGFP de solución salina

Referencias

  1. Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
  2. Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
  3. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
  4. Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74(2008).
  5. Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
  6. Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
  7. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).
  9. Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  10. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
  11. Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366(2012).
  12. Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
  13. Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
  14. Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641(2010).
  15. Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
  16. Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
  17. Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
  18. Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
  19. Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
  20. Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
  21. Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
  22. Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
  23. Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
  24. Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
  25. Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
  26. Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ventana intracranealmicroscop a de dos fotonesc lulas progenitoras de la m dula seairradiaci n estereot cticaratones quim ricos fluorescentesim genes en tiempo realresoluci n de c lula nicadin mica de vascularizaci nmigraci n de c lulas tumoralesmarcado con dextrano

Artículos relacionados