Vi beskriver en roman<em> In vivo</em> Tenkelig teknikk som par fluorescerende kimere mus med intrakranielle vinduer og høyoppløselige to-foton mikroskopi. Dette bildebehandling plattform hjelpemidler studier av dynamiske endringer i hjernevev og microvasculature, på en encellet nivå, etter patologiske fornærmelser og er tilpasningsdyktig til å vurdere intrakranielt stoffet levering og distribusjon.
Vi har nå integrert tidligere etablert Intrakranial vindu (ICW) teknologi 1-4 med intravital to-foton konfokalmikroskopi å utvikle en ny plattform som gir mulighet for direkte langsiktig visualisering av vev strukturen endres intracranially. Bildebehandling til en enkelt celle oppløsning i sanntid mote gir utfyllende dynamisk informasjon utover det som tilbys av standard endepunkt histologisk analyse, som ser utelukkende på "snap-shot" tverrsnitt av vev.
Etablering av denne intravital avbildningsteknikk i fluoriserende kimere mus, er vi i stand til å avbilde fire fluorescerende kanaler samtidig. Ved å innlemme fluorescensmerkede celler, for eksempel GFP + benmarg, er det mulig å spore skjebnen til disse cellene som studerer deres langsiktige migrasjon, integrasjon og differensiering innen vev. Ytterligere integrering av en sekundær reporter celle, for eksempel en mCherry glioma linje, tillater karakterization av celle: celle interaksjoner. Strukturelle endringer i vevet microenvironment kan bli markert gjennom tilførsel av intra-vitale fargestoffer og antistoffer, for eksempel CD31 merket antistoffer og Dextran molekyler.
Videre beskriver vi en kombinasjon av et icw avbildning modell med et lite dyr mikro-irradiator som gir stereotaktisk bestråling, noe som skaper en plattform hvor de dynamiske vevs-forandringer som oppstår i forbindelse med administrering av ioniserende bestråling kan vurderes.
Aktuelle begrensninger av vår modell omfatter penetrans av mikroskopet, som er begrenset til en dybde på opp til 900 mikrometer fra sub kortikale overflate, noe som begrenser imaging til den dorsale aksen av hjernen. Tilstedeværelsen av hodeskallen ben gjør icw en mer utfordrende teknisk fremgangsmåte, sammenlignet med de mer etablerte og utnyttes kammer modeller for tiden brukes til å studere mammary vev og fett pads 5-7. I tillegg ICW provIdes mange utfordringer når optimalisere bildebehandling.
En bedre forståelse av de strukturelle og biologiske forandringer som oppstår i hjernen som reaksjon på forskjellige patologier, og terapeutiske intervensjoner er kritisk for å forbedre behandlingsstrategier. Imidlertid er en av de aktuelle utfordringer i å studere disse strukturelle og biologiske forandringer, særlig med hensyn på intrakranial patologier, er utilgjengeligheten til det vev og den manglende evne til å studere den tidsmessige utvikling og progresjon av dynamiske forandringer i et in vivo miljø. Den generasjonen av "vinduet"-teknologi har tidligere vist seg vellykket i å undersøke bløtvev endringer gjennom tumor utvikling 5-7. Utvikling av ICW modeller viser seg å være mer teknisk utfordrende, på grunn av nødvendigheten av å fjerne skalleben uten skade på egge-infeksjon i den underliggende cerebralt vev. Tidligere papirer har forsøkt å tynne skallen å visualisere vev 8-10 imidlertid å produsere høy oppløsning klar imaldre fullstendig fjerning av skallen benet er behov 11. Gjenta langsiktig imaging (30 dager +) har nylig blitt et mulig alternativ gjennom bildebehandling 1,11, tidligere har kortere tidsrammer blitt studert fem.
I løpet av det siste tiåret et viktig mål har vært å belyse opprinnelsen av neo-vaskulaturen følgende patologiske stimuli, spesielt i respons til tumordannelse og progresjon, for å tilveiebringe nye terapeutiske mål for behandling av tumorer. Mye kontrovers forblir rundt kilden til nye blodkar i hjernen under tumorutvikling eller etter stråling. Tradisjonelt vascularization har vært ansett å skje gjennom angiogenese, en prosess der nye skip dannes fra den spirende av pre-eksisterende fartøy 12. Nyere studier imidlertid antyde at det tidligere antatte embryonale prosess for vaskulogenese spiller muligens en mer betydelig rolle i dannelsen av patologiske vaskulatur. Vasculogenesis innebærer rekruttering av de voksne angioblast kolleger fra benmargen som igjen er så direkte involvert i dannelsen av nye fartøy endotel 12-14. Oppsamling av bevis indikerer at endoteliale forløperceller blir mobilisert fra benmargen til å initiere de novo fartøy dannelse i respons til onkogene mediatorer 15-17. Men disse studiene gir motstridende bevis for den direkte bidraget av disse avledet benmarg-celler (BMDCs) til fartøy-endotel ved prosentvis bidrag varierende med typen av patologiske stimulans og respons på behandling 18-21.
Derfor etablere reproduserbare eksperimentelle metoder som tillater høy oppløsning intravital bildebehandling for gjentatt langvarig studie av prosessen med BMDC integrering i tumor blodkar og i respons på behandlingen er uvurderlig. Standard histologiske teknikker ikke gir dynamisk inforsjon som kreves for å fastslå den langsiktige overlevelse, differensiering og integrering av cellene som gir opphav til neovaskulatur og kan derfor ikke demonstrere definitivt mekanismer for celle interaksjon.
Vi har vist ved hjelp av vår eksperimentelle tilnærming at det er varierende grad av BMDC rekruttering etter både intrakranielt ioniserende stråling og tumorvekst, en rekruttering som er imidlertid patologi stedsspesifikke og ikke en invasjon av hele intrakranielle vev 11,22. Vi har vist at rekruttering følger en tid følsom mønster demonstrert ved gjentatt avbildning av et enkelt dyr 11,22. På samme måte kan in vivo avbildning også gi uvurderlig innsikt i tumorcelle mimikk der fluorescently merket kreftceller kan avbildes og spores med en intra-vital CD31 antistoff for endotelceller å fremheve muligheten for svulst celle transdifferentiation til direkte danne sin egen endotelet.
<pclass = "jove_content"> Allsidigheten av modellen er forbedret med evnen til bilde 4 fluorescerende kanaler, noe som gir en uttømmende antall kombinasjoner for studiet av varierende mobilnettet og biologisk prosess. Vi er i stand til å intravitally image CFP (blå), GFP (grønt), Cherry / RFP (red), og Alexa647/APC (langt-rød), samtidig i et enkelt felt gjentatte ganger over tid. Forskere kan genmodifisere cellene til å uttrykke fluorokromer for hver av kanalene samt kjøp fargestoffer og antistoffer for å markere strukturelle endringer av spesiell interesse. Hittil fargestoffer og antistoffer som vanligvis brukes i analyser inkluderer CD31 og dekstran som begge høydepunkt microvasculature og dets endringer i vev 1,11,23,24, selv om vi har benyttet den fjerne røde kanal for dette formål både er tilgjengelig for bruk i den annen kanaler nevnt. Tilsvarende har andre fargestoffer inkludert Sytox Orange, som vil fremheve områder av apoptose, og markører som de fra selskapet visen, vært specifically utformet for bruk in vivo. Videre til de fire vanlige fluorescerende kanaler som er nevnt, kan en andre harmonisk generasjon (SHG) kanal legges og optimalisert for å image de endogene kollagen fibrene i modell 7, visualisere kjelleren membranen rundt blodkar.For å demonstrere tilpasning av vår modell, samt celle-celle interaksjoner nevnt ovenfor, har vi vært i stand til å studere narkotika-celle interaksjoner. Vi har sett på narkotika-hemmere som AMD3100, en SDF-1-hemmer, og dens rolle i signalering nettverk involvert i BMDC rekruttering 11. Tilsvarende har vi genmodifisert ut U87 glioma xenografts celler til å uttrykke VEGFTrap, en VEGF-hemmer 25, i forbindelse gjennom en IRES til en GFP molekyl. Ved å bruke RFP + BM er vi i stand til å studere rollen VEGF har på rekruttering av BMDCs til blodkar. Nå nylig har vi brukt modellen til å studere narkotika kinetikk ser på mechanism bak tumor-opptegning narkotika 26 Fluorescein, på cellenivå. Gjennom bruk av en spesialbygd i huset små dyr irradiator vi har vært i stand til å integrere stereotaktisk levert stråling for å vurdere responsen fra både svulsten og BMDCs til behandling.
Gjennom bruk av våre nye intravital bildebehandling metoden forskerne skal få innsikt i de encellede sanntid endringer som oppstår i ulike sykdommer og systemer, hjelpe klarlegging av mange funksjonelle og biologiske funksjoner av vevsforandringer.
De tre kanalene som er beskrevet i alle bildene så langt er utskiftbare for tre markører av interesse i andre modeller og blader forskere med en uvurderlig sett med verktøy for å se en rekke celletyper og interaksjoner. Planlegging er nødvendig for å sikre at alle markører og celletyper har nå integrert en reporter fluorescens molekyl i en distinkt kanal.
I tillegg til de vanlige tre kanaler som brukes her kunne vi også integrere en fjerde CFP kanal (figur 4A) og en SHG kollagen baserte kanal 7 (figur 4B). Dette utvider muligheten for å se på cellulære interaksjoner in vivo og i tillegg tillater brukeren å foreta befolkningen blanding for å studere spesifikke celle-celle interaksjoner og samtidig beholde to kanaler for andre markører. For eksempel har vi sett på tumorceller (RFP) og kreft stamceller (CFP) i forholdet 1:03 med en interesse i å sammenligne sin intratummuntlige interaksjoner (Figur 4A). Vi observerte at 7 dager etter implantasjon av blandet befolkning forholdet ble opprettholdt og begge celle populasjoner kan fortsatt bli sett.
CFP kanal gir tekniske problemer på grunn av overlapping med GFP kanal i både eksitasjon og emisjon spektra og som sådan krever innlegget bildebehandling behandling for å definere den sanne CFP + celler fra de som faktisk er GFP +. Post bildebehandling behandling kan utføres på to-foton mikroskop bygd i Zeiss LSM programvaren direkte der, er GFP bildet trekkes fra CFP bildet og gir den sanne CFP cellene blir etterlatt (Figur 4A). Forutsetningen for forholdet subtraksjon er avhengig like klare bilder og er på grunn av CFP laseren (458 nm) fluorescerende både CFP og GFP-celler mens GFP laseren (488 nm) er for høy til å fluorescere CFP celler. I tillegg til CFP har vi også kunnet bruke tidligere publiserte oppsett for å se på SHGnivåer og så avbilder kollagenfibre som utgjør basalmembran rundt blodkar, (figur 4B).
En annen tilpasning av denne modellen har benyttet seg av en tilpasset bygget små dyr irradiator som har evnen til å bruke stereotaktisk guidet stråling for å bestråle seksjoner av vev så liten som 2 mm i diameter. Ved å målrette vinduet med bestråling er det mulig å se på effekten stråling har på det underliggende vev. Vi har nylig publisert en studie ser på effekten strålingen har på normalt hjernevev med hensyn til rekruttering av BMDCs til blodkar, ser spesielt på deres rolle i innlegget stråling vevsforandringer. Vi fant at rekruttering av BMDCs var både tid og doseavhengig i normalt vev 11.
Det er mulig å studere mekanismene for levering og integrering av legemiddelselskap som gir stoffet er merket med et fluoriserende fargestoff. Undervår forskning har vi kunnet spore produksjonen av VEGFTrap, en antiangiogenisk medikament som blokkerer all VEGF signalering i det lokale området i produksjon 25. Ved å genetisk modifisere våre kreftceller å uttrykke VEGFtrap genet kombinert med en IRES til EGFP (figur 4CI) og bruk RFP 'donor' BM kunne vi avbilde EGFP: VEGFtrap produksjon, BMDC samhandling og blodkar samtidig (Figur 4Cii). Dette viste allsidigheten av modellen og kanaler tilgjengelig. Det er også mulig å se på kinetikken i stoffet på grunn av den løftet av enkelt-celle-oppløsning. Fluorescein (GFP +) brukes til å avgrense svulster under operasjonen for å sikre maksimal reseksjon oppnås 26. Ved å injisere intravenøst mens avbildning er det mulig å demonstrere at avgrensningen oppstår ikke gjennom det aktive opptak av Fluorescein inn i tumorcellene selv, men i stedet ved hjelp av innhenting av medikamentet inn i stromal område med time, sett av den manglende co-lokalisering 10 min etter injeksjonen av den Fluorescein (figur 4D).
Samlet strategien kombinerer nye og eksisterende teknikker for å oppnå en unik eksperimentelle plattform, hvilket er fordelaktig i studiet av dynamiske cellulære interaksjoner. Denne strategien har vist seg å være en uvurderlig metode for å undersøke høy oppløsning encellede dynamiske utviklingen av BMDC, tumor og normal hjerne vascularity i respons på behandlingen, intracranially. Intravital bildebehandling kan gi en bedre forståelse av molekylære regulatorer av BMDC rekruttering, migrasjon og differensiering i intrakranielt hjernesvulst blodkar samt mange andre dynamiske prosesser tilpasningsdyktige til andre forskningsfelt. Hemmende putative faktorer som regulerer BMDC i kombinasjon med andre terapeutiske strategier kan hjelpe identifiseringen av den nøyaktige timing av kombinasjonsbehandlinger. Videre kan denne strategien tilpasses mange fremtidige projects utnytte ikke bare in vivo intravital flekker fargestoffer, men også små molekylære hemmere og nanopartikler som er fluorescently merket slik at forskerne å spore distribusjon og vandringsmønster for mer målrettede behandlingsformer samt se lengderetningen på sine kinetikk.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Avansert optisk mikroskopi Facility på prinsesse Margaret sykehus, spesielt James Jonkman for deres hjelp i det første oppsettet av kanaler på 2Photon mikroskop. Forfatterne ønsker å takke den Spatio-Temporal målretting og Amplification of Radiation Response (STTARR) programmet og dets tilknyttede virkemiddelapparatet. Vi takker Dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael og Dr.Andras Nagy for å forsyne VEGFTrap plasmider og for sine manuskript korreksjoner og tilbakemeldinger. Fortsatt støtte og diskusjon fra personalet på BTRC har vært uvurderlig, og vi ønsker å minnes Dr.Abhijit Guha for hans faglige innspill. Arbeidet ble finansiert av CIHR og NIH tilskudd.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |