Summary
Se adaptó un conjunto de protocolos para la medición de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se pueden aplicar en varios modelos celulares de ameba y de mamíferos para estudios cualitativos y cuantitativos.
Abstract
Especies reactivas de oxígeno (ROS) comprenden una gama de, moléculas que contienen oxígeno reactivas y de corta duración, que se interconvertir o eliminarse ya sea catalíticamente o espontáneamente dinámicamente. Debido a los cortos ciclos de vida de la mayoría de ROS y la diversidad de sus fuentes y localizaciones subcelulares, una imagen completa se puede obtener sólo por medio de mediciones cuidadosas usando una combinación de protocolos. A continuación, presentamos un conjunto de tres protocolos diferentes utilizando OxyBurst Green (OBG) recubierto con perlas, o dihydroethidium (DHE) y Amplex UltraRed (AUR), para controlar cualitativa y cuantitativamente diferentes ROS en fagocitos profesionales como Dictyostelium. Hemos optimizado los procedimientos de revestimiento cuentas y perlas revestidas de OBG usados y microscopía en vivo para visualizar dinámicamente intraphagosomal la generación de ROS en el nivel de células individuales. Se identificaron lipopolisacárido (LPS) de E. coli como un potente estimulador de la generación de ROS en Dictyostelium. Además, Dtiempo real eveloped, ensayos de mediano rendimiento utilizando DHE y AUR para medir cuantitativamente superóxido intracelular y extracelular H 2 O 2 de producción, respectivamente.
Introduction
Especies reactivas de oxígeno (ROS) están involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos tales como la defensa del huésped, señalización, el desarrollo del tejido y la respuesta a la lesión, así como la hipertensión y el cáncer. La maquinaria de la oxidasa NADPH phagosomal bien estudiado se dedica a la generación de ROS rápida, conocida como la explosión oxidativa, para matar las bacterias ingeridas en los fagosomas neutrófilos '1. Además, la fuga de electrones como un subproducto de la cadena respiratoria mitocondrial se pensaba que ser responsable sólo de una fuente no regulada de ROS. Sin embargo, recientemente, se identificó como un importante mecanismo para contribuir a la muerte intraphagosomal de bacterias en macrófagos de ratón 2. En los últimos años, la ameba sociales, Dictyostelium, se ha convertido en un modelo de gran alcance y popular para estudiar mecanismos celulares intrínsecas de la respuesta inmune innata. De hecho, Dictyostelium y fagocitos humanos comparten un sorprendente alto nivel de conservación en moleculamaquinarias r responsables de las bacterias de detección, inmersión y matando a 3,4. Los homólogos de proteínas y enzimas relacionadas con la producción o la desintoxicación de ROS, tales como NADPH oxidasas, catalasas, superóxido dismutasas, se pueden encontrar en humanos y Dictyostelium. A medida que la ameba mejor estudiado, Dictyostelium presenta varias ventajas únicas sobre modelo de sistema de los mamíferos. Crecen a temperatura ambiente sin la necesidad de CO 2, con un tiempo de duplicación de 8-10 horas. Se pueden mantener fácilmente como cultivos adherentes o de suspensión. Además, gracias a su genoma haploide totalmente secuenciado y anotado, y a la manipulación genética fácil, Dictyostelium se ha convertido en un muy atractivo organismo modelo experimental.
En estudios anteriores, diversos derivados clorados y fluorados de fluoresceína (conocidos colectivamente como OxyBurst verde, OBG) que emite fluorescencia después de la oxidación por ROS, se han utilizado como un reportero de ROS. Est Cell-permeantderivados erified se utilizan para medir citoplasmática de ROS, mientras que o dextrano-derivados de células impermeable acoplados a proteínas se utilizan para medir extracelular ROS. En particular, perlas recubiertas con BSA OBG ya han sido utilizados para detectar la producción de ROS en células de mamífero phagosomal 5. Sin embargo, el enfoque basado en el lector de microplacas sólo puede dar una curva de generación de ROS promedio de una población de células. Con el presente protocolo, mediante el uso de Dictyostelium, un fagocito profesional, y condiciones experimentales optimizadas, obtenemos la fagocitosis estable y eficiente, sin conjugar cualquier opsonina sobre las perlas. DHE se ha utilizado en diversos sistemas modelo, como los neutrófilos y los macrófagos de mamíferos, para detectar la producción de ROS 6-9. Mientras tanto, existen algunas controversias acerca de la especificidad y sensibilidad del método de 8,10. Como una versión mejorada de Amplex Red, la intensidad de fluorescencia de AUR es menos sensible al pH, que lo hace más adecuado para medirROS en ambientes no neutrales o ligeramente ácidos. AUR se ha aplicado recientemente en varios sistemas de mamíferos 11,12, pero su uso en modelos no mamíferos, que muy a menudo requieren medios de crecimiento débilmente ácido, no se ha informado todavía. Además, no hay ningún protocolo publicado para medir cuantitativamente y dinámicamente la producción de ROS y la localización en la ameba social de Dictyostelium.
El objetivo del conjunto de protocolos presentado es proporcionar una solución sencilla y versátil para controlar diversos ROS y su localización, y además dar una visión de los mecanismos celulares relacionados con el ROS. Para el ensayo de OBG, se utilizó la microscopía en vivo para supervisar todo el proceso de generación de ROS phagosomal después de la absorción de perlas revestidas de OBG por células de Dictyostelium, y nos proporcionó un nuevo enfoque para estudiar el mecanismo de la muerte intraphagosomal de bacterias. Hemos optimizado DHE y AUR ensayos de mediano rendimiento en Dictyostelium, para medir superóxido intracelularIDE y H extracelular 2 O 2 de producción, respectivamente, mediante el uso de LPS como un estimulador potente de ROS. Tenga en cuenta que el LPS se demostró recientemente para aumentar la actividad bactericida de Dictyostelium hacia bacterias fagocitadas 13. Además, el tratamiento con DEDTC y catalasa confirmó explícitamente que estos dos métodos de medir específicamente los diferentes tipos y localizaciones subcelulares de ROS en Dictyostelium. Por último, el ensayo de OBG se puede adaptar a cualquier célula fagocítica adherente, por opsonizantes aún más las perlas con ligandos para receptores de células fagocíticas animales. En principio, los ensayos DHE y AUR también puede ser ajustado para mediciones en cualquier celular adherente o no adherente en condiciones experimentales adecuadas.
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Protocol
1. La visualización y valoración cualitativa de ROS producción en Fagosomas
Las perlas recubiertas con OBG deben estar preparados de antemano. Los procedimientos de revestimiento cuentas y técnica de superposición de agar fueron adaptadas de referencias publicadas 5,14.
- Añadir 1 ml de suspensión de 3,0 micras perlas de sílice carboxilados (alrededor de 1,8 x 10 9 bolas) a un tubo de 1,5 ml, se lavan las perlas 3 veces con 1 ml de PBS por vuelta rápida y vórtex.
- Resuspender las perlas en 1 ml de PBS que contenía 25 mg / ml de cianamida (para activar las perlas de sílice carboxilados unen covalentemente a premarcan BSA), incubar en una rueda durante 15 min.
- Lave 3 veces con 1 ml de tampón de acoplamiento (0,1 M de borato de sodio, pH 8,0) por vuelta rápida (centrifugar a toda velocidad en una mini centrífuga de sobremesa durante 5 segundos o bien se centrifuga a 2000 × g durante 1 min en una centrífuga de mesa) y vortex para eliminar el exceso de cianamida.
- Mezclar las perlas lavadas con 500 l de coupling tampón que contiene 1 mg de OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, llenar el tubo con gas nitrógeno a partir de un estándar de gas-can antes de la limitación, y incubar en una rueda de 14 horas (durante la noche) a TA en la oscuridad.
- Lavar las perlas 2X con 1 ml de tampón de enfriamiento (250 mM de glicina en PBS) para eliminar sin reaccionar OBG, y dos veces con tampón de acoplamiento para eliminar el tampón de enfriamiento rápido por vuelta rápida y agitación en vórtex.
- Añadir 1 ml de tampón de acoplamiento que contienen 50 g de Alexa Fluor 594 éster de succinimidilo para conjugar a BSA. Llenar el tubo con nitrógeno antes de la limitación, e incubar en una rueda durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de extinción por vuelta rápida y un vórtex para detener la reacción, después se lavan las perlas 3 veces con 1 ml de PBS por vuelta rápida y vórtex.
- Finalmente, resuspender las perlas en 1 ml de PBS con 2 l de 10% w / v de azida para el almacenamiento a largo plazo. Mida la concentration de cuentas en la suspensión con un hemocitómetro (generalmente alrededor de 1-2 x 10 9 cuentas / ml), llenar el tubo con nitrógeno antes de la limitación, y se almacena a 4 ° C en la oscuridad.
- La eficacia del recubrimiento de la fluoresceína OBG se puede probar mediante la comprobación del espectro de emisión usando excitación a 500 nm. Cuando se oxida por H 2 O 2 en la presencia de peroxidasa de rábano picante (HRP), la intensidad de fluorescencia de perlas oxidados, en el pico de emisión (538 nm), es 11-12x mayor que el de perlas recubiertas no oxidado.
- Cosecha en crecimiento exponencial Dictyostelium células de una placa de Petri de 10 cm, la placa de diferentes densidades de células de 3 cm de platos con un plástico ópticamente transparente o con fondo de cristal, y crecer durante la noche. Elija los platos que son aproximadamente el 80% de confluencia para el experimento. Un protocolo detallado para el cultivo de células de Dictyostelium ha sido publicada 15.
- Sustituya el medio de cultivo con medio LoFlo (medio LF), incubar2 horas antes del experimento con el fin de disminuir la autofluorescencia extracelular y intraendosomal del medio de cultivo HL5C.
- En paralelo, derretir 10 ml de 1,5% de agar Bacto en medio LF, verter el agar en una superficie plana (es decir, una placa de vidrio de 10 cm x 10 cm) con el fin de formar una capa de agar sobre 1 mm de espesor, esperar a 10-15 min se solidifique. Cortar la capa de agar en 2 cm x 2 cm cuadrados y colocar en medio de LF para su uso posterior.
- Mientras tanto, preparar el hilado de disco o ancho microscopio de campo, ajuste la temperatura de la cámara climática a 22 ° C y ajuste la configuración para este experimento. (Ver comentarios adicionales en la discusión).
- Después de 2 horas de incubación, aspirar el medio de LF desde el plato de 3 cm, pero la monocapa de células todavía debería estar cubierta por una película fina de medio. Diluir las perlas recubiertas con 1,5 x 10 7 perlas / ml, y añadir 10 l en la capa de células.
- Tome una hoja de agar cuadrado, drenar el exceso de líquido, pero mantener húmeda. Coloque cuidadosamente the cuadrada de agar en la parte superior de la capa de células. No mueva la plaza agar cuando se está tumbado en las células. La capa de agar se utiliza para aumentar el contacto entre los granos y las células, mejorando de este modo la absorción, y también comprime ligeramente las células, manteniéndolos mejor en el plano focal del objetivo.
- Coloque la tapa sobre el plato, colóquelo en la platina del microscopio, y automáticamente tomar fotos en los canales rojo, verde y fase cada 1 min durante 2 horas o más.
- Seleccione y centrarse en los eventos celulares que contienen todo el proceso de fagocitosis. Combinar los 3 canales optimizados y montar las imágenes en una película utilizando el software profesional de procesamiento de imágenes. Cuantificar intensidades de fluorescencia de cada uno de los granos seleccionados en los canales rojo y verde, y la proporción de verde / rojo reflejará la phagosomal dinámica de ROS producción de las células.
2. Cuantitativa y Medianas rendimiento Medición de la Producción intracelular superóxido
- Recoger oNE 80% plato confluente de Dictyostelium en 10 ml de medio HL5C. Centrifugar las células de Dictyostelium a 850 xg durante 5 min, con cuidado y exceso de medio completamente aspirado. Resuspender las células en tampón de SS6.4 [sorbitol 0,12 M en tampón de Sorensen (14,69 mM KH 2 PO 4 y 6,27 mM de Na 2 HPO 4), pH 6,4], contar las células y diluir hasta una densidad final de 6 x 10 6 células / ml (ver comentarios adicionales en la discusión).
- Añadir 50 l de suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos no transparente blanco (ver comentarios adicionales en la discusión).
- Diluir DHE de stock (30 mM en DMSO) 500 veces con SS6.4, pipeta de 50 l de DHE diluido en cada pocillo usando una pipeta multicanal si es necesario. La concentración final de DHE es 30 mM. La reacción se inicia inmediatamente.
- Los estímulos o inhibidores se pueden añadir en este punto, o en otros puntos de tiempo de acuerdo a las necesidades específicas.
- Utilice el punto de "la lectura y # top final34; modo de un lector de microplacas de fluorescencia, con excitación de fluorescencia / emisión a 522 nm/605 nm, leer cada 2 min durante 1 h, medio batido de 5 seg / min, a 22 º C.
3. Cuantitativa y de alto rendimiento La medición de extracelular H 2 O 2 de producción
- Siga los mismos pasos que se describen en el punto 2.1 y 2.2.
- Preparar HRP diluido añadiendo 5 l de HRP de valores (100 U / ml en agua destilada) en 10 ml de SS6.4, vórtice o invertir el tubo para mezclar bien y mantener en hielo para su uso posterior. La solución de HRP diluida es a 0,05 U / ml.
- Preparar la mezcla de reacción AUR mediante la mezcla de la población de AUR (mM AUR 10 en DMSO) y la solución de HRP diluida en tampón de SS6.4 a las concentraciones finales de 6,25 mM, y 0,005 U / ml, respectivamente. Como un ejemplo, para preparar la mezcla de reacción para 40 reacciones, mezclar 1,600 l de SS6.4 con 400 l de HRP diluido y 2,5 l de solución madre de AUR.
- Añadir 50 l de mezcla AURtura en cada pocillo usando una pipeta multicanal si es necesario. Ahora comienza la reacción.
- Los estímulos o inhibidores se pueden añadir en este punto, o en otros puntos de tiempo de acuerdo a las necesidades específicas.
- Utilice el punto de modo extremo "top lectura" de un lector de placas de micro fluorescencia, con la excitación de fluorescencia / emisión a 530 nm/590 nm, leer cada 2 min durante 1 hora, medio batido 5 s / min, a 22 º C.
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Representative Results
La generación de ROS en los fagosomas se puede visualizar cualitativa y dinámicamente por microscopía (S1 del archivo). La fluorescencia roja emitida por Alexa Fluor 594-es insensible al pH y se mantiene constante en el medio ambiente phagosomal, mientras que la oxidación de OBG aumenta su fluorescencia en el canal verde. Los espectros de emisión de in vitro oxida y perlas recubiertas con OBG no oxidado se comparan en la Figura 1B, que muestra un aumento significativo de la intensidad después de la oxidación. Para facilitar la visualización de los eventos en directo, los dos canales se combinan y los cambios de color resultantes de rojo a naranja durante la fagocitosis por las células de tipo salvaje AX2 dentro de 1 min de la absorción. El aumento de la fluorescencia verde indica la generación de ROS, posiblemente, directamente en el fagosoma. Mediante el uso de un lector de microplacas, de mediano rendimiento medición cuantitativa de superóxido intracelular y extracelular H 2 O 2 de producción se muestran en la Figure 2C y la Figura 3B, respectivamente. La producción basal de las células ROS AX2, posiblemente de metabolismo-óxido reductora regular, se puede medir. Cuando las células son estimuladas con LPS, las señales para la producción de ROS se incrementan de manera significativa en ambos ensayos. Además, en el ensayo DHE, la disminución de la fluorescencia azul (dihydroethidium) y el incremento de fluorescencia roja (señales de etidio) están inversamente correlacionados, como se esperaba. La localización de la producción de ROS se mide tanto por DHE y ensayos de AUR se confirman en la Figura 2D y la Figura 3C, respectivamente. La adición de DEDTC (una membrana permeable superóxido dismutasa (SOD) inhibidor) 16, el aumento de la señal de DHE y la disminución de la señal de AUR de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que DEDTC provocó la acumulación de la superóxido sustrato SOD y el agotamiento del producto SOD H 2 O 2 esperada de la reacción se muestra en la Figura 2A. Lalternatively, mediante la adición de catalasa (una membrana impermeable a H 2 O 2 inhibidor de la fluorescencia), la señal de superóxido intracelular de ensayo DHE no se vio afectada, mientras que el H 2 O 2 extracelular de la señal de ensayo de AUR disminuyó de una manera dependiente de la dosis.
Figura 1. Principio y el uso del ensayo de OBG (OxyBurst verde). A) fluoresceína OBG y Alexa Fluor 594 se acoplan covalentemente a la superficie de 3 m perlas de sílice a través de BSA. La emisión de fluorescencia de fluoresceína OBG indica la oxidación por ROS, mientras que la señal de Alexa Fluor 594 ayuda a localizar las perlas y sirve como control para la cuantificación de la fluorescencia. B) Ensayo in vitro para la eficacia del recubrimiento. H 2 O 2 y HRP se utilizan para oxidar las perlas recubiertas in vitro. Bajo excitabilidadación a 500 nm, las perlas oxidados muestran un pico de emisión significativa a 538 nm en comparación con la de los granos no oxidado, con una relación de intensidad de por lo menos 11-12 veces.
Figura 2. Principio y el uso del ensayo DHE (Dihydroethedium). A) Resumen de las reacciones bioquímicas relacionadas con DHE y AUR ensayos. B) en el citoplasma, la membrana permeable DHE tiene excitación y emisión picos a 370/420 nm, respectivamente. Como resultado de la oxidación por superóxido, de etidio es capaz de intercalarse en el ADN nuclear y mitocondrial y se ha desplazado de excitación y emisión picos a 522/605 nm, respectivamente. La intensidad de fluorescencia de etidio se corresponde con la cantidad de la producción de superóxido en el interior de las células. C) Un representante experimento demuestra que, cuando son estimuladas con LPS, el super dinámicola producción de óxido a partir de células AX2 es significativamente mayor que el nivel basal de las células no estimuladas AX2 y el fondo de la reacción en tampón. La disminución de la fluorescencia azul y el aumento de fluorescencia de color rojo se correlacionan inversamente como se esperaba. D) Cuando se tratan con diversas concentraciones de DEDTC (un inhibidor de la superóxido dismutasa permeante de membrana), la pendiente (RFU / min) de etidio aumentos de la producción en una dosis- forma dependiente, mientras que el tratamiento con catalasa (a impermeant membrana H 2 O 2 extintor) no afecta a la producción de superóxido. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Principio y el uso del ensayo de AUR (Amplex UltraRed). A) La membrana AUR impermeant can ser oxidado en su forma fluorescente resorufina, RAO-buey, por H 2 O 2 en la presencia de una peroxidasa (de excitación y de emisión de picos a 530 y 590 nm, respectivamente). La intensidad de fluorescencia de AUR-buey corresponde a la cantidad de H 2 O 2 producido fuera de las células. B) Un experimento representativo muestra que, cuando son estimuladas con LPS, la dinámica H 2 O 2 de producción a partir de células AX2 es significativamente más alta que la basal nivel de las células no estimuladas AX2 y la reacción de fondo. C) Cuando se tratan con diversas concentraciones de DEDTC o catalasa, la pendiente (RFU / min) de RAO-ox disminuye la producción de una manera dependiente de la dosis, debido a la inhibición de H 2 O 2 la producción de superóxido intracelular y extracelular agotamiento de H 2 O 2, respectivamente. Haga clic aquí para ver más grandefigura.
S1 archivo. Película de la dinámica de producción de ROS en las células phagosomal Dictyostelium. La película de lapso de tiempo se registró durante 40 minutos por microscopía en vivo, con un aumento de 60X. Durante el primer minuto después de la absorción por fagocitosis, la fluorescencia de la fluoresceína OBG perlas recubiertos cambió de rojo a naranja brillante, lo que indica que las ROS fueron probablemente produce directamente dentro de los fagosomas. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
En comparación con los métodos descritos anteriormente, el ensayo de OBG visualiza dinámicamente el proceso de phagosomal la generación de ROS en el nivel de células individuales, en lugar de medir una señal promedio de ROS de una población de células. Tales métodos población de promediación tienden a oscurecer la información crítica causada por la fagocitosis no sincrónico. Se adaptó con éxito los ensayos DHE y AUR a Dictyostelium y optimizado los protocolos. Lo más importante es que hemos especificado los tipos y localizaciones subcelulares de ROS medidos por estos dos ensayos. En conjunto, todo el conjunto de protocolos de medición de ROS para Dictyostelium proporciona un sistema útil y potente para estudiar los mecanismos celulares relacionados con ROS, tales como la inmunidad innata, la diferenciación celular y la señalización intracelular.
Para el ensayo de OBG, la preparación de perlas recubiertas es crítico para el éxito del experimento. Debido a la complejidad de la captación mediada por receptor fagocítico en mamíferosn celular, las partículas necesitan ser opsonizado (por ejemplo, con las IgG) para activar la ingestión. Baja eficiencia de captación en las células de mamíferos limita severamente la visualización de las pruebas individuales de la generación de ROS phagosomal. Se ha observado La tasa de fagocitosis en Dicytostelium ser 10-20 veces mayor que en un macrófago 17, y con el presente protocolo, se obtiene la fagocitosis robusto y eficiente sin conjugar cualquier opsonina sobre las perlas. Esto no sólo simplifica el procedimiento de talón-recubrimiento, pero reduce los riesgos de oxidación del colorante fluoresceína OBG durante la manipulación. Desde OBG fluoresceína puede ser oxidado por la luz y el oxígeno, el reactivo debe ser protegida de la exposición a la luz ambiente y el aire tanto como sea posible (por ejemplo, utilice papel de aluminio para cubrir el tubo, y llenar el tubo con nitrógeno u otro gas inerte) especialmente para el almacenamiento a largo plazo.
Para imágenes en vivo, las células se pueden sembrar en diversos platos con c ópticamentefondos Lear. Mientras Dictyostelium se adhiere ligeramente mejor al plástico, la mayoría de células de mamífero (véase a continuación) se adhieren igualmente bien al vidrio. Otro paso importante para la formación de imágenes óptima es incubar las células de Dictyostelium en medio de LF (baja fluorescencia de fondo) durante al menos 2 horas antes de proceder a los pasos de formación de imágenes. Debido a que la señal de fondo de fluorescencia verde del medio de cultivo (HL5C) necesita ser empobrecido de sus compartimientos endosomal para evitar la interferencia con la señal generada a partir de perlas recubiertas oxidados. También recomendamos realizar al menos una experiencia piloto para optimizar los ajustes del microscopio (por ejemplo, la intensidad del láser, el tiempo de exposición, etc), especialmente para el canal verde. Las cuentas constantemente emiten fluorescencia roja fuerte durante todo el experimento, pero la fluorescencia verde aumenta tras la reacción con ROS inmediatamente después de la fagocitosis y mesetas dentro de 5-10 min. Por lo tanto, es mejor ajustar la configuración de la gReen canal cerca del final del experimento, cuando la fluorescencia verde de la mayoría de las perlas puede ser totalmente visualizada. Una vez que los ajustes se optimizan, guardarla para futuros experimentos con el fin de obtener resultados reproducibles.
Durante el ensayo de OBG, las células sanas deben continuar su motilidad azar y no redondear. De lo contrario, esto es indicativo de daño celular, que puede ser causada o bien por el secado de la capa de agar o por la intensidad del láser excesiva. Por lo tanto, mantener suficiente líquido en la capa de agar para la duración de todo el experimento y también mantener la intensidad del láser y el tiempo de exposición lo más baja posible.
En los ensayos de AUR y DHE, la pendiente de las curvas de lectura de fluorescencia muestra una relación dependiente de la dosis a la cantidad de células utilizada en cada pocillo dentro de un cierto rango. Con el fin de lograr los resultados más reproducibles, es imprescindible el uso de número idéntico de células para cada condición de un experimento. Además,debido a las variaciones en el tamaño celular entre diferentes tipos de células, es muy recomendable que durante los experimentos piloto, diferentes diluciones se ponen a prueba para obtener una monocapa de células después de la fijación en la parte inferior así. Para las células AX2 Dictyostelium, 3 x 10 5 células forman una monocapa y esta densidad celular también se aplica a muchas otras de tipo salvaje y mutante cepas Dictyostelium. Con el fin de obtener los recuentos de células precisas, lo mejor es contar después de la centrifugación, no antes, ya que la centrifugación y resuspensión de pellets pueden causar cierta pérdida de células. Utilizamos un contador de células automatizado para contar después de resuspender el sedimento de células (que funciona mejor con densidades de células por encima de 6 x 10 6 células / ml), luego se diluye con precisión las muestras de células a 6 x 10 6 células / ml.
Para los ensayos DHE y AUR, señales de baja podría ser debido al uso de placas de 96 pocillos no óptimas, y por lo tanto, le recomendamos que utilice no transparentes placas de 96 pocillos blancos. En comparación con el negro o transparenteplacas rentes, la señal fluorescente capturado se intensifica por la reflexión sobre la superficie blanca, lo que aumenta en gran medida la relación señal-ruido. El inconveniente de las placas blancas no transparentes es, a veces, las señales fluorescentes fuertes pueden tener fugas en los pozos vecinos. Sin embargo, mediante el uso de 100 l de volumen de reacción y la concentración de la sonda descrita, no detectamos ninguna señal de la fuga en tanto DHE y ensayos de AUR. Además, se recomienda la realización de algunos experimentos piloto para optimizar la sensibilidad de la fluorescencia del lector de placas. Tomando el lector de placas SynergyMX como ejemplo, la sensibilidad 100 y 70 funcionan mejor para el ensayo DHE y AUR, respectivamente. Por otra parte, es importante para controlar la excitación y espectros de emisión específico en las condiciones del experimento, con las células. De hecho, hemos observado un desplazamiento del máximo de emisión para AUR a 590 nm, en comparación con los 581 nm mencionadas por el fabricante. Finalmente, se obtuvieron resultados ligeramente mejores excitando a 530 nm en lugar de 568nm sugerido por el fabricante.
En comparación con una solución de stock AUR, la solución madre de DHE es mucho más propensos a la oxidación, incluso cuando está protegido de la luz a -20 ° C. Por lo tanto, es mejor utilizar la acción de DHE dentro de 10 días después de la disolución del polvo. Si el color de la solución cambia de gris a púrpura o rosa, desecharlo y preparar fresca de polvo 18.
En el ensayo de AUR, tanto AUR y HRP podrían ser absorbidos por macropinocytosis. Por lo tanto, la señal fluorescente resultante de la oxidación de H 2 O 2 puede también parcialmente se genera en el interior de los macropinosomes. Sin embargo, desde el AUR y HPR no penetran las membranas celulares, la señal medida en el interior de los macropinosomes por el ensayo de AUR es todavía topológicamente equivalente a una señal extracelular, en lugar de una señal generada en el citosol.
Sobre la base de una serie de pruebas preliminares para ambos ensayos DHE y AUR,parece importante utilizar un tampón simple que no contiene glucosa u otros componentes de los medios biológicos, debido a que interfieren fuertemente con ambos ensayos y dan como resultado una señal fluorescente artefactual alta. Por lo tanto, usamos tampón de fosfato de Sorensen complementado con 0,12 M de sorbitol, un osmolito no digerible se utiliza para establecer una osmolaridad similar a la del medio de cultivo de Dictyostelium 19. Tenga en cuenta que el alto contenido de sal de tampones iso-osmótica utilizados para las células de mamíferos, tales como PBS, es perjudicial para Dictyostelium.
Los protocolos que aquí se presentan no pueden medir todos los posibles ROS, tales como el hipoclorito, radicales hidroxilo y oxígeno singlete, y sus localizaciones subcelulares. Una imagen más completa de la generación de ROS todavía está limitado por la disponibilidad y el desarrollo de sondas específicas.
Este conjunto de protocolos se puede adaptar fácilmente a otras células, incluyendo los fagocitos de mamíferos, con la siguiente MODIFICción. Por ejemplo en el ensayo de OBG, medio sin FCS y rojo de fenol se puede utilizar para obtener una baja fluorescencia de fondo. En los ensayos de DHE y AUR, tampón PBS se puede utilizar en lugar de SS6.4, y el número de células sembradas en cada pocillo para obtener una capa confluente se puede adaptar por ensayo y error, de acuerdo a su tamaño. Las concentraciones de HRP, RAO y DHE también se pueden optimizar en experimentos piloto con el fin de lograr los resultados más sensibles. Sin embargo, los posibles efectos adversos de DMSO deben ser probados utilizando mayores concentraciones de AUR y / o reactivos DHE. Hemos probado DHE y AUR ensayos con éxito con otro protozoo, Acanthamoeba castellanii y con una línea de ratones de células microglia BV2. Además, los ensayos DHE y AUR también se puede utilizar para medir la generación de ROS durante la interacción huésped-patógeno, por ejemplo durante la infección de Dictyostelium o por Acanthamoeba marinum micobacterias.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres Karl-Heinz Krause y Vincent Jaquet ayuda y consejo para establecer estos protocolos, y también gracias a Christoph Bauer y Jérôme Bosset de la Plataforma Bioimaging del NCCR y el Dr. Navin Gopaldass por su apoyo técnico. La investigación es apoyada por una beca ProDoc de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
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