Summary
我们概述方法从新生儿大脑皮层和脊髓成人的可行的小胶质细胞的高效和快速隔离/文化。解剖和电镀皮质小胶质细胞可以在90分钟内完成，与随后发生〜10天的初始剥离后的小胶质细胞的收获。
Abstract
小胶质细胞是驻地的中枢神经系统（CNS）和巨噬细胞样的细胞，因此，极为重要的作用，在生理和病理过程，如中枢神经系统的成熟发展，多发性硬化，脊髓损伤。小胶质细胞可以激活并招募行动由神经元的损伤或刺激，如性轴索损伤看出，在MS或缺血性脑外伤导致中风。这些免疫功能的中枢神经系统成员也被认为在非病理条件下在突触可塑性的角色。我们采用从新生儿和成人组织的目的是最大限度地存活细胞数，同时最大限度地减少混淆的变量，如其他中枢神经系统的细胞类型和细胞培养碎片的存在下培养的小胶质细胞的协议。我们利用大和容易辨别的中枢神经系统组件（ 如皮质，脊髓节段），这使得整个过程可行，重复性好。成体细胞的使用s是一个合适的替代使用新生儿脑小胶质细胞，，许多病理研究主要影响产后脊髓。这些培养系统也可用于直接测试化合物的效果，可以抑制或促进小胶质细胞活化。由于小胶质细胞活化可以塑造成人中枢神经系统疾病的结果，需要在体外系统，在该系统中，新生儿和成人的小胶质细胞可以培养研究。
Introduction
小胶质细胞是中枢神经系统，最密切相似周巨噬细胞的结构和功能1的的居民免疫细胞的。它最近已表明，出生后的小胶质细胞来源于原始粒细胞前体细胞和胚胎发育的第8天之前产生，颠覆了以前的概念，即出生后的造血祖细胞是小胶质细胞的来源在成人大脑2。他们在一些神经系统疾病中发挥关键作用，并能快速响应感染或受伤的释放促炎或抗炎性细胞因子3。因此，小胶质细胞在中枢神经系统中可以被操纵，影响疾病进展包括一个独立单元。发展强大的和可重复性的方法分离和培养新生儿或成人的小胶质细胞是重要的未来的研究。
小胶质细胞是已知的，在许多的脑疾病是至关重要的玩家。最近，ROL上课新兴的细胞在正常脑小胶质细胞吞噬多余的从1，4海马齿状回神经祖细胞的发育和功能。小胶质细胞也可以调节几个影响脊髓的神经系统疾病，如MS，神经性疼痛，脊髓损伤5-7。脊髓小胶质细胞相比，脑小胶质细胞激活信号，8，9，在本地环境中的差异可能是由于不同的反应。因此，重要的是要建立一个适当的文化研究脊髓小胶质细胞在体外系统。出生的小胶质细胞产生显着的促炎性细胞因子一氧化氮相比，成体细胞在体外刺激后IFN-γ或TNF-α的10,11进一步突出，需要使用成体细胞研究小胶质细胞的某些疾病的情况下。
我们采用的协议，在实验室中立方米lture新生儿小胶质细胞是根据最近的方法，利用摇动混合胶质细胞培养在努力消除小神经胶质细胞的细胞培养瓶12从表面的变化。我们也给出了基于业， 等[13]首次描述了一个协议，从成年小鼠脊髓小胶质细胞培养方法。这种方法提供了更快的方法来培养成年细胞相比其他可用的协议14。将所得的制剂是70％的小胶质细胞，剩余的百分比组成的星形胶质细胞。虽然我们的文化的纯度较其他已发表 的方法13，这种文化系统是有益的探索小胶质细胞在培养应对各种活化刺激，以及为研究疾病，主要影响脊髓强势炎症反应的一个主要特征。
所有描述的协议已获石溪分校学报JOURNALTY IACUC。
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Protocol
1。解剖（0天）
- P0-2鼠标幼仔低温麻醉。与一个Kimwipe浸泡，70％乙醇消毒纸巾擦拭头幼崽。
- 卸下磁头，用一把剪刀，使用4幼仔每10cm的培养板中。在冰冷的Hank氏缓冲液的培养皿中，将磁头。
- 锚头使用弯钳眼窝，并小心地去除皮肤覆盖直microforceps颅骨。
- 取出颅骨与直microforceps，小心使用不穿刺或损坏皮质。最有效的方法是小脑附近，位于头的基础，这个区域将被丢弃起开始拆除。
- 用小铲取出大脑，在冰冷的Hank氏缓冲液新鲜的陪替氏培养皿中，放置在（4）的大脑。
- 从这点上的所有步骤利用microforceps下狄氏CTION显微镜。从大脑的腹侧，锚持有小脑组织，使脑两侧的两个小切口。要小心，不要砍下所有的方式，通过组织，覆盖在这个区域的脑皮质。
- 轻轻逗在一块从两个皮质的脑和小脑。这两个皮层应形成的凹状。
- 分开的两个皮质和定向单一皮质，内侧为进一步解剖。海马是很难观察到，但它位于相反的嗅球尖端的皮质出现小结节。
- 取出海马，其中有一个月牙形状。皮质翻转过来查看背侧。
- 使用嗅球作为一个起点，删除所有脑膜和嗅球本身从皮质。
- 解剖皮质应置于15 ml锥形管14毫升的山坳D汉克的缓冲液冰。
2。细胞培养（0天）
- 预涂10厘米的组织培养皿5微克/毫升无菌水稀释聚-D-赖氨酸（PDL）3小时，在37°C
- 吸PDL，一次用无菌水冲洗板。干板的紫外线下，在组织培养罩20分钟。这一步之前应进行解剖过程。
- 汉克的缓冲吸液管从4大脑皮质，适用于1个胰蛋白酶/ EDTA溶液4毫升，磨碎组织P1000尖，地方管在37℃培养箱中培养15分钟。
- 完整的的小胶质媒体每管加4毫升，停止酶消化，混合，和自旋向下的内容1.5K转速为5分钟。
- 吸出上清液，并重复洗涤4毫升完全培养基。将细胞重新悬浮在10毫升的完整的小胶质细胞介质（含10％FBS的DMEM，1％丙酮酸钠，0.08％庆大霉素）和过滤器通过40微Ñ网状细胞过滤。
- 板8皮层，每10毫升的密度为10厘米的组织培养板和在细胞培养箱中于37℃和5％CO 2的（成人小胶质协议）。
（3天）
- 更改媒体在所有细胞培养皿完整的小胶质媒体。
（10天）
- 加入利多卡因HBSS（分离的小胶质细胞）到培养基中，10厘米的组织培养板在室温（RT）和孵育10-15分钟的400微升60毫米。
- 收集媒体/细胞悬液板，板洗一次，汉克的缓冲。收集洗涤缓冲液，收回剩余的小胶质细胞。
- 添加5mM的EDTA（pH8.0）中的细胞悬浮液，以使最终浓度为50μM，或以1/100稀释。
- 自旋向下的细胞悬浮液以1,000×g离心（1500转）5分钟，重新悬浮在含1％FBS的1毫升的DMEM。
- 计数活细胞数（每成人糜croglia 3.1/3.2）和分裂的细胞组织培养板所需的实验密度。约1×10 6小胶质细胞从10厘米板包含从4大脑皮质的收获。免疫荧光法，是推荐的密度为2.5×10 4个细胞每18毫米的盖玻片。
- 允许至少24个小时的小胶质细胞完全返回到前分枝，静息状态下使用。
协议文本：（成人小胶质细胞）
1。组织收集
- 大衣组织培养板与聚-D-赖氨酸（PDL）3小时37°C或一夜之间在4°C。一次洗板立即使用前用无菌水。
- CO 2窒息，并确定完成，安乐死是安乐死鼠标。用70％乙醇清洁脊髓区域。
- 用一把剪刀剪的脊髓顶部的皮肤上，然后进行切断脊髓区域T1到T12。切剩余的肌肉的脊髓的两侧。
- 慢慢地切割的椎骨microscissors你轻轻地握住您的指尖脊髓。要小心，不要穿刺脊髓组织是非常柔软。慢慢地提取脊髓microforceps。
- 脊髓淹没在培养皿中含有冰冷的HBSS。使用光学显微镜取出所有可见的使用microforceps脑膜
- 切脊髓成横向分部小到足以产生几个片段。碎片的厚度不应该超过2毫米，以促进高效率的消化。脊髓片转移到15毫升锥形管含1毫升冰冷的HBSS。保持管在冰上，直到消化步骤。
2。组织消化
- 吸HBSS从15毫升锥形管含有脊髓组织。要小心，不要吸任何一张纸巾。
- 添加1毫升的胰蛋白酶（2。5 g / L的照射猪胰蛋白酶和0.2 g / L的EDTA的HBSS），并在37℃孵育30分钟。
- 要停止消化，消除胰蛋白酶和初级小胶质细胞培养基中加入3毫升含有血清制止酶消化。
- 吸取和，撞出组织。使用40微米的细胞过滤筛选的细胞悬液。
3。细胞计数及电镀
- 混合等体积的细胞悬浮液和DAPI溶液。
- 使用血球计数细胞。
- 板5 7×10 5个细胞/ ml在PDL涂层35×10毫米的菜肴之间的密度。在一个较低的密度电镀阻止细胞的生长，即使当细胞培养在12孔板中，有一个较小的区域相比，35×10毫米的菜肴。
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Representative Results
静息和活化的小胶质细胞的一个例子是图1中所示。小胶质细胞可视化电镀后24小时（ 图1a），表现出分枝形态（休息）。曝光吸试剂，细菌脂多糖（LPS）被激活小胶质细胞形态变化细胞（ 图1b）。
电镀细胞计数的一个例子如图2所示。由于细胞碎片的存在下，DAPI Fluoromount（而不是台盼蓝）溶液中加入等体积的细胞悬浮液，并放置在血球细胞计数4中所描述的，13。 DAPI染色阳性细胞，用荧光显微镜可视化。使用明亮的字段设置，方便准确计数的细胞存在（ 图2）。大约7×10 5细胞，每只小鼠的脊髓。
内容“>在细胞接种在PDL涂层的35×10毫米组织培养皿中。我们发现该涂层与PDL是一个关键步骤，细胞没有坚持/成长，除非板涂覆，小胶质细胞完全附加到培养板后约2天的文化（ 图3）。脊髓的MacGreen小鼠，表达GFP的小胶质细胞/巨噬细胞的启动子CSF-1R的控制下，用于本实验中。
图1。代表图像新生儿小胶质细胞培养两天后，小胶质细胞培养从P0 C57/BL6小鼠幼崽和镀在无涂层的密度为2.5×10 5个细胞/ ml的盖玻片的，未经处理的小胶质细胞。已经返回到某个休息，支链状态，B，D 。小胶质细胞用100 ng / ml的LPS 4小时，明场图像显示的活化，变形虫状，Iba1（绿色，为巨噬细胞/小胶质细胞的细胞表面蛋白的特定的标记的）已被用于可视化的细胞，而被用来显示整体的细胞群。 DAPI Fluoromount使用可视化晶核并注明，培养物的纯度。
图2。细胞计数 DAPI Fluoromount是用等体积的细胞悬浮液混合，并放置在血细胞计数器。我们结合明场和荧光设置可视化DAPI染色阳性细胞和一个准确的细胞计数血细胞计数器网格。
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图3。成人脊髓小胶质细胞培养两天后的代表图像。一个脊髓一个MacGreen鼠标用于培养过程。 PDL的涂层35×10毫米组织培养皿中的细胞被接种在7×10 5细胞/ ml的密度。明视场图像的脊髓小胶质细胞培养两天后。小胶质细胞（蓝色箭头），星形胶质细胞（红色箭头）， 点击这里查看大图 。
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Discussion
小胶质细胞调节中枢神经系统正常运作，以及各种病症的炎症反应。小胶质细胞突触重塑功能已被牵连在维护正常脑动态平衡15。在神经源性级联，他们参与了海马4，16齿状回神经祖细胞的间隙。因此，有必要制定一个文化系统，在新生儿和成人学习的小胶质细胞，这将覆盖的广袤的发展和成年后，整个小胶质细胞有多个分立功能。我们已经提出了一个快速，高效的小胶质细胞培养方法从成人脊髓和新生儿脑。我们能够在成人的，与其它的小胶质细胞的星形胶质细胞的组成比例分别为70％，纯度接近100％的新生儿小胶质预科取得细胞制剂。
由于角色的临屋区吨的星形胶质细胞在调节17-19小胶质细胞的激活状态，这是很重要的优化培养条件，以提高纯度的文化。虽然结合的细胞悬液与等体积的DAPI Fluoromount允许一个准确的细胞计数，这是不能够区分的小胶质细胞从其他类型的细胞，使用此方法。为了改善成人小胶质细胞的制剂的纯度，绿色荧光蛋白涂覆的磁珠孵育老鼠MacGreen的髓系细胞已经表达GFP 20是来自于与细胞悬浮液。另一个建议是板培养皿中混合细胞悬液没有事先涂PDL防止星形细胞附着13。然而，我们发现，没有细胞的生长板，除非他们已经事先涂在我们手中，是适用于新生儿和成人细胞。
很多描述方法分离和提纯的协议无论从大鼠或小鼠的脑组织的初级小胶质细胞中的振动性，电镀利用摇动混合胶质细胞培养分离的小胶质细胞，从而获得纯化的下游实验12人口。我们的协议不同，最显着的是在不包括摇步，而是专注于净化的小胶质细胞的人口只有通过准确滴定的条件培养。根据我们的经验，振摇混合胶质细胞培养，以去除小胶质细胞是有效的，但是有一个显着的缺点-动摇的小胶质细胞的事实，需要几天时间，返回到一个完整的休息形态12。这可能是有问题的，因为活化的小胶质细胞有相当不同的细胞因子谱21。我们的协议，同时略长，以获得纯净的小胶质细胞，保持细胞处于休息状态，整个。与成人的准备，在接下来的段落中讨论，我们的方法的一个缺点是减低bility的其他类型的细胞，包括星形胶质细胞的污染小。
我们培养成人小胶质细胞的技术有很大的差别，从已经存在的方法。许多协议要求的使用密度梯度离心（珀）以及使用流式细胞仪来获得一个纯粹的小胶质细胞人口22。我们创造一个稳定的成年脊髓小胶质细胞培养的方法，我们不使用这两种技术，这使得相当少费时和复杂的协议研究员。成人小胶质细胞的制剂而绝大多数来自脑组织，脊髓是由相同类型的细胞- ，因此，我们的协议，提出了一种公平的比较，以先前描述的方法（22）。在我们的协议的一个折衷是一个稍微不那么纯的小胶质细胞的制备，由70％的小胶质细胞，与剩余部分的细胞大多是星形细胞的原稿名词使用非常特定的细胞类型如伊巴-1和F4/80的共轭的磁珠标记的小胶质细胞谱系的更纯的小胶质细胞隔离使用一个额外的步骤，这种差异可能会被克服。
大多数研究，评估影响脊髓已经进行了使用从新生儿大脑细胞，神经系统疾病，小胶质细胞的作用，而这是一个坚实的方式回答有关小胶质细胞的正常发育的作用以及影响的病症大脑具体而言，我们认为，必须建立一个更具体的方法研究小神经胶质细胞在成年脊髓功能。我们新生儿的方法是一种非常有效的方式来回答问题大脑的正常运作，以及在某些病理条件下，和成人的方法是一个很好的替代为这种研究使用的新生儿细胞免疫应答，在给定的可变性s之间新生儿的小胶质细胞和成人细胞和小胶质细胞从大脑和脊髓6-9之间。也适用于描述这两种方法得到的小胶质细胞在体外共同培养的研究（主要是文化与神经元和少突胶质细胞在我们的实验室），地址以及其他类型的细胞小胶质细胞的影响新生儿和成人激活的小胶质细胞反应刺激。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢他们的意见和有益的意见的Tsirka实验室成员。这项工作是支持由R01NS42168到SET，12PRE12060489 RB，的NSF-3MT IGERT和特纳论文的奖学金LT，NSF-3MT IGERT JCN。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -È, Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
