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Article de méthode

In situ Transverse lambeau de grand droit: un modèle de rat de myocutané ischémie reperfusion

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DOI :

10.3791/50473

⸱

8 juin 2013

 ,  , 
1Department of Surgery, Royal Infirmary of Edinburgh, 2Department of Nephrology, Royal Infirmary of Edinburgh

Dans cet article

Résumé

Transfert de tissu libre est largement utilisé dans la chirurgie reconstructive pour restaurer la forme et la fonction après résection oncologique et les traumatismes. Préconditionnement ce tissu avant la chirurgie peut améliorer les résultats. Cet article décrit une In situ Transversale lambeau de grand droit (TRAM) chez le rat comme un moyen de tester des stratégies de préconditionnement.

Résumé

Transfert de tissu libre est l'étalon-or de la chirurgie reconstructive pour réparer les défauts complexes ne se prêtent pas à des options locales ou celles nécessitant tissu composite. la lésion de reperfusion d'ischémie (IRI) est une cause connue d'une défaillance partielle du rabat libre et n'a pas de traitement efficace. L'établissement d'un modèle de laboratoire de cette blessure peut s'avérer coûteuse à la fois financièrement comme les grands mammifères sont classiquement utilisés et le savoir-faire requis par la difficulté technique de ces procédures nécessite généralement l'emploi d'un microsurgeon expérimenté. Cette publication et vidéo montrent l'utilisation efficace d'un modèle de l'IRI chez les rats qui ne nécessitent pas d'expertise de microchirurgie. Cette procédure est un modèle in situ d'un musculo-cutané abdominal transversal (TRAM) de rabat où pinces atraumatiques sont utilisés pour reproduire la lésion d'ischémie-reperfusion associée à ce type de chirurgie. Un scanner laser Doppler Imaging (LDI) est utilisé pour évaluer la perfusion du lambeau et le traitement de l'image software, Image J pour évaluer le pourcentage de survie de la peau de la zone comme un critère d'évaluation primaire de blessure.

Introduction

L'objectif de ce protocole est de démontrer un modèle fiable et reproductible de la lésions d'ischémie-reperfusion observé dans le transfert de tissu libre pour permettre aux stratégies d'intervention pour être étudiés.

Transfert de tissu libre se définit comme le détachement vasculaire d'un bloc isolé de tissus suivie par autogreffe de ce tissu avec anastomose des vaisseaux sectionnés du rabat sur des navires indigènes sur le site destinataire. La procédure est connue comme FTT et le tissu en cours de transfert appelée lambeau libre.

Transfert de tissu libre est la méthode de référence pour la correction des défauts, composites complexes où les options locales ne conviennent pas ou n'est pas disponible. 1-4 blessure d'ischémie-reperfusion (IRI) est inévitable dans le transfert de tissu libre, contribue à battre échec 5,6 et n'a pas un traitement efficace. Le caractère électif des chirurgies lambeau libre permet l'administration de pharagents CAL pour condition préalable contre IRI.

IRI résulte une baisse de débit à travers la microcirculation par l'activation endothéliale et le dysfonctionnement métabolique, 7 augmentation de la perméabilité capillaire et un oedème ultérieure interstitielle 7, afflux de cellules inflammatoires, 8 libération de médiateurs inflammatoires, les espèces réactives de l'oxygène 9 et dépôts de complément. 10 Ce processus complexe de l'hypoxie et une lésion de reperfusion ultérieure conduit finalement à la mort cellulaire. Un modèle de myocutané IRI permet l'efficacité des stratégies de préconditionnement sur les résultats cliniques à évaluer. Des travaux récents ont validé l'utilisation de modèles animaux d'études IRI comme un substitut de l'IRI humaine en comparant les changements moléculaires observés chez les sujets humains et les données animales existantes 10,11.

Le rat transverse rectus abdominis musculo-cutané (TRAM) lambeau a été décrite pour la première en 1987 en allemand et 12 en 199313 en anglais. Ce modèle a gagné une grande popularité 13-25 comme un modèle robuste pas cher pour étudier différentes stratégies pour réduire IRI associée avec transfert de tissu libre. 14,17-22 La majorité de ces études ont été conçues comme volets de TRAM unipedicled basé sur la profondeur, inférieure, . épigastrique pédicule 15-18,20-22 La comparaison des données de ces études est compliquée par l'utilisation de différentes îles cutanées moyenne (10,5 à 30 cm 2) et différentes longueurs de suivi post-opératoire (2 - 10 jours). Le pourcentage zone rabat nécrose totale moyenne dans le bras de contrôle de ces études est de 69 ± 6,2% (moyenne ± SEM). Il convient de noter que ces six documents emploient tout le muscle droit de l'abdomen comme support pour le pédicule vasculaire mais n'exposent pas, diviser et microanastomose ou serrer les vaisseaux. Zhang et al. 23 ont décrit un vrai, sans lambeau TRAM de rat basé sur les vaisseaux épigastriques supérieurs dans lequel le ftours ont été soulevées, des vaisseaux divisés et le lambeau musculocutané transférés et microanastomosed aux navires de l'aine. Cette technique difficile requis le microanastomosis de 0,45 - mm vaisseaux de calibre 0.5. Seuls quinze ont été effectués et de ceux-ci 67% ont survécu. 23 Le modèle décrit par Zhang et al. 23 est un excellent modèle pour le lambeau TRAM libre arbitre humain car il reflète vraiment la blessure subie au cours de FTT. Les autres modèles publiés d'un lambeau TRAM de rat reflètent plus fidèlement les blessures subies lors d'une TRAM pédiculé humaine, mais ne reflètent pas fidèlement l'IRI comme ces rabat à ne pas se soumettre à une période ischémique suivi d'une reperfusion comme le pédicule n'est jamais serré ou divisée et microanastomosis effectuée. Ce protocole et vidéo décrivent un nouveau modèle de transfert de tissu libre en utilisant le TRAM de rat dans lequel l'IRI est répliqué à l'aide microclamps. Cet article reproduit plus fidèlement IRI que les prédécesseurs de TRAM pédiculaires mais est techniquement plus facile que Performing le microanastomosis. Microclamps ont été largement utilisés par les chercheurs de transplantation de recréer IRI associée à une transplantation d'organe solide; 26-33 cependant, c'est la première fois qu'il a été décrit dans le lambeau TRAM de rat.

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Protocole

Toute chirurgie est effectuée conformément aux lignes directrices énoncées par le Bureau d'accueil du Royaume-Uni et l'Université du Département des services vétérinaires d'Édimbourg.

1. Mise en place de procédure chirurgicale notes

  1. Changement dans scrubs propres chirurgicales, robe, chapeau gommage et un masque. Nettoyez toutes les surfaces de la salle d'opération, y compris l'équipement avec 2% de chlorhexidine à 70% d'alcool isopropylique.
  2. Avant la chirurgie, l'autoclave toutes les fournitures et les instruments qui seront utilisés dans la procédure chirurgicale. Emballages stériles par opération devraient inclure: 3 rideaux, de la gaze, des applicateurs de bout de coton, feuilles de silicone et les instruments chirurgicaux, voir le tableau de matériel chirurgical et outils spécifiques et la Figure 1. Peser le rat et de mesurer le volume approprié de la buprénorphine (0,04 mg / kg) doit être administré par voie sous cutanée 1 heure avant la fin de la procédure. Disposez; 3 x 1 ml seringues pour administration sous-cutanée fluide pendant surgEry, 2 x 6-0 sutures Vicryl, 1 x 5-0 sutures ETHILON, un marqueur stérile avec une règle et un scalpel jetable 10 lames, 4 - 5 paires de gants stériles et une unité de cautérisation à main.
  3. Lieu 4 x 10 ml stérile, 0,9% flacons salines dans un bain d'eau chauffée à 37 ° C. Il sera utilisé pour le remplacement du liquide sous-cutanée (1 ml / kg / h) et de rincer le site chirurgical. Mettre en place la couverture homéothermes, sonde rectale, lampe chauffante, microscope opératoire et anesthésique plate-forme. Allumez le laser et son logiciel, set-up rig autre anesthésique et placer un coussin chauffant sous le tapis noir sur lequel l'animal posera lors de l'analyse.
  4. Utilisez masculins, Lewis mâles pesant 250-300 g. Maison rats pendant 7 jours avec de la nourriture et de l'eau ad libitum avec 12 HR cycles lumière-obscurité avant toute intervention chirurgicale est effectuée.

2. Anesthésie et de préparation de la peau

  1. Placez le rat dans la chambre de l'induction de l'anesthésie plate-forme et d'administrer 4% d'isoflurane avec 1L/min O 2 pour2-3 min pour induire une anesthésie. Retirez le rat anesthésié de la chambre et le placer en position couchée sur le, tapis propre et chauffée. Maintenir l'isoflurane à 1,5% en utilisant un cône de nez. Enduire lacrilube ou similaire pour empêcher l'abrasion cornéenne au cours de la procédure. Effectuer un test de pincement pied-pad pour s'assurer que l'animal est correctement anesthésié avant de poursuivre. Répétez ce dernier test avant chaque étape importante dans la procédure et ajuster la concentration anesthésique par inhalation en conséquence.
  2. Étroitement raser la abdominale antérieure en utilisant un rasoir électrique de sorte que la totalité de la surface abdominale est exposée. Appliquez la crème dépilatoire pendant la durée recommandée par le fournisseur. Retirez la crème et rincer soigneusement la peau avec une solution saline stérile chauffée pour enlever toutes les traces de la crème. Appliquer 2% de chlorhexidine à 70% d'alcool isopropylique à la peau et laisser sécher avant de continuer. Il s'agit de la préparation de la peau norme dans notre unité basée sur les données actuelles de l'infection du site opératoire. 34 Veuillez discuss avec votre département vétérinaire ce qui est la procédure normale dans votre appareil avant l'élection d'un protocole de préparation de la peau.
  3. Placer 2 rideaux de chaque côté du rat et de prendre soin de les garder stérile. Mettez des gants stériles et avec l'aide d'un assistant d'ouvrir les emballages stériles. Placez tous les instruments sur un drap et les sutures, les gazes, les applicateurs de coton, des bâches en silicone et un stylo marqueur stérile avec la règle de l'autre.
  4. Identifier la ligne médiane à l'aide xiphisternum et la queue comme points de référence. Marquez la ligne médiane. Mesurer 0,8 cm en dessous du xiphisternum et marquer ce point. Tracez une ligne perpendiculaire à la ligne médiane à partir de ce point. Prendre la ligne médiane comme le centre de la marque de rabat sur 1 cm et 2 cm à gauche et à droite de la ligne médiane. Dessinez des lignes verticales parallèles à la ligne médiane à partir des points. Mesurez 4 cm en dessous de la ligne horizontale originale et d'en tirer un autre parallèle. Suite à ces instructions une x 4 cm volet 4 divisé en 4 bandes égales est délimitée(Voir Figure 2).

3. Laser Doppler Imaging

  1. Déplacez doucement le rat au cône de nez de la deuxième plate-forme anesthésique au scanner LDI. Continuer anesthésie à 1,5% d'isoflurane, 1L/min O 2. Allumez le laser et suivez les instructions du fabricant pour lancer la numérisation. Après avoir enregistré le fichier numérisé retourner le rat à la première plate-forme et ré-insérer la sonde rectale de la couverture homeothermic utilisant paraffine blanche molle comme un lubrifiant.

. 4 In situ TRAM - Modèle musculo-cutané de l'IRI

  1. Re-mains broussailles et mettre des gants stériles frais. Découper un cercle d'un diamètre de 5 cm et dans le centre de la housse stérile restante et placer cet exposé sur l'abdomen pour créer un champ stérile drapée.
  2. Faire une incision le long du bord latéral gauche marqué (figure 3A et B). Obtenir l'hémostase. Faire des incisions similaires le long des lignes horizontalesà la gauche de la ligne médiane. Obtenir l'hémostase.
  3. La graisse recouvrant la gaine du muscle droit inférieur gauche doit être visible. En utilisant des pinces et ciseaux iris fines soigneusement passer sous cette graisse. Prenez soin de ne pas endommager les perforateurs à venir grâce à la gauche, la gaine du muscle droit antérieur. Le plan ouvert par cette dissection est que, immédiatement au-dessus de l'aponévrose de la paroi abdominale antérieure. Continuer dissection dans ce plan autour des marges délimitées. Dans la fosse iliaque gauche se trouve la grande circonflexe iliaque superficielle bateaux-ci peuvent être attachés ou cautériser. Puis étendre la dissection dedans avec prudence et seulement dans la mesure où la marge latérale du muscle grand droit gauche. Il ya un changement de couleur évidente à ce stade du rose au blanc près (figure 3C). Irriguer soigneusement la zone avec une solution saline stérile et vérifier que l'hémostase a été réalisée avant la mise gaze humide sur la région.
  4. Répétez la procédure sur le côté opposé, mais cette fois étendre to la ligne blanche (ligne médiane). Prenez soin d'identifier et de cautériser tous les perforantes musculo qui se posent dans le centre de la droite muscle droit de l'abdomen (figure 3D). Si cela n'est pas fait correctement, il peut entraîner un hématome post-opératoire et des résultats erronés. De même atteindre l'hémostase, irriguer et placer la gaze humide sur le rabat soulevé.
  5. Retour à la marge inférieure du muscle droit antérieur gauche (figure 3E et F). Cautériser le perforateur le plus inférieur vu. Passez à couper une petite fenêtre (env. 0,6 cm x 0,6 cm) dans la gaine du muscle droit antérieur utilisant microciseaux et pointue courbée forceps GRAEFFE. Blunt disséquer lentement sur le bord latéral du muscle jusqu'à ce que le muscle s'amincit mais avant la gaine postérieure est violée. Faites ensuite pivoter la pince et émousser disséquer dedans jusqu'à ce que le ventre du muscle est au-dessus le bord incurvé de la pince et les conseils sont gratuits au bord médial. Nourrir approximatively 6 cm de 5-0 Ethilon dans les mâchoires de la pince et attacher la gaine du muscle droit inférieur. À l'issue de cette étape, le lambeau musculo-cutané est isolé sur un navire-dominant les vaisseaux épigastriques supérieurs profondes. Couvrir avec une gaze humide.
  6. Couper la feuille de silicone dans ovales avec des coins lisses (figure 3G). Ceux-ci devraient être assez grand pour couvrir la majeure partie de la zone exposée sous les parties fasciocutanés du volet. Cependant, des précautions doivent être prises pour veiller à ce que le bord de la peau peut être fermé sans aucune tension et la courbe médiane de l'ovale peut être jumelé arrière pour l'empêcher flux atteinte par les perforateurs restants. Ceux-ci sont ensuite suturés en place avec 6-0 Vicryl (figure 3H). Couvrir avec de la gaze humide.
  7. En utilisant de simples interrompu de la cheville sur «5-0 ETHILON sutures le rabat pour réduire la chaleur et la perte d'eau (figure 3I). Couvrir avec une gaze humide.
  8. Elargir la plaie supérieurement à la gauche de l'xiphisternum (figure 3I). Suture à ce quadrant supérieur gauche pour améliorer le champ de vision.
  9. Coupez le gras qui les recouvre de révéler le supérieur, à gauche, la gaine du muscle droit antérieur. Coupez un petit (0,6 cm x 0,6 cm) fenêtre dans cette gaine (Figure 3J). Etendre la plaie dedans jusqu'à ce qu'un changement dans la trajectoire de la fibre musculaire de la verticale à oblique et la cohérence du serrées aux fibrilles libres est vu.
  10. Insérez les pinces courbes soigneusement entre ces deux muscles et ouvrir un plan de dissection. Découpez soigneusement le bas seulement dans la mesure où la surface supérieure de ces pinces courbes de coupe à travers le ventre du muscle droit de l'abdomen gauche pour faire apparaître le sous-jacent profonde, artère épigastrique supérieure et la veine (figure 3K).
  11. Utilisant des micro-instruments et haute puissance sur le microscope opératoire, séparer soigneusement l'artère et la veine et enlever tout le gras environnante.
  12. Appliquer pinces atraumatiques Acland à la unertery et la veine (B-1, de type "V") et lancer le chronomètre compte à rebours de la période ischémique de 30 min. Irriguer le pédicule serré et couvrir avec de la gaze. Nous n'avons pas employons dilatateurs des vaisseaux tels que le vérapamil ou pabavarine mais devrions spasme des vaisseaux être un problème, ces médicaments doivent être pris en considération.
  13. Administrer la buprénorphine (0,04 mg / kg) et chauffée, une solution saline stérile (1 ml / kg / h).
  14. À partir de l'angle supérieur gauche, suturer le lambeau en place avec 6-0 sutures sous-cutanées Vicryl arrêt et ligaturer au xiphisternum.
  15. Lorsque le temps min 30 ischémique est terminée, retirez avec précaution les pinces et irriguer le pédicule avec une solution saline chauffée. Vérifiez que le débit a été rétabli. Veuillez noter que cette fois-ischémique a été stipulé par le Royaume-Uni Accueil autorité de bureau. Les chercheurs travaillant dans d'autres autorités pourraient être en mesure de prolonger ce délai. L'extension de la période d'ischémie mènera probablement à des résultats cliniques pire.
  16. Suturer les bords coupés du muscle droit en place avec 6-0 Vicryl.Veillez à ne pas appliquer trop de tension car cela peut conduire à la torsion des vaisseaux.
  17. Remplissez la suture sous-cutanée en prenant soin d'enterrer tous les noeuds sous la peau (Figure 3K).
  18. Nettoyer la surface de la plaie et laissez sécher. Redessiner les zones sur le rabat.
  19. Re-numériser l'animal pour obtenir une image postopératoire.
  20. Réappliquer lacrilube aux yeux et la place de l'animal dans un incubateur chauffé (37 ° C) pendant 1 heure pour récupérer avant de revenir à l'unité d'élevage.

Les étapes critiques dans le protocole

L'essentiel de la procédure est d'identifier les profondes vaisseaux épigastriques, de qualité supérieure. Ceci est clairement démontré dans le film qui l'accompagne. En bref, une fenêtre est découpée dans la gaine du muscle droit antérieur pour exposer les fibres musculaires sous-jacentes qui seront s'étendant longitudinalement. En prolongeant la dissection superficielle de la gaine du muscle droit antérieur en dedans un changement de trajectoire de la fibre musculaire est observée fROM longitudinal pour oblique. Insérez émousser terminés, courbes, GRAEFFE forceps (ou similaire) à l'intersection de ces deux faisceaux de fibres musculaires. Blunt disséquer latéralement. Couper vers le bas, au moyen de micro ciseaux, sur la surface supérieure de la pince incurvés détenus dans ce plan entre les faisceaux de fibres musculaires. Le retrait de la Graeffe Pince la profondeur, artère épigastrique supérieure et la veine sera observée au milieu du corps du muscle droit de l'abdomen. Décoller la graisse recouvrant les navires utilisant des micro-instruments et d'appliquer les pinces.

Les portions fasciocutanés du lambeau TRAM de rat sont suffisamment minces pour permettre au rabat de prendre comme une greffe de peau sur toute son épaisseur. Pour éviter cela et faire en sorte que c'est un vrai modèle de l'IRI une mince feuille de silicium souple est placée sous les portions fasciocutanés du rabat. 35 Cette mesure a été adoptée par d'autres chercheurs qui entreprennent des modèles de TRAM de rat. 17,21,25

Rats mâchent throunoeuds gh alors assurez-vous que toutes les sutures sont sous-cutanée et tous les noeuds sont enterrés. Dans l'exercice méticuleux autocannabilism de suture de volets présentés par d'autres chercheurs peuvent être évités. 24

Suite à l'administration de la buprénorphine réduire anesthésie de maintenance à 1% d'isoflurane (1L/min O 2).

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Résultats

des modèles de rats sont plus économiques que les grands modèles animaux, 36 sont résistantes aux maladies dans la nature et peuvent être manipulées génétiquement. Vrac animaux écorchés, comme les rongeurs, ont été pensé pour avoir un arrangement différent de l'approvisionnement sanguin cutané par rapport aux animaux écorchés fixes tels que les humains et les porcs. En vrac animaux à peau, la peau est alimenté principalement par des vaisseaux sanguins cutanés directs en passant par la graisse sous-cutanée...

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Discussion

Modifications et le dépannage

Le protocole présenté ici reproduit l'IRI vu dans le transfert de tissu libre dans un système expérimental permettant de mieux comprendre ce processus et fournit un moyen de rechercher les moyens d'améliorer l'IRI et améliorer les résultats. Cela pourrait facilement être modifié pour produire une blessure plus grave si elle était fondée sur le non-dominante, profonde, inférieure pédicule épigastrique ou si le temps d'ischémie ont été augmentés.

...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons pas d'autres informations.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Medical Research Council subvention G1000299.

L'auteur correspondant tient à remercier Gary Borthwick, Université d'Edimbourg, pour assister pendant la chirurgie.

Les auteurs tiennent à remercier conseils de Helen Douglas et Iain Mackay et de nous permettre d'observer leur épigastrique inférieure profonde (DIEP) de la procédure de rabat (Canniesburn Unité de Chirurgie Plastique, Glasgow Royal Infirmary, 84 Castle Street, Glasgow G4 0SF, Royaume-Uni).

Les auteurs tiennent également à remercier Gary Blackie à l'Université d'Edimbourg pour son aide dans la production de la vidéo pour cet article.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
d’imagerie laser Doppler Moor LD12http://gb.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
complet de couverture homéothermique avec sonde flexible. Petit. 230 VAC, 50 Hz507221Fwww.harvardapparatus.com
Pince Graeffe pointes de 0,8 mm incurvées11052-102, http://www.finescience.de
Acland clamps00398 VB-1 ’ ; V’ ; Pinces à motif utilisées à la fois sur l’artère et la veine. http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
ApplicateurCAF-4http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
Unité726067www.harvardapparatus.com
Dilatateurs à micro-récipients 11 cm 0,3 mm pointes 00124D-5a.2http://www.merciansurgical.com
Bijouterie Pince 11cm angulée 00109JFA-5bhttp://www.merciansurgical.com
Pince Bijoutière 11 cm droite 00108JF-5http://www.merciansurgical.com
Acland Pinces Simples B-1V (Paire)396http://www.merciansurgical.com
Micro Ciseaux Manches Ronds 15 cm Droit67http://www.merciansurgical.com
Ciseaux à Iris 11.5 cm Courbes EASY-CUTEA7613-11http://www.merciansurgical.com
Mayo Ciseaux 14 cm Lames Chanfreinées droites EASY-CUTEA7652-14http://www.merciansurgical.com
Derf Porte-aiguilles 12 cm TC703DE12http://www.merciansurgical.com
Ethilon 5-0W1618http://www.farlamedical.co.uk/
Vicryl rapide 6-0W9913http://www.millermedicalsupplies.com/
Instrapac - Adson Pince à dents (Extra Fine)7973http://www.millermedicalsupplies.com/
Castroviejo porte-aiguilles12565-14http://s-and-t.ne
Lampechauffantehttp://www.chicken-house.co.uk
Feuille de silicone 0,3 mm translucidehttp://www.silex.co.uk/
Image J softwarehttp://rsbweb.nih.gov/ij/
Zeiss OPMI picohttp://www.zeiss.co.uk/
Microscope
Vet tech solution isofluorane righttp://www.vet-tech.co.uk/
Vet tech solution isofluorane righttp://www.vet-tech.co.uk/
Scanner Système à pince de cautérisation Gemini Micro Micro opératoire

Références

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