Article de méthode

Accélération de diabète de type 1 chez la souris par induction transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques

DOI :

10.3791/50389

⸱

6 mai 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous fournissons une méthode reproductible pour induire un diabète de type 1 (DT1) chez la souris dans les deux semaines par le transfert adoptif de l'îlot spécifiques de l'antigène, CD4 + primaires des cellules T.

Résumé

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Les diabétiques (NOD) souris non obèses se développe spontanément diabète auto-immun après 12 semaines d'âge et est le modèle le plus largement étudié animal humain de type 1 du diabète (DT1). études sur le transfert des cellules dans des souris receveuses irradiées ont établi que les lymphocytes T jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du DT1 dans ce modèle. Nous décrivons ici une méthode simple pour rapidement induire une DT1 par transfert adoptif de purifié, CD4 + primaires des cellules T de souris NOD pré-diabétiques transgéniques pour le récepteur des cellules T îlot spécifique (TCR) BDC2.5 dans des souris receveuses NOD.SCID. Les principaux avantages de cette technique sont que l'isolement et le transfert adoptif de lymphocytes T diabétogéniques peut être complété dans le même jour, l'irradiation des bénéficiaires n'est pas nécessaire, et une forte incidence de diabète de type 1 est provoqué dans les 2 semaines après le transfert de cellules T. Ainsi, les études sur la pathogenèse et les interventions thérapeutiques dans le DT1 peuvent se réaliser à un rythme plus rapide que les méthodes qui s'appuient sur des populations de cellules T hétérogènes ou des clonesprovenant de souris NOD diabétiques.

Introduction

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La souris NOD développe un diabète auto-immune spontanément et a été largement utilisé comme modèle animal pour 1,2 DT1 humaine. Pathogenèse du DT1 chez les souris NOD est caractérisée par l'infiltration, à partir de 3-4 semaines d'âge, des îlots de Langerhans du pancréas par les cellules dendritiques et les macrophages, suivis par les cellules T et B. Cette phase de non-destructive péri-insulite conduit à une lente destruction progressive des cellules β pancréatiques productrices d'insuline, entraînant un diabète patent de 4-6 mois d'âge de 3 ans. Transfert de splénocytes 4,5, 6,7 ou CD4 + CD8 + 8,9 lymphocytes T de souris NOD diabétiques ont été montrés à la médiation du diabète chez la souris NOD immunodéprimés, ce qui indique que les cellules T îlots réactifs jouent un rôle central dans la pathogenèse du DT1. Selon les conditions expérimentales, le diabète développé dans les souris receveuses lentement, sur plusieurs semaines dans ces études. De même, les différents clones de lymphocytes T, dérivé par le temps et coûteuseculture de cellules T diabétogéniques, ont été signalés à la médiation diabète plusieurs semaines après transfert dans des souris receveuses 7,10. Avec la disponibilité de souris transgéniques exprimant des TCR dérivées de CD4 ou des clones de lymphocytes T CD8 diabétogéniques restriction, plusieurs laboratoires ont ensuite montré que les cellules T spléniques de ces souris ont été en mesure de transférer le diabète aux bénéficiaires 11-13. Plus précisément, BDC2.5 souris NOD sont transgéniques pour le TCR BDC2.5, qui est spécifique de la chromogranine A, une protéine dans les cellules bêta du pancréas 14-16. Le transfert de cellules en non activées rate entières ou fractionnées de diabétiques ou prédiabétiques ouvertement BDC2.5 souris transférés diabète de souris NOD néonatales ou immunodéficientes à des efficacités variables 11,17-19 vitro activé ou.

Nous décrivons une méthode simple qui utilise CD4 + purifiés transgéniques cellules T de pré-diabétiques BDC2.5 souris pour induire le DT1 dans les souris receveuses à haut rendement et Consistence. Un grand nombre d'îlots de Langerhans, naïfs CD4 + spécifiques d'un antigène des cellules T sont isolés à partir de ces souris par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour CD4 + CD62L + des cellules T exprimant la chaîne TCR transgénique Vβ4. Les cellules T transgéniques purifiés sont ensuite transférés dans des souris sans activation NOD.SCID, qui manquent T fonctionnelles et les lymphocytes B et sont sans diabète insulite et 20. Les souris receveuses sont surveillés pour des concentrations élevées de glucose dans l'urine indiquant DT1, qui se développe rapidement dans les deux semaines après le transfert de cellules T.

Contrairement à d'autres méthodes qui transfèrent des cellules T diabétogéniques avec des spécificités hétérogènes, notre protocole utilise triées par FACS cellules T CD4 + qui expriment presque exclusivement le diabetogenic BDC2.5 TCR. En raison de leur homogénéité, seul un petit nombre de cellules T transférées (~ 1x10 6 cellules / souris) sont nécessaires pour le développement du DT1 rapide dans les 2 semaines à 100% d'incidence. Un autre avantage de notre protocole est que irradiation des souris receveuses n'est pas nécessaire que ce soit pour d'autres méthodes. Une limitation potentielle de cette méthode est qu'elle ne permet pas à l'enquête sur la contribution des deux CD4 et CD8 sous-ensembles de cellules T CD8 ou spécifiquement les lymphocytes T dans le diabète.

Le protocole décrit sera utile pour étudier le développement rapide DT1, médiée par les naïfs CD4 monospécifiques cellules T, ainsi que des stratégies thérapeutiques pour intervenir dans homing des cellules Th spécifiques de l'antigène îlots à l'organe cible.

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Protocole

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1. Isolement des cellules T de la rate et des ganglions lymphatiques de souris BDC2.5

  1. Utilisez 6 semaines d'âge pré-diabétiques féminins BDC2.5 souris en tant que donneurs de cellules CD4 + lymphocytes T diabétogéniques. Souris doivent être sans diabète telle que déterminée par la mesure de la glycosurie (voir ci-dessous).
  2. Euthanasier chaque souris en utilisant le CO 2 asphyxie et enlever la rate, axillaires et brachial ganglions lymphatiques dans des conditions stériles. Pour enlever la rate, faire tremper la fourrure à l'éthanol 70%, puis les couper et retirer la peau. La rate est visible en tant qu'organe rouge foncé sur le côté gauche de la souris. Faire une incision de 1 pouce dans le péritoine à l'aide des petits ciseaux et de saisir la rate doucement dans le centre d'une paire de petites pinces. Couper délicatement le tissu conjonctif et la graisse attachée autant que possible et enlever la rate.
  3. Recueillir les rates et les ganglions lymphatiques dans 10 ml moyen de Dulbecco's-Modified Eagle (DMEM) dans un tube conique de 15 ml sur la glace.
  4. Préparer une suspension cellulaire unique en utilisant èmee fin d'une seringue de 10 ml piston stérile pour appuyer doucement sur les organes lymphoïdes à travers 70 filtres cellulaires um (une rate par crépine et 4-6 ganglions lymphatiques par filtre) dans le même tube conique de 50 ml.

Pendant le processus, rincer chaque crépine avec 1 ml de DMEM plusieurs fois afin de maximiser la récupération des cellules de la crépine.

  1. Transférer les cellules sont prélevées du tube conique de 50 ml dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300-400 g pendant 7 min à température ambiante.
  2. Pour lyse des globules rouges, éliminer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 5 ml Le chlorure de potassium-(ACK) tampon (pH 7,2), et incuber la suspension ACK-cellule à température ambiante pendant 5 min.
  3. Ajouter 10 ml de DMEM à la suspension ACK-cellules et centrifuger le tube comme ci-dessus. Laver le culot cellulaire une fois dans 10 ml de DMEM.

2. Le tri cellulaire activé par fluorescence des cellules CD4 + T Cells diabétogéniques de BDC2.5 Souris

  1. Re-suspendre les cellules dans 5 ml FACS scontenant un tampon et de compter le nombre de cellules viables (en utilisant un microscope à contraste de phase et un hémocytomètre) par colorant bleu trypan exclusion.
  2. En utilisant un tampon FACS, régler le volume de la suspension cellulaire à 5 x 10 7 cellules / ml. Retirer ~ 1 x 10 6 cellules par le contrôle de la coloration (1 NO, 3 taches simples taches). Colorer l'échantillon de CD4 transgéniques non activés cellules T avec des anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) et anti-CD62L (PE) anticorps monoclonaux (mAb) dans un tube de 15 ml. Effectuer coloration des cellules en utilisant les concentrations mAb suggérés par le fabricant pour 20-30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  3. Laver l'échantillon et des contrôles simples tache avec du tampon FACS à> 3X le volume de la réaction de coloration. Centrifuger le tube à 300-400 xg, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS (1-2 x 10 7 cellules / ml pour le tri des échantillons et 300 pi pour les contrôles tache unique) et magasins sur la glace jusqu'à la prochaine étape.
  4. Passer l'échantillon de cellules à travers une cellule de 35 umTube cap passoire pour enlever des amas de cellules. Trier les échantillons de CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellules sur un trieur de cellules avec un opérateur qualifié. Recueillir les cellules triées dans 3 ml DMEM dans un tube de 15 ml. Laisser 2,5-3 h, y compris la configuration, pour trier 1,5 x 10 8 cellules (le nombre approximatif de cellules obtenues à partir de 3 souris donneuses) à un taux de tri de 2 x 4 au total 10 événements / sec. Attendez-vous à ~ 2,5 x 10 6 cellules CD4 transgéniques non activés + T cellules par souris après tri cellulaire.
  5. Notez le nombre absolu de cellules triées à la fin de la sorte et centrifuger les pendant 7 min à 300-400 g. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules (2 x 10 6 cellules / ml) dans stérile tampon phosphate salin (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + libre) pour le transfert de cellules T adoptive.

3. Le transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques de BDC2.5 Souris

  1. Utiliser une seringue de 1 ml et une ½ aiguille de calibre 18-1, doucement remettre en suspension les cellules CD4 + purifiées par FACSLymphocytes T et charger la seringue de 1 ml. En préparation pour injection, remplacer le 18-1 ½ aiguille de la jauge avec un 27 ½ aiguille de la jauge.
  2. Expose 6-8 semaines, âgé de souris receveuses NOD.SCID femmes à une lampe chauffante jusqu'à ce qu'ils ont un comportement de toilettage.
  3. Restrain souris receveuses dans un dispositif de retenue et essuyer leur queue avec 70% (v / v) d'éthanol pour désinfecter le site d'injection.
  4. Injecter 1-2 x 10 6 FACS __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ cellules / souris triés (dans un maximum de 500 pi de PBS) dans l'une des veines de la queue latérales.

Ne forcez pas le piston. Si l'aiguille se trouve de manière appropriée dans la veine, l'injection aura lieu pratiquement sans résistance.

4. Suivi des souris receveuses pour Hyperglycémie et diabète de type 1

  1. Commençant cinq jours après le transfert de cellules T, les souris receveuses NOD.SCID sont surveillées quotidiennement pour le glucose urinaire élevée en utilisant des bandelettes réactives (Bayer Diastix) selon les instructions du fabricant. Souris avec deux urin consécutivelectures de glucose E> 250 mg / dl sont considérés comme diabétique.

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Résultats

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Nos résultats montrent l'isolement des cellules transgéniques exprimant CD62L BDC2.5, ce qui est essentiel pour les cellules T à la maison vers les organes lymphoïdes secondaires comme les ganglions lymphatiques pancréatiques. Nos résultats démontrent en outre la capacité puissante de cette population de cellules T monospécifiques de transférer rapidement et efficacement à DT1 souris receveuses NOD.SCID.

Isolement de CD4 diabétogéniques cellules T de souris BDC2.5 est montré à la...

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Discussion

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DT1 peut être induite chez la souris bénéficiaires à des efficacités variables par transfert adoptif de cellules de rate entières ou des sous-ensembles de lymphocytes T de souris NOD diabétiques ou les souris transgéniques pour le TCR provenant de clones de lymphocytes T diabétogéniques. Nous rapportons ici une méthode reproductible pour induire le DT1 dans les souris receveuses dans les deux semaines à 100% d'incidence en transférant FACS purifiés CD62L + BDC2.5 CD4 + lymphocytes T transgéniques dans des souris NOD...

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Déclarations de divulgation

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Toutes les souris ont été logées à la Penn State College of Medicine établissement exempt d'agents pathogènes (SPF) spécifique en conformité avec les lignes directrices de la Penn State Institutional Animal Care et utiliser Comité.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Nous remercions les Drs. Robert Bonneau et Neil Christensen pour leurs commentaires utiles.

Ce travail a été soutenu par la Pennsylvania State University College de fonds de la médecine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris NOD transgéniques BDC 2.5 TCR (NOD. Cg-Tg(Tcr&alpha ; BDC 2.5, Tcrβ ; BDC 2.5)JAX004460
NOD. Les souris SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
Tubes coniques de 15 mlFalcon352095
tubes coniques de 50 mlFalcon352070
Pince à épiler chirurgicale stérile Ciseaux
stériles
Ciseaux stériles
70 &mu ; crépines à cellules mFisher Scientific22363548
35 &mu ; Tubes de capuchon de crépine cellulaireM Biosciences352235
Tampon0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 en dH2O
BD FACSFlowTM FluideBD Biosciences342003
Tamponde coloration FACSPBS, 0,2 mM EDTA, 0,5 % BSA/FCS, filtre stérilisé
Microscope à contraste de phase Trypan
blue
Hémocytomètre
Anti-CD4 (APC) mAb Biolegend1005616clone RM4-5
Anti-TCR Vβ ; 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365clone KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151clone MEL-14
Trieur de cellulesBD Biosciencese.g. BD FACSAria III
Lampe
Souris ressunder
1 ml seringuesBecton Dickinson309602
Aiguilles de calibre 18-1 et 12 (stériles)Becton Dickinson305196
Aiguilles de calibre 27 et 12 (stériles)BectonDickinson305109
à petite paireà grande paire chlorure-potassium ammonium (ACK) de gaine chauffante

Références

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Mots-clés

Transfert adoptif de lymphocytes TPurification des lymphocytes T CD4Souris NOD SCIDSouris transg niques BDC2 5Protocole de tri cellulaireInjection dans la veine caudaleSuivi de la glyc mie urinairePr l vement des ganglions lymphatiquesIsolation de la rate

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