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Biology

Formalin से प्रोटिओमिक नमूना तैयार आयल एम्बेडेड ऊतक फिक्स्ड और

Published: September 2, 2013 doi: 10.3791/50589
Automatic Translation
1
1Department of Proteomics and Signal Transduction, Max Planck Institute of Biochemistry

Summary

अभिलेखीय formalin तय की और (FFPE) एम्बेडेड आयल नैदानिक ​​नमूनों की बीमारियों की जांच के लिए मूल्यवान सामग्री हैं. यहाँ हम microdissected FFPE ऊतक की गहराई प्रोटिओमिक विश्लेषण की अनुमति एक नमूना तैयार कार्यप्रवाह प्रदर्शित करता है.

Abstract

संरक्षित नैदानिक ​​सामग्री मानव विकारों का प्रोटिओमिक जांच के लिए एक अनूठा स्रोत है. यहाँ हम formalin के बड़े पैमाने पर मात्रात्मक विश्लेषण तय की और आयल एम्बेडेड (FFPE) ऊतक की अनुमति एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रक्रिया चार अलग चरणों शामिल हैं. पहले एक FFPE सामग्री और ब्याज की कोशिकाओं की microdissection से वर्गों की तैयारी है. दूसरे चरण में अलग कक्षों lysed और 'फिल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयार' (FASP) तकनीक का उपयोग कर कार्रवाई की जाती है. इस चरण में, प्रोटीन नमूना सेल के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों से समाप्त हो रहे हैं और endoproteinase lysC और trypsin का उपयोग दो चरणों में पच जाता है.

प्रत्येक पाचन के बाद, पेप्टाइड्स अलग भागों में एकत्र कर रहे हैं और उनकी सामग्री एक बेहद संवेदनशील प्रतिदीप्ति माप का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. अंत में, पेप्टाइड्स 'पिपेट की नोक' microcolumns पर fractionated रहे हैं. LysC पेप्टाइड्स जबकि 4 भागों में अलग हो रहे हैं tryptic पीईptides 2 भागों में विभाजित हैं. इस तरह से तैयार नमूने 10,000 प्रोटीन की गहराई तक सामग्री की मात्रा मिनट से proteomes के विश्लेषण की अनुमति. इस प्रकार, वर्णित कार्यप्रवाह संभावित बायोमार्कर और दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए और साथ ही एक प्रणाली में व्यापक फैशन में बीमारियों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है.

Introduction

Paraformaldehyde के साथ फिक्सिंग और आयल (FFPE) में embedding संरक्षण और नैदानिक ​​ऊतक सामग्री की pathomorphologic जांच के लिए मानक पद्धति है. संरक्षित ऊतक के माइक्रोस्कोपी रोग से संबंधित morphological परिवर्तन की पहचान, और रोग से संबंधित एंटीजन की घटना का पता लगाने और स्कोरिंग की अनुमति देता है. FFPE नमूने के आम तौर पर केवल एक छोटा सा हिस्सा इन विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाता है, नैदानिक ​​सामग्री की बड़ी मात्रा में संग्रहीत रहते हैं और पढ़ाई के अन्य प्रकारों में शोषण किया जा सकता है.

हाल के एक दशक के दौरान जीवन विज्ञान में अनुसंधान शक्तिशाली प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी से मजबूत हुआ है. इस प्रौद्योगिकी की अनुमति देता है जटिल प्रोटीन मिश्रण में प्रोटीन के हजारों की पहचान और quantitation. प्रौद्योगिकी की एक महत्वपूर्ण विशेषता बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए सामग्री का केवल मिनट मात्रा की जरूरत है कि है. हाल के प्रोटिओमिक पढ़ाई प्रोटीन लगभग COMP के पैमाने पर अध्ययन किया जा सकता है कि प्रदर्शनlete 1, 2 proteomes. जांच की इस प्रकार की कोशिकाओं की संरचना और रोगों में विषम के स्तर पर होने वाली प्रोटीन के समूहों की पहचान करने में प्रणाली विस्तृत अंतर्दृष्टि सक्षम बनाता है. इन अध्ययनों बड़े बड़े पैमाने पर spectrometric क्षमताओं की आवश्यकता है, जबकि हाल ही में काम पहचान के समान हद माप 3 के एक ही दिन के भीतर प्राप्त किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है.

अपेक्षाकृत कम नमूना राशि की आवश्यकता है और संरक्षित नैदानिक ​​नमूनों की व्यापक उपलब्धता FFPE सामग्री की प्रोटिओमिक अन्वेषण (एक समीक्षा 4 देखने के लिए) को सक्षम करने के तरीकों को विकसित करने के लिए हमें और दूसरों के लिए परीक्षा. हम तय ऊतक 5 से प्रोटीन की मात्रात्मक निकासी की अनुमति एक प्रोटोकॉल विकसित किया है एक गर्मी उपचार के तहत नि: संक्रामक निर्धारण के उलटने का लाभ उठाते हुए. हम निर्धारण प्रक्रिया प्रोटीन, लेकिन यह भी कम से कम कुछ posttranslational संशोधनों को न केवल बरकरार रखता है कि पता चला है. Phosphorylation और एन ग्लाइकोसिलेशन हालांकि FFPE नमूने 5, यह एक अच्छी तरह से नियंत्रित ऊतक संग्रह, भंडारण और निर्धारण की स्थिति है के लिए एक शर्त का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. अगला, हम तय ऊतक का एक लेजर कब्जा MICRODISSECTION के लिए और प्रोटिओमिक रिएक्टर आधारित नमूना प्रसंस्करण 6, 7 के लिए विधि अनुकूलित है. कोलोरेक्टल कैंसर पर एक बड़े पैमाने पर अध्ययन नैदानिक ​​सामग्री 8 से microdissected से 7,500 प्रोटीन की मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति दी. अंत में, हम लगातार दो कदम प्रोटीन पाचन प्रोटोकॉल 9 लगाने से microdissected सामग्री के अन्वेषण के रास्ते में सुधार हुआ है. एक एंजाइम का उपयोग आम पाचन रणनीतियों की तुलना में, इस प्रक्रिया को और अधिक अनुक्रम अद्वितीय पेप्टाइड्स की पीढ़ी सक्षम बनाता है और इसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन की पहचान की एक उच्च गहराई में यह परिणाम है. Microdissected मानव colonic ग्रंथ्यर्बुद के विश्लेषण से नमूना 3 प्रति 9,500 प्रोटीन की गहराई तक प्रोटिओमिक विश्लेषण की अनुमति दी. इस संवर्धन मेंहम कम से कम 2 पेप्टाइड्स के साथ 88-89% प्रोटीन की पहचान की अनुमति नमूना प्रति 55,000 पेप्टाइड्स मैप किए वाई. यहाँ हम LC-MS/MS विश्लेषण के लिए FFPE सामग्री से नमूनों की तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस प्रोटोकॉल एक रिएक्टर प्रारूप (FASP) में microdissection के लिए ऊतक स्लाइस की तैयारी, अलग कक्षों की सेल, और नमूना प्रसंस्करण शामिल 6. तो फिर हम पेप्टाइड पैदावार की एक spectrofluorometric दृढ़ संकल्प का वर्णन; इष्टतम पेप्टाइड पहचान के लिए उच्च महत्व के साथ एक कार्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा. अंत में, हम एक मजबूत आयनों एक्सचेंजर (SAX) आधारित पेप्टाइड fractionation के लिए जुदाई तकनीक का प्रदर्शन. इस विधि में पेप्टाइड जुदाई और अंतिम सफाई दोनों पिपेट की नोक microcolumns 10, 11 का उपयोग किया जाता है. यह कदम वैकल्पिक है, लेकिन अधिक माइक्रोग्राम कुछ से पेप्टाइड्स एक भी नमूना से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें अध्ययन में सिफारिश की है. SAX-fractionation काफी अध्यक्ष की संख्या और गतिशील रेंज में वृद्धि कर सकते हैंifications और प्रोटीन अनुक्रम कवरेज 3, 10 हूं.

Protocol

1. इंस्ट्रुमेंटेशन आवश्यक

  1. Microdissection और नमूना सेल के लिए ऊतक स्लाइस की तैयारी
    1. Thermoblock 99 डिग्री सेल्सियस या उबलते पानी के साथ स्नान करने के लिए निर्धारित किया है.
    2. लेजर ऑपरेटिंग microdissector (उदाहरण के लिए पाम, जीस, गौटिंगेन, जर्मनी).
    3. Thermostated पीठ टॉप अपकेंद्रित्र, तापमान 20 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट
    4. Eppendorf प्रकार निपटान ट्यूब के लिए एक रैक के साथ गीले कक्ष (बॉक्स).
    5. इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट
    6. सूक्ष्म पैमाने पर क्वार्ट्ज cuvettes (0.1-0.2 मिलीग्राम) के साथ यूवी प्रकाश के पास उत्साहित प्रतिदीप्ति को मापने के लिए सक्षम करने spectrofluorometer.

2. समाधान

  1. 'टिश्यू lysis बफर' (TLB): 0.1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 0.1 एम डीटीटी, 0.5% (w / v) पॉलीथीन ग्लाइकोल 20000 और 4% एसडीएस की.
  2. यूए समाधान: 0.1 एम Tris-एचसीएल 8.5 पीएच में 8 एम यूरिया. 1 नमूना प्रति 1 मिलीलीटर तैयार करें. यूए और आई ए ए समाधान हौसले से तैयार है और एक दिन के भीतर इस्तेमाल किया जाना है.
  3. आई ए ए समाधान: 0.05 एम मैंयूए में odoacetamide. 1 नमूना प्रति 0.1 मिलीग्राम तैयार करें.
  4. Endoproteinase लिस सी, शेयर समाधान.
  5. Trypsin, शेयर समाधान.
  6. 'पाचन बफर' (डीबी): 0.05 एम Tris-एचसीएल 8.5 पीएच. 1 नमूना प्रति 0.25 मिलीलीटर की तैयारी.
  7. 'Tryptophan मानक समाधान': 1 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 0.1 माइक्रोग्राम tryptophan.
  8. 'परख बफर बी' (एबीबी): 10 मिमी Tris-एचसीएल, 7.6 पीएच.
  9. ब्रिटन और रॉबिन्सन यूनिवर्सल बफर (BRUB) के शेयर समाधान. 0.1 एम सीएच 3 COOH, 0.1 एमएच 3 4 पीओ, और 0.1 एमएच 3 बो 3 युक्त समाधान तैयार करने और आवश्यक पीएच को 1 एम NaOH के साथ समायोजित (2, 4, 5, 6, और 11). उपयोग करने से पहले विआयनीकृत पानी के साथ 5 गुना पतला.
  10. विआयनीकृत पानी में 1% (v / v) सीएच 3 COOH: एक बफर.
  11. बफर बी: 60% (v / v) सीएच 3 सीएन, 1% विआयनीकृत पानी में (v / v) CH3COOH.

3. पिपेट टिप और 'StageTip' कॉलम

  1. एक सह में Empore-आयनों झिल्ली के 6 परतों stacking द्वारा SAX टिप स्तंभ की तैयारीmmon 0.2 मिलीलीटर विंदुक टिप. नमूना प्रति दो SAX की नोक कॉलम बना.
  2. एक 0.2 मिलीलीटर विंदुक टिप में Empore सी 18 के 3 परतें stacking द्वारा 'StageTip' तैयार करें. प्रत्येक नमूने के लिए 6 स्टेज सुझावों बनाओ.

4. Microdissection के लिए ऊतक स्लाइस की तैयारी और नमूना Lysis

  1. एक सूक्ष्म साथ वर्गों में कटौती (स्लाइस की मोटाई नमूना पर निर्भर करता है. आमतौर पर microdissection 7-10 माइक्रोन के स्लाइस के साथ अच्छी तरह से काम करता है).
  2. 45 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ झिल्ली स्लाइड्स (MembraneSlide 1.0 पेन) चमकाना.
  3. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर चमकाना झिल्ली स्लाइड और सूखे पर वर्गों माउंट.
  4. 2.5 मिनट और 1.5 मिनट के लिए xylene में लगातार दो incubations द्वारा घुड़सवार वर्गों Deparaffinize. लगातार निरपेक्ष इथेनॉल में incubations, 70% इथेनॉल, और पानी, 1 मिनट के लिए प्रत्येक से वर्गों rehydrate.
  5. , 20 सेकंड के लिए मेयर के hematoxylin के साथ वर्गों दाग 1 मिनट, और हवा शुष्क के लिए पानी से कुल्ला.
  6. सेल populati लीजिएलेजर कब्जा MICRODISSECTION प्रणाली का उपयोग ब्याज की पर. पाम साधन (Zeiss) का उपयोग करते समय चिपकने वाला टोपी में नमूने (चिपकने कैप 200) इकट्ठा.
  7. टोपी में microdissected सामग्री पर TLB के एक विभाज्य पिपेट. ट्यूब बंद करें और एक छोटी centrifugation द्वारा निलंबन लीजिए. Lyse 1 घंटे के लिए आंदोलन (600 आरपीएम) के साथ एक हीटिंग ब्लॉक में 99 डिग्री सेल्सियस पर microdissected ऊतक. Microdissected ऊतक के 10 NL के लिए बफर के 3 μl का प्रयोग करें.
  8. 10 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर centrifugation द्वारा कच्चे तेल निकालने स्पष्ट करें. lysate -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है

5. नमूना प्रसंस्करण

  1. समाधान के कम से कम 10 μl फिल्टर में रहेगा जब तक 200 ultrafiltration इकाइयों में यूए के μl (फॉरेंसिक 30k) और 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र के साथ स्पष्ट किया lysate के 50 μl के लिए मिश्रण. आम तौर पर इस कदम 10-15 मिनट centrifugation की आवश्यकता है.
  2. Ultrafiltration इकाई को यूए के 200 μl पिपेटऔर 5.1 में के रूप में अपकेंद्रित्र. संग्रह ट्यूब खाली.
  3. पिपेट 50 आई ए ए समाधान के μl और 5.1 में के रूप में 1 मिनट और अपकेंद्रित्र के लिए एक थर्मामीटरों मिक्सर में 600 rpm पर मिश्रण.
  4. 5.1 में के रूप में ultrafiltration इकाई और अपकेंद्रित्र को यूए के 100 μl पिपेट. दो बार इस चरण को दोहराएँ
  5. 5.1 पर ultrafiltration इकाई और अपकेंद्रित्र को डीबी के पिपेट 100 μl. दो बार इस चरण को दोहराएँ.
  6. नया संग्रह ट्यूबों को छानने का काम इकाइयों स्थानांतरण. पिपेट 40 μl endoproteinase लिस सी (1:100 की कुल प्रोटीन अनुपात को proteinase) के साथ DB और 1 मिनट के लिए थर्मामीटरों मिक्सर में 600 rpm पर मिश्रण. 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गीला कक्ष में इकाइयों को सेते हैं.
  7. ऐसे 5.1 में के रूप में 14,000 XG पर फिल्टर इकाइयों अपकेंद्रित्र.
  8. 5.1 में के रूप में विआयनीकृत पानी और अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाइयों की पिपेट 160 μl. जमा प्रवाह के माध्यम से (5.7 और 5.8 कदम) endoproteinase लिस सी. द्वारा जारी पेप्टाइड्स शामिल
  9. एक नया संग्रह ट्यूब ultrafiltration इकाई स्थानांतरण. 40 μl जोड़ेंTrypsin (प्रोटीन अनुपात 1:100 एंजाइम) के साथ DB और 1 मिनट के लिए थर्मामीटरों मिक्सर में 600 rpm पर मिश्रण. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गीला कक्ष में इकाइयों को सेते हैं. दोहराएँ tryptic पेप्टाइड्स एकत्र करने के लिए 5.7 और 5.8 कदम.

6. पेप्टाइड्स के quantitation

  1. tryptophan अवशेषों विलायक करने के लिए अच्छी तरह से पहुंच रहे हैं क्योंकि प्रोटीन हज़म में पेप्टाइड सामग्री की माप पतला बफर में प्रदर्शन किया जा सकता है.
  2. क्वार्ट्ज क्युवेट में एबीबी की 0.2 एमएल पिपेट और 'खाली' के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड.
  3. एबीबी के साथ क्युवेट और सौम्य मिश्रण करने के लिए टीएसएस की 1 μl aliquots जोड़कर 0.1 माइक्रोग्राम चरणों का उपयोग कर अंशांकन वक्र तैयार करें.
  4. क्युवेट साफ करें.
  5. नमूना पिपेट और स्पेक्ट्रम (नमूना) रिकॉर्ड है.
  6. प्रोटीन और पेप्टाइड एकाग्रता की गणना करें
    0.1 माइक्रोग्राम tryptophan ख प्राप्त प्रोटीन मिश्रण में tryptophan सामग्री का औसत 1.1% पर आधारित लगभग 9 ग्राम प्रोटीन (से मेल खाती है के बाद सेवाई) मानव कोशिकाओं lysing के प्रोटीन सामग्री डाइजेस्ट में नमूना या पेप्टाइड सामग्री में बराबर होती है:
    1 समीकरण
    एफ (Standard1) 0.1 माइक्रोग्राम tryptophan मानक के प्रतिदीप्ति है. पेप्टाइड सामग्री पाचन प्रक्रिया की उपज की गणना की अनुमति देता है और पेप्टाइड विभाजन और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण निम्नलिखित के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है.

7. लिस सी और tryptic पेप्टाइड्स के fractionation

  1. क्रमशः BRUB पीएच 11 और पीएच 5 के 0.2 मिलीलीटर, साथ लिस सी और trypsin साथ digestions द्वारा प्राप्त पेप्टाइड समाधान पतला.
  2. केन्द्रापसारक ट्यूब एडाप्टर ढक्कन में SAX टिप स्तंभ को इकट्ठा करो.
  3. BRUB, लिस सी pepti के विभाजन के लिए पीएच 11 की 0.1 मिलीलीटर के साथ, मेथनॉल के 0.1 मिलीलीटर के साथ क्रमिक 1 एम NaOH के 0.1 मिलीलीटर, और 3 बार SAX टिप स्तंभ धो लें और संतुलित करनाडेस और BRUB, tryptic पेप्टाइड्स के लिए पीएच 5 के साथ. स्तंभ सामग्री के माध्यम से समाधान का प्रवाह 4000 x जी पर centrifugation द्वारा सुविधा है.
  4. के लिस जुदाई के लिए 4, 'StageTips' - धो और 18 सी संतुलित करना - फिर बाद में साथ 'StageTips', मेथनॉल की 0.05 मिलीग्राम, बफर बी के 0.05 मिलीलीटर के साथ और बफर ए के 0.05 मिलीलीटर छह सी 18 की तैयारी के साथ सी पेप्टाइड और tryptic पेप्टाइड्स के अलग होने के लिए दो.
  5. 'StageTip' - सी 18 में SAX टिप स्तंभ को इकट्ठा करो. Equilibrated SAX टिप स्तंभों में नमूना समाधान लोड और 3 मिनट के लिए 5000 XG पर स्तंभों अपकेंद्रित्र.
  6. 0.1 क्रमशः Lyc सी को BRUB की मिलीलीटर, पीएच 11 पीएच या 5, और tryptic नमूनों के साथ 'पिपेट की नोक' कॉलम संतुलित करना. 5000 x जी पर centrifugation द्वारा प्रवाह की सुविधा.
  7. अगले 18 सी के लिए SAX टिप स्तंभ स्थानांतरण - 'StageTip'.
  8. लिस सी नमूना के लिए और ब्रू साथ BRUB पीएच 6, 4, और 2 के साथ पेप्टाइड्स के Eluting जारीTryptic पेप्टाइड्स के साथ नमूना के लिए बी पीएच 2. 'StageTip' - प्रत्येक क्षालन कदम एक अलग सी 18 का उपयोग करें.
  9. बफर ए के 0.05 मिलीलीटर के साथ 'StageTips' - सी 18 धोएं
  10. एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ इकट्ठे नियंत्रण रेखा प्रणाली में नमूनों के इंजेक्शन के लिए सीधे इस्तेमाल शीशियों में बफर बी के 0.05 मिलीलीटर के साथ भिन्न Elute.

Representative Results

FFPE सामग्री की प्रोटिओमिक विश्लेषण नमूना तैयार करने के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों की आवश्यकता है. इस प्रकाशन में हम प्रभावी तय सामग्री से सेल आबादी के अलगाव और सीधे LC-MS/MS विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उच्च शुद्धता पेप्टाइड भागों में जिसके परिणामस्वरूप उनकी रासायनिक प्रसंस्करण की अनुमति एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. FFPE नमूनों और अपने microdissection, मेड FASP दृष्टिकोण का उपयोग प्रोटीन का नमूना और प्रसंस्करण की (2) सेल, और (3) quantitation और (4) विभाजन के के वर्गों के (1) तैयारी: प्रक्रिया चार अलग भागों से मिलकर बनता है पेप्टाइड्स (चित्रा 1).

प्रक्रिया के पहले चरण में FFPE नमूने एक सूक्ष्म तक्षणी साथ sectioned हैं और झिल्ली को कवर स्लाइड्स पर मुहिम शुरू की. ऊतक वर्गों और स्लाइड झिल्ली की सतह के बीच आसंजन बढ़ाने के लिए यूवी प्रकाश के साथ स्लाइड सतह प्रकाशित करना आवश्यक है. इस उद्देश्य के लिए हम एक यूवी लैंप की रोशनी का उपयोगएक सेल संस्कृति बेंच में एकीकृत. इस कदम के बाद स्लाइड नमूने की आयल और पुनर्जलीकरण को हटाने की अनुमति washes के अधीन हैं. rehydrated सामग्री थोड़े समय के लिए hematoxilin साथ दाग है. इस नमूने की एक कमजोर धुंधला में यह परिणाम है लेकिन microdissection के लिए नमूना क्षेत्रों के दृश्य के लिए पर्याप्त है. धुंधला प्रक्रिया पानी की एक अतिरिक्त के साथ स्लाइड के rinsing द्वारा तेजी से बंद कर दिया जाना है. गरीब पेप्टाइड पैदावार में नमूना परिणामों की एक लम्बी धुंधला हो जाना.

अगले चरण में सूखे वर्गों microdissection के अधीन हैं. व्यक्ति की कोशिकाओं के ऊतक क्षेत्रों का चयन जांच के प्रकार पर निर्भर करता है और हमेशा ऊतक विज्ञान या pathomorphology में विशिष्ट ज्ञान की आवश्यकता है. लेजर जारी की सामग्री का नमूना संग्रह ट्यूबों के चिपकने वाली सतहों पर इकट्ठा किया जाता है. चिपकने वाला पदार्थ के बंधन क्षमता सीमित है के बाद से यह टी को ढकने से microdissected सामग्री हस्तांतरण करने के लिए आवश्यक हैनमूना के हर 3-5 मिमी 2 का विच्छेदन के बाद वह ट्यूब. यह आसानी ढक्कन और एक अपकेंद्रित्र में ट्यूब की एक छोटी कताई पर ऊतक lysis बफर (LTB) के कुछ microliters के pipetting द्वारा किया जा सकता है. नमूना ट्यूब के नीचे में एकत्र होने के बाद, ढक्कन पर microdissection और नमूना संग्रह जारी रखा जा सकता है. पूरे नमूना एकत्र किया जाता है एक बार ट्यूबों इसके अतिरिक्त 1 घंटे के लिए निरंतर आंदोलन के साथ के बारे में 99 डिग्री सेल्सियस पर Parafilm के साथ stoppered और एक पानी के स्नान में incubated किया जाना है. ऊष्मायन पानी के दौरान ढकने पर संघनित के बाद से, हर 15 मिनट ट्यूब शीघ्र ही ट्यूब कोन में पानी वापस एकत्रित करने के लिए centrifuged किया जाना है.

पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए ऊतक lysates मेड FASP दृष्टिकोण का उपयोग कर कार्रवाई की जाती है. इस विधि में lysed प्रोटीन cysteinyl अवशेषों पर carboamidomethylated डिटर्जेंट और अन्य कम आणविक भार पदार्थों से समाप्त हो रहे हैं, और उसके बाद लगातार दो एंजाइमों अलग से पचउनके दरार specificities में fering: lysC और trypsin endoproteinase. प्रत्येक पाचन कदम के बाद पेप्टाइड्स अलग भागों में एकत्र कर रहे हैं. नमूना तैयार करने के इस भाग में यह शुरू में झिल्ली पारित किया निस्पंदन इकाई में लोड समाधान की अधिक से अधिक 95% तक centrifugation कदम के प्रत्येक जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण है. Colonic ऊतक और अपने कैंसर का विश्लेषण करना हम देखा है कि इस प्रक्रिया की पैदावार 100 NL microdissected सामग्री (तालिका 1) के (100 माइक्रोग्राम ऊतक या एक 10 माइक्रोन खंड के 10 मिमी 2) के अनुसार पेप्टाइड की 3-6 ग्राम. ऊतकों से निष्कर्षण कुल प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन प्रक्रियाओं को एक साथ मूल ताजा ऊतक के संबंध में एक 30-60% उपज में परिणाम ऊतक के वजन के बारे में 10% है के बाद से. इन मूल्यों को निर्जलीकरण और धुंधला हो जाना, microdissection, और ultrafiltration इकाइयों में पचाया नमूना के हिस्से की अवधारण के दौरान प्रोटीन की हानि दर्शाते हैं. क्योंकि कोई की निकासी और प्रसंस्करणN-microdissected FFPE ऊतक यह महत्वपूर्ण नमूना नुकसान मेड FASP पहले कदम के दौरान होने की संभावना है कि 75% 5 के प्रोटीन से पेप्टाइड रूपांतरण उपज में हुई. इस प्रक्रिया से प्राप्त पेप्टाइड मिश्रण का एक महत्वपूर्ण विशेषता आगे fractionation पेप्टाइड fractionation प्रक्रिया और मास स्पेक्ट्रोमेट्री पहचान की सुविधा जो उनके उच्च शुद्धता है. यह हाल ही में कोलोरेक्टल ग्रंथ्यर्बुद नमूनों 3 के एक विश्लेषण से दिखाया गया है. कि अध्ययन में एमएस / एमएस की घटनाओं के बारे में 40% FFPE ऊतक से पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए नेतृत्व और एक LC-MS/MS रन प्रति 17,000 पेप्टाइड्स की मैपिंग में हुई. हायर पहचान दरों ही जमे हुए इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं 3 के विश्लेषण में हासिल किया गया है.

पूरी प्रक्रिया के पिछले दो भागों में अलग पेप्टाइड्स मात्रा निर्धारित कर रहे हैं और पिपेट की नोक microcolumns पर fractionated. Microdissected ऊतक से अलग पेप्टाइड की मात्रा में हो रहे हैं जब सेकम 10 माइक्रोग्राम वे आमतौर पर इस्तेमाल डाई आधारित प्रोटीन assays का उपयोग मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता. इसके अलावा इन सांद्रता में 280 यूवी वर्णक्रमीय माप के कारण प्रकाश बिखरने प्रभाव के लिए उपयोगी नहीं हैं. इसके विपरीत, tryptophan अवशेषों के प्रतिदीप्ति की माप पेप्टाइड सामग्री के निर्धारण के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं.

हाल ही में हम सभ्य कोशिकाओं से अप करने के लिए 5,000 प्रोटीन एक 'एकल शॉट' 4 घंटा LC-MS/MS विश्लेषण 7 में पहचाना जा सकता है कि पता चला है. हालांकि विश्लेषण के इस प्रकार शायद ही कभी 3,000 से अधिक हजार प्रोटीनों की पहचान की अनुमति देता देशी ऊतकों को लागू. मेड FASP में उत्पन्न पेप्टाइड्स LC-MS/MS से पहले पूर्व fractionated किया जाना है विश्लेषण की गहराई की वृद्धि हुई है. SAX आधारित सूक्ष्म स्तंभ जुदाई एक सरल और कुशल fractionation विधि 10 है. यह पहले से ही तय ऊतक 5, 8, 9 का विश्लेषण करने के लिए उन सहित कई प्रोटिओमिक पढ़ाई में लागू किया गया है. SAX 'पिपेट की नोक' microcoluमनसे, और 18 सी - 'StageTip' desalting कॉलम 9 आसानी से तैयार कर रहे हैं. कॉलम, प्लग के stacking द्वारा इकट्ठे SAX से कट या 18 सी झिल्ली, एक 200 μl विंदुक टिप 11 में कर रहे हैं. SAX-fractionated FFPE नमूनों के विश्लेषण के उदाहरण तालिका 1 में दिखाया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रक्रिया सिंहावलोकन. FFPE नमूनों और अपने microdissection, मेड FASP दृष्टिकोण का उपयोग प्रोटीन का नमूना और प्रसंस्करण की (2) सेल, और (3) quantitation और (4) विभाजन के के वर्गों के (1) तैयारी: प्रक्रिया चार अलग भागों से मिलकर बनता है पेप्टाइड्स.

नमूना नमूना पूर्व fractionation / पाचन प्रयोग किया जाता मास स्पेक्ट्रोमीटर पेप्टाइड उपज एनजी / NL नमूना (एसडी ±) एक नमूना प्रति अद्वितीय प्रोटीन पहचान संदर्भ
• Adenonocarcinoma
• सामान्य colonic म्यूकोसा 		SAX / एक एंजाइम Orbitrap-Velos 36 ± 11 (एन = 8)
30 ± 8 (एन = 8) 		5985 ± 54
5868 ± 110 		8
• Colonic ग्रंथ्यर्बुद SAX / दो एंजाइमों क्यू Exactive 56 ± 6.1 (n = 3) 9501 ± 28 3

तालिका 1. FFPE microdissected ऊतक की प्रोटिओमिक विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम.

Discussion

न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण और माइक्रोएरे तकनीक के साथ तुलनीय गहराई तक प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी द्वारा FFPE सामग्री का अध्ययन करने की क्षमता biomarker और दवा लक्ष्य की खोज में नया दृष्टिकोण को खोलता है. वर्णित प्रोटोकॉल लक्षण वर्णन और 10,000 प्रोटीन के पैमाने पर microdissected कोशिकाओं की आबादी के proteomes के quantitation सक्षम बनाता है. Microdissected सामग्री का कम उपयोग करते समय एक छोटे डेटासेट उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन शायद कई मामलों में उन लोगों को भी मूल्यवान नैदानिक ​​डेटा प्रदान कर सकते हैं. इस प्रकार, नमूनों या तो मेड FASP प्रक्रिया के बाद सीधे विश्लेषण किया जा सकता है या कम भागों में विभाजित किया जा सकता है. FASP प्रक्रिया प्रोटीज के किसी भी प्रकार के साथ संगत है, अन्य एंजाइमों या उनके संयोजन प्रोटीन digestions 6 से इस्तेमाल किया जा सकता है.

FFPE सामग्री की गुणवत्ता विश्लेषण का सबसे महत्वपूर्ण मुद्दा होना प्रतीत होता है. हम निश्चित ही मूल के ऊतक लेकिन से आ रही है कि अलग अनुभव किया हैईएनटी क्लीनिक विशिष्ट गुण था. एक अन्य क्लिनिक से इसी तरह की सामग्री लगभग बेकार था जबकि, हम उच्च पैदावार पर पेप्टाइड्स उत्पन्न करने में सक्षम थे एक स्रोत से ऊतक का उपयोग करना. इसे लागू निर्धारण और embedding प्रक्रियाओं के साथ ही भंडारण की स्थिति चिकित्सीय सामग्री 12 के गुणों को प्रभावित प्रमुख कारक हैं कि संभावना है. इसलिए यह एक बड़ी परियोजना शुरू करने से पहले कुछ नमूने के गुणों का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है.

कई प्रकाशनों अतीत में FFPE सामग्री के उपयोग की सूचना दी. हालांकि, इन अध्ययनों में पहचान प्रोटीन की संख्या से अधिक 1,000-2,000 प्रोटीन 4 से अधिक नहीं. 10,000 से अधिक प्रोटीन शामिल मानव कोशिका विशिष्ट proteomes के आकार को देखते हुए, इस तरह के अध्ययन लगभग हाउसकीपिंग कार्यों में शामिल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन तक ही सीमित एक बहुत सतही चित्र, प्रदान करने के लिए ही कर रहे थे. हमारे प्रोटोकॉल नैदानिक ​​या जैविक सामग्री एफ के कुशल अलगाव में सक्षम बनाता हैROM ऊतक संरक्षित और सेल, प्रोटीन प्रसंस्करण और पेप्टाइड prefractionation के लिए अनुकूलित है. एक परिणाम के रूप में हमारे नमूना तैयार कार्यप्रवाह, उच्च अंत मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित है, एक लगभग पूरा proteomes में अंतर्दृष्टि देता है. उल्लेखनीय है, इस मिनट नमूना राशि आवश्यकताओं पर संभव है.

संरक्षित ऊतकों का उपयोग करने का प्रमुख लाभ उनके रिश्तेदार व्यापक उपलब्धता है. FFPE नमूने कई वर्षों और दशकों के लिए संग्रहीत है, और कभी कभी बेकार के रूप में माना जाता है, अब, प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी के लिए धन्यवाद, नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए के रूप में अत्यधिक मूल्यवान सामग्री दिखाई देते हैं. कई बीमारियों FFPE सामग्री की ताजा या फ्रोजन सामग्री जांच के अध्ययन का उपयोग किया जा सकता है जबकि दुर्लभ बीमारियों 12 के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण होने लगता है, नमूना के एक प्रतिनिधि के सेट आमतौर पर एक लंबा समय लगता है के संग्रह थे.

Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक विधि का प्रदर्शन के लिए सतत समर्थन और श्रीमती Katharina Zettl के लिए धन्यवाद डॉ. मथायस मान.

इस काम के लिए एडवांसमेंट ऑफ साइंस मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MembraneSlide 1.0 PEN Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany 415190-9041-000
Adhesive Cap 200 opaque Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany 415190-9181-000
Mayer's hematoxylin solution Sigma-Aldrich St. Louis, MO MHS32
Forensic 30k Merck Millipore Darmstadt, Germany MRCF0R030 (Previously sold as Microcon YM-30)
Empore Anion Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN 2252
Empore C18 Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN 2215
Trypsin Promega 2014-06-27
Endoproteinase Lys-C Wako 129-02541

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References

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रसायन विज्ञान अंक 79 नैदानिक ​​रसायन विज्ञान के टेस्ट प्रोटिओमिक्स प्रोटिओमिक्स प्रोटिओमिक्स विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान Formalin तय की और (FFPE) एम्बेडेड आयल नमूना तैयार करने प्रोटिओमिक्स फिल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयार (FASP) नैदानिक ​​प्रोटिओमिक्स microdissection SAX-fractionation
Formalin से प्रोटिओमिक नमूना तैयार आयल एम्बेडेड ऊतक फिक्स्ड और
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Wiśniewski, J. R. Proteomic… More

Wiśniewski, J. R. Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue. J. Vis. Exp. (79), e50589, doi:10.3791/50589 (2013).

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