Article de méthode

Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

DOI :

10.3791/50772

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23 septembre 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une méthode pour rapide, l'immobilisation réversible de petites molécules et des ensembles de nanoparticules fonctionnalisées pour résonance plasmonique de surface (SPR) des études, utilisant séquentielle sur puce chimie de cycloaddition bioorthogonal et anticorps-antigène capture.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procédés d'immobilisation de surface rapide de petites molécules bioactives avec contrôle sur l'orientation et la densité d'immobilisation sont hautement souhaitable pour les applications de biocapteurs et biopuces. Dans cette étude, nous utilisons une liaison covalente bioorthogonal très efficace [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) pour permettre l'immobilisation de molécules microfluidique TCO / Tz-dérivées . Nous surveillons le processus en temps réel dans des conditions d'écoulement continu à l'aide de la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour permettre l'immobilisation réversible et d'étendre la gamme expérimentale de la surface du capteur, on combine un composant de capture d'antigène-anticorps non covalente avec la réaction de cycloaddition. En présentant alternativement TCO ou Tz fragments à la surface du capteur, plusieurs processus de capture-cyclo sont désormais possibles sur une surface de capteur pour montage et d'interaction sur puce études d'une variété de structures multi-composants. Nous illustrate cette méthode avec deux expériences différentes d'immobilisation sur une puce de biocapteur; une petite molécule qui se lie, AP1497 FK506-binding protein 12 (FKBP12), et la même petite molécule dans le cadre d'une nanoparticule fonctionnalisée situ immobilisé et dans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Réactions de conjugaison efficaces sont des outils précieux pour la fixation de molécules bioactives de surfaces pour une variété d'applications de la biotechnologie. Récemment, le bioorthogonal très rapide [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) a été utilisé pour marquer la surface des cellules, des structures sous-cellulaires, les anticorps et les nanoparticules 1. - 7 Ici, nous utilisons la réaction [4 +2] de cyclo en combinaison avec capture antigène / anticorps (TPS / anti-GST) pour la synthèse de structures multi-composants pour résonance plasmonique de surface (SPR) analyse de l'interaction réversible sur puce et de surveiller la processus en temps réel (Figure 1). 8,9 En particulier, la stratégie de capture-cycloaddition permet la régénération de la surface en utilisant un protocole établi. 8 En conséquence, l'assemblage de surfaces de détection stables avec le contrôle de l'orientation du ligand et de la densité pour la variété de nouvelle épreuve formats est désormais possible. Utilisationcette stratégie, nous avons démontré l'immobilisation de petites molécules TCO / Tz-dérivatisés et de caractériser les taux de cycloaddition dans une variété de conditions de tampon. Nous avons choisi l'interaction connue entre FKBP12 et un AP1497 molécule qui se lie à FKBP12 10 à 12, par exemple, pour vérifier que la stratégie de capture-cycloaddition conserve la capacité de la petite molécule d'interagir avec sa cible lorsque soit lié directement à des antigènes immobilisés sur la TPS ou à des nanoparticules immobilisées (PN).

Cette méthode présente plusieurs avantages. Premièrement, l'immobilisation réversible de petites molécules sur des puces de capteur est à présent possible. Deuxièmement, TCO / Tz immobilisation de petites molécules permet également des études d'interaction sans étiquette qui renversent l'orientation des études SPR canoniques, et peut fournir une vue complémentaire d'une interaction de liaison. Troisièmement, cette méthode permet la synthèse de nanoparticules ciblées microfluidique, et l'évaluation immédiate de leur binding propriétés. Cela promet d'améliorer l'efficacité de l'évaluation ou de dépistage nanoparticules ciblées, et aussi diminuer les quantités de nanoparticules nécessaires. 13-15 Quatrièmement, cette approche permet de mesurer la cinétique de réaction des réactions de cycloaddition bioorthogonal en temps réel sous flux continu. Enfin, l'immobilisation de la chimie TCO / Tz est robuste en présence de sérum. Dans l'ensemble, nous prévoyons que cette approche polyvalente sera largement faciliter la construction de surfaces de capteurs stables pour une grande variété d'études microfluidiques avec pertinence à in vitro et dans des applications cellulaires in vivo.

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Protocole

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Une. Préparation de la TPS et de nanoparticules (NP) conjugués

  1. TPS-TCO préparation:
    1. Ajouter 8 pi de solution TCO-NHS (50 mM dans du DMSO) à 100 pi de TPS (1 mg / ml dans du PBS) et agiter le mélange à la température ambiante pendant 1 heure.
    2. Enlever l'excès de réactif en utilisant une colonne spin dessalage Zeba. Le filtrat récupéré contenant le conjugué GST-TCO est stocké à 4 ° C avant utilisation.
  2. TPS-Tz préparation:
    1. Ajouter 6 ul de solution Tz-NHS (25 mM dans du DMF) à 75 ul de GST (1 mg / ml dans du PBS) et agiter le mélange à température ambiante pendant 1 h.
    2. On dilue le mélange réactionnel avec 25 pi de PBS et on purifie en utilisant une colonne de dessalage de spin. Le filtrat contenant le conjugué GST-Tz est stocké à 4 ° C avant utilisation.
    Remarque: les analyses de masse (MALDI-TOF) ont montré que, en moyenne ~ 10 molécules Tz ou TCO ont été conjugués à la TPS.
  3. NP-TCO préparation:
    1. Ajouter 100 ul de solution TCO-NHS (50 mM dans du DMSO) à150 pi de nanoparticules aminé (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml dans du PBS, 3 nm noyau de fer ~ 8000 Fe / NP) et serrent mélange à la température ambiante pendant 1 heure.
    2. Enlever l'excès de réactif par filtration sur gel en utilisant une colonne NAP-10 éluée avec du tampon PBS. Recueillir la bande de couleur contenant le produit NP-TCO.
    3. On concentre le filtrat jusqu'à un volume final de ~ 150 ul en utilisant un dispositif de filtration centrifuge (100 k MWCO).
    4. Ajouter 50 ul d'anhydride succinique, (0,1 M dans du DMSO) à la solution NP-TCO et agiter à température ambiante pendant 1 heure (anhydride réagit avec des amines restantes pour former des acides carboxyliques terminaux. Cela empêche les interactions non spécifiques avec la surface de dextran).
    5. Purifier le produit NP-TCO en utilisant une colonne NAP-10 en éluant avec PBS. Conserver la solution de NP-TCO à 4 ° C avant de l'utiliser.

2. Préparation de la surface

Toutes les analyses de résonance de plasmon de surface sont effectuées sur un instrument Biacore T100 (GE Healthcare) à25 ° C à l'aide d'une puce de capteur CM5 et du PBS-P en tant que courant de tampon, sauf indication contraire. Contrôle Biacore et logiciels d'évaluation fourni avec l'appareil sont utilisés pour la mise en place des expériences et l'analyse des données. Deux modes de fonctionnement, assistants de l'application et l'exécution manuelle seront utilisés pour la préparation de la surface et de surveillance sur la puce de capture-cyclo. Le mode méthode de constructeur sera utilisé pour la mise en place des expériences de liaison d'orientation inverse et pour mesurer les taux de réaction de cycloaddition. Les données sont double référence soustrait et analyses cinétiques sont réalisées en utilisant un modèle de liaison 01:01 Langmuir.

  1. Utilisez le modèle de l'assistant amine d'immobilisation et sélectionnez l'immobilisation sur des cellules de flux 1 (référence) et 2 (détection). Procédé modifier amine pour activer les groupes carboxyliques en surface par injection d'une solution 1:1 de 0,4 M EDC: 0,1 M NHS pour 480 secondes à un débit de 10 ul / min. Réglez l'injection d'éthanolamine pour étancher autres esters activés à 420 secondes de temps de contact auun débit de 10 ul / min.
  2. Nom de l'entrée de ligand, anti-TPS (18 pg / ml dans un tampon d'acétate, pH 5,0) et mis à injecter pour un temps de 420 secondes de contact à une vitesse de 10 pi / min.
  3. Placez les flacons de solution requis en réactif rack 2 en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer et commencer immobilisation.
    Remarque: L'exécution de l'assistant d'immobilisation de cette manière entraîne des niveaux d'immobilisation anti-TPS de l'ordre de 14.000 à 17.000 ~ RU.
  4. Modifier l'assistant d'immobilisation à n'introduire que ligand de TPS (20 pg / ml) solution pour 420 secondes à 5 l / min de débit sur cellule de référence 1.

3. Surveillance sur puce Capture-cycloaddition de molécules fonctionnalisés

  1. Suivi sur puce capture cycloaddition en temps réel (Figure 2).
    1. Placer GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) et de régénération (glycine 10 mM, pH = 2,0) dans des flacons de solution de réactif rack 2. Sélectionnez l'hommeméthode run manuel, régler le débit à 5 l / min et le chemin de flux Flow cellule 2.
    2. Injecter la solution de TPS-TCO pour 420 sec.
    3. Injecter la solution de Tz-BnNH 2 pour 600 sec.
    4. Régénérer la surface avec deux injections de 30 sec de la solution de régénération.
  2. Ensemble de surveillance sur la puce de structures multi-composants en temps réel (figure 3):
    1. Placer GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 pg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) et de régénération (glycine 10 mM, pH = 2.0) de la solution dans des flacons de réactif rack 2. Sélectionnez la méthode d'exécution manuel de l'instrument, régler le débit à 5 l / min et le trajet d'écoulement à débit cellulaire 2.
    2. Injecter une solution de TPS-Tz pendant 60 secondes.
    3. Injecter une solution de NP-TCO pour 60 sec.
    4. Injecter une solution de Tz-BnNH 2 pendant 60 secondes.
    5. Régénérer la surface avec deux injections de 30 sec de la solution de régénération.

4. MSUIVI Immobilisation densité et la détermination de Cycloaddition Tarifs

  1. Caractérisation des petites vitesses de réaction de cycloaddition molécules (figure 4).
    1. Sélectionnez nouvelle méthode d'entrée et de paramètres généraux. Dans le panneau étapes du dosage de créer une nouvelle étape et nommez-échantillon. Définir le but et Connectez paramètres de base d'échantillons.
    2. Dans le panneau Types de vélo Créer une nouvelle étape du cycle et insérer les commandes suivantes: capture, l'échantillon, Régénération 1 et régénération 2.
    3. Sélectionnez la commande de capture, le nom de ligand d'entrée (TPS-TCO, 20 pg / ml), le temps de contact de 120 secondes à 5 l / min et le chemin d'écoulement fixé à: Deuxième. Sélectionnez la commande de l'échantillon; entrée 180 temps de contact sec, 60 sec de temps de dissociation, débit 30 l / min et définit le chemin d'écoulement à: Les deux. Sélectionnez la commande de régénération 1; entrée régénération nom de la solution (10 mM de glycine-HCl pH 2,0), le temps de contact de 30 secondes à 30 pi / min et définit le chemin d'écoulement à: Deuxième. Répétez la même chose pour la régénération 2 commande.
    4. Run Setup Sélectionnez et réglez voie d'écoulement à: 2-1. Sélectionnez prochaine et remplir la liste de l'échantillon avec une solution d'analyte (Tz-BnNH 2) et la série de concentration (0,3-10 uM, dilution 1:2). Sélectionnez prochaine pour accumuler panneau de position. Lieu flacons de solution dans réactif rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. La liaison de données et l'analyse cinétique sont présentés dans la figure 4.
  2. Caractérisation des NP vitesses de réaction de cycloaddition (figure 4).
    1. Ouvrez le modèle de méthode enregistrée par le haut et modifier les paramètres suivants. Sélectionnez le panneau Acquisition, changement de nom ligand à la TPS-Tz, 20 pg / ml. Sélectionnez le panneau de l'échantillon; changement temps de contact à 120 secondes de temps de contact et le temps de dissociation à 120 sec.
    2. Sélectionnez la liste de l'échantillon; changer analyte à NP-TCO et série de concentration (7-224 nM, dilution 1:2). Flacons place de solutions dans l'armoire réactif2 et de la série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. La liaison de données et l'analyse cinétique sont présentés dans la figure 4.

5. Mesure de la liaison de FKBP12 à AP1497 immobilisée

Des études de liaison inverse emploient orientation-FKBP12 comme l'analyte et le composé AP1497 comme ligand immobilisé (Figure 5). La méthode générale de ce test est mis en place comme suit en utilisant l'outil de méthode constructeur:

  1. Sélectionnez nouvelle méthode d'entrée et de paramètres généraux. Dans le panneau étapes de l'analyse et de créer le nom de capture, d'exemples et de régénération étapes. Sélectionnez Objet correspondant et Connectez paramètres de base.
  2. Sélectionnez les types de cycle panneau et créer 3 étapes du cycle: Capture, exemples et de régénération.
  3. Insérez la commande de capture à deux reprises à l'étape du cycle de capture. Sélectionnez Capture 1 panneau et sélectionnez solution de capture comme variable, définir le temps de contact de 300 secondes à un débit de 5 l / min et le chemin d'écoulement fixé à: Deuxième. Sélectionnez le panneau Capture 2 et sélectionnez solution de capture comme variable régler le temps de contact de 250 s à une vitesse de 5 pi / min et le chemin d'écoulement régler le débit à: Deuxième.
  4. Insérez la commande de l'échantillon sous l'étape du cycle échantillon. Sélectionnez le panneau de l'échantillon; ensemble un temps de contact de 60 secondes, le temps de dissociation à 200 secondes à un débit de 30 l / min et définit le chemin d'écoulement à: Les deux.
  5. Insérer la commande de régénération en vertu de deux fois l'étape de cycle de régénération. Sélectionnez le panneau de régénération 1; entrée régénération nom de la solution (10 mM de glycine-HCl pH 2,0), le temps de contact de 30 secondes à 30 pi / min et définit le chemin d'écoulement à: Deuxième. Répétez la même chose pour le panneau de régénération 2.
  6. Run Setup Sélectionnez et réglez voie d'écoulement à: 2-1. Sélectionnez prochaines entrée et noms de solution de capture (TPS-TCO et AP1497-Tz), le nom de l'échantillon (FKBP12), série de concentrations (0,020 à 5 ug / ml, dilution 1:2) et MW (13 000). Lieu flacons de solution dans reagent rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. Les données d'analyse cinétique sont présentés dans la figure 5.

6. Mesure de la liaison de FKBP12 à AP1497 Attaché à immobilisée IP

La méthode générale de nanoparticules immobilisation, petite dérivation de molécule et essai de liaison FKBP12 est mis en place comme suit en utilisant l'outil de méthode constructeur:

  1. Ouvrez le modèle de méthode enregistrée par le haut et modifier. Insérez une commande de capture supplémentaires à l'étape du cycle de capture. Sélectionnez le 1 panneau de capture; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 1 (TPS-Tz). Set temps de contact de 60 secondes à un débit de 5 l / min et définit le chemin d'écoulement à la deuxième. Sélectionnez le panneau Capture 2; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 2 (NP-TCO). Régler le temps de contact de 90 secondes à une vitesse de 5 pi / min et débitchemin d'écoulement fixé à la seconde. Sélectionnez le 3 panneau Acquisition; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 3 (AP1497-Tz). Régler le temps de contact de 180 secondes à un débit de 5 l / min et définit le chemin d'écoulement à la deuxième.
  2. Run Setup Sélectionnez et réglez voie d'écoulement à: 2-1. Sélectionnez deux fois la prochaine. Lieu flacons de solution dans réactif rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. Les données d'analyse cinétique sont présentés dans la figure 5.

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Résultats

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Les données et les chiffres ont été adaptés de la référence 8.

Immobilisation réversible efficace de petites molécules bioactives avec un contrôle sur l'orientation et la densité joue un rôle clé dans le développement de nouvelles applications de biocapteurs. En utilisant la réaction bioorthogonal rapide entre TCO et Tz, nous décrivons une méthode pour l'ensemble de paliers et la régénération des surfaces de ligands avec maintien de l'activité biologique. Figure 2 montre le ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode de capture-cyclo décrit ici permet rapide, immobilisation réversible de nanoparticules modifiées et de petites molécules pour à puce interaction sans étiquette et des études cinétiques. Le protocole d'immobilisation peut être réalisée en quelques minutes nécessitant <10 uM concentrations de ligands de petites molécules. En modulant la concentration de ligand et les densités d'immobilisation de temps de contact peut être étroitement contrôlée. Nos données montrent que les réactions bioorthogonal sur...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous reconnaissons le financement du NIH (NHLBI contrat n ° HHSN268201000044C à RW, SH et SYS).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Reagent
Sensor Chip CM5GE HealthcareBR-1005-30  ;
Kit de raccord amineGE HealthcareBR-1000-50  ;
Kit de capture GSTGE HealthcareBR-1002-23  ;
NAP-10 ColonnesGE Healthcare17-0854-01  ;
GST, lyophilisé dans 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R& D Systems3777-FK  ;
Surfactant P-20GE HealthcareBR-1000-54  ;
Glycine 2.0GE HealthcareBR-1003-55  ;
Colonne de dessalage par spin ZebaThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4Filtre centrifuge FisherUFC810096100 K
TCO-OHRéf. 8Synthéqué en interne
TCO-NHSRéf. 8Synthétisé en interne, *Disponible dans le commerce chez Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Synthéqué en interne
Tz-NHSRéf. 8764701synthétisé en interne, *Disponible dans le commerce chez Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8synthétisé en interne
AP1497, AP1497-Tzréf. 8synthétisé en interne
Equipment
SPR BiosensorGE Soins de santéBiacore T100  ;

Références

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Mots-clés

Immobilisation microfluidiqueR sonance plasmonique de surfaceCapture de petites mol culesImmobilisation r versibleCapture antig ne anticorpsFonctionnalisation de nanoparticulesEssai de liaison SPRSuivi en temps r el

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