Des procédés pour la modulation et de l'analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

Summary

Des méthodes pour la manipulation et l'analyse des NF-kB-dépendante de l'hippocampe de la neurogenèse adulte sont décrits. Un protocole détaillé est présenté pour un test de comportement gyrus denté-dépendant (appelé le modèle spatial séparation Barnes labyrinthe) pour l'étude des résultats cognitifs chez la souris. Cette technique devrait également aider à permettre des enquêtes dans d'autres contextes expérimentaux.

Abstract

L'hippocampe joue un rôle essentiel dans la formation et la consolidation de la mémoire épisodique, et dans l'orientation spatiale. Historiquement, l'hippocampe adulte a été considérée comme une région anatomique très statique du cerveau des mammifères. Cependant, des études récentes ont démontré que le gyrus denté de l'hippocampe est une zone de très grande plasticité chez les adultes, impliquant non seulement les modifications de circuits neuronaux existants, mais aussi la neurogenèse adulte. Cette plasticité est régulée par des réseaux complexes de transcription, dans lequel le facteur de transcription NF-kB joue un rôle de premier plan. Pour étudier et de manipuler la neurogenèse adulte, un modèle de souris transgénique pour l'inhibition neuronale spécifique du cerveau antérieur de l'activité de NF-kB peut être utilisé.

Dans cette étude, des méthodes sont décrites pour l'analyse de la neurogenèse NF-kB-dépendante, y compris ses aspects structuraux, et l'apoptose neuronale progénitrice, la prolifération et la signification cognitive, which a été spécifiquement évaluée par un gyrus denté (la DG) dépendant test de comportement, la répartition spatiale séparation Barnes labyrinthe (SPS-BM). Le protocole SPS-BM pourrait être simplement adaptée pour une utilisation avec d'autres modèles animaux transgéniques destinés à évaluer l'influence de certains gènes sur la neurogenèse hippocampique adulte. En outre, SPS-BM pourrait être utilisé dans d'autres contextes expérimentaux visant à étudier et manipuler l'apprentissage DG-dépendante, par exemple, l'utilisation d'agents pharmacologiques.

Introduction

Ontologiquement, l'hippocampe est l'une des plus anciennes structures cérébrales anatomiques connues. Il est responsable de diverses tâches complexes, telles que les fonctions pivots dans la régulation de la mémoire à long terme, l'orientation spatiale, et la formation et la consolidation de la mémoire respective. Anatomiquement, l'hippocampe est constitué de couches de cellules pyramidales (stratum pyramidale), y compris la corne d'Ammon (CA1, CA2, CA3 et CA4) régions et le gyrus denté (gyrus dentatus), qui contient des cellules granulaires et quelques progéniteurs neuronaux dans sa zone sous-granulaire . Les cellules granulaires projettent vers la région CA3 via les fibres moussues dits (axones des cellules granulaires).

Jusqu'à la fin du siècle dernier, le cerveau des mammifères adultes a été considéré comme un organe statique manque plasticité cellulaire et la neurogenèse. Cependant, au cours des deux dernières décennies, un nombre croissant de preuves démontre clairement la neurogenèse adulte qui aura lieu dans au moinsdeux régions du cerveau, la zone sous-ventriculaire (SVZ) et la zone sous-granulaire de l'hippocampe.

Nos études antérieures, et ceux d'autres groupes, ont montré que le facteur de transcription NF-kB est un des régulateurs moléculaires essentiels de la neurogenèse adulte, et que ses résultats de-régulation dans de graves anomalies de l'hippocampe structurelles et des déficiences cognitives ^1-6. NF-kB est le nom générique d'un facteur de transcription inductible composé de différentes combinaisons dimères de cinq sous-unités de liaison à l'ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, et p65 (RelA), les trois derniers qui ont des domaines de transactivation. Dans le cerveau, la forme la plus abondant trouvé dans le cytoplasme est un hétérodimère de p50 et p65, qui est maintenu sous une forme inactive par inhibiteur de kappa B (IkB)-protéines.

D'étudier et de manipuler directement la neurogenèse NF-kB-entraîné, nous utilisons des modèles de souris transgéniques pour permettre simples inhibition de tous les subun NF-kBson, en particulier dans le cerveau antérieur ⁷ (voir la figure 1). À cette fin, nous Croisé les lignées de souris transgéniques suivantes, IKB / - et -/tTA. Le IKB transgénique / - ligne a été généré en utilisant un mutant négatif trans-dominant de NF-kB inhibiteur IκBa (super-répresseur IκBa-AA1) ^8. Contrairement à la IKBa de type sauvage, IKBa-AA1 a deux des résidus de sérine mutés en alanines (V32 et V36), qui empêchent la phosphorylation et la dégradation par le protéasome ultérieure de l'inhibiteur. Pour cerveau antérieur expression spécifique des neurones de la IκBa-AA1-transgène, IkB / - souris ont été croisées avec des souris hébergeant une kinase calcium-calmoduline-dépendante IIa (CAMKIIα)-promoteur qui peut être entraîné par trans-activateur tétracycline (TTA) ^9.

souris knock-out p65 ont un phénotype létal embryonnaire, en raison de l'apoptose massif du foie ^10, si l'approche présentée ici fournit une méthode éléganted'enquêter sur le rôle de NF-kB dans postnatale et la neurogenèse adulte.

Le test de comportement classique pour étudier l'apprentissage spatial et la mémoire a été décrit dans les années 1980 par Richard Morris, un test connu sous le nom d'eau de Morris (MWM) ^11. Dans ce champ ouvert eau-labyrinthe, les animaux apprennent à sortir de l'eau opaque sur une plate-forme cachée fondée sur l'orientation et extra-labyrinthe repères. Une variante sec de MWM est le labyrinthe Barnes dite (BM) ^12. Ce test utilise une plaque circulaire de 20 trous circulaires disposés à la frontière d'une plaque, avec un trou défini comme une boîte d'échappement, et des repères visuels extra-labyrinthe d'orientation. Les deux paradigmes expérimentaux reposent sur le comportement de vol induite par un rongeur de l `aversion pour l'eau, ou des espaces ouverts, illuminées. Les deux tests permettent une enquête de l'orientation spatiale, et la performance de mémoire liée. Bien que l'hippocampe joue un rôle essentiel et en général la formation de la mémoire spatiale, l'hippocampe rÉGIONS impliqués diffèrent selon le critère appliqué. La mémoire testé en BM découle de l'activité neuronale entre le cortex enthorinal (CE) et les neurones pyramidaux situés dans la région CA1-de l'hippocampe sans contribution de la DG ^13-16. En particulier, la BM classique repose principalement sur ​​la navigation par la voie temporo-ammonique monosynaptic de CE III CA1 à CE V. Surtout, la DG est cruciale impliquée dans la configuration dite reconnaissance spatiale ^17, ce qui implique non seulement le traitement des l'information visuelle et spatiale, mais aussi la transformation des représentations ou des souvenirs similaires dans différents, les représentations ne se chevauchent pas. Cette tâche requiert un circuit tri-synaptique fonctionnelle du CE II DG de CA3 de CA1 et CE VI, qui ne peuvent être testés dans le BM ^15.

Pour relever ces défis, nous avons conçu SPS-BM comme un test de comportement pour tester spécifiquement denté performances cognitives gyrus dépendant en coanimaux ntrol, et dans le modèle super-répresseur IKB / TTA suite à l'inhibition de NF-kB. Néanmoins, contrairement à la MWM ou la BM, le SPS-BM peut révéler des déficits comportementaux subtils résultant de la dépréciation de la neurogenèse. Depuis spatiale motif de séparation est strictement dépendante d'un circuit fonctionnel entre la CE II et la DG et CA3 et CA1 et CE VI, ce test est très sensible aux changements potentiels dans la neurogénèse, les modifications de la voie des fibres moussues ou altérations de l'homéostasie tissulaire au sein de la DG.

Techniquement, la mise en place de notre test est basé sur l'étude de Clelland et al., Dans lequel le motif de la séparation spatiale a été testé en utilisant un bois 8-bras bras labyrinthe radial (RAM) ^19. Dans notre set-up modifié, les huit bras ont été remplacés par sept maisons jaunes alimentaires identiques. En résumé, les méthodes présentées ici, y compris l'analyse de (DCX +) des cellules de doublecortine exprimant dans l'hippocampe, les projections de fibres moussues, neuronale cellule death et en particulier le SPS-BM présenté ici, peut être appliquée à des enquêtes sur d'autres modèles de souris comportant des transgènes qui ont un impact sur la neurogenèse adulte. D'autres applications peuvent inclure l'étude des agents pharmacologiques et mesurer leur impact sur le modèle de séparation DG et spatiale.

Protocol

Déclaration éthique

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les règlements de la commission des animaux et l'utilisation des soins gouvernementale, LANUV de l'état Rhénanie du Nord-Westphalie (Düsseldorf, Allemagne). Toutes les expériences animales ont été approuvés par LANUV, Düsseldorf sous le numéro de licence 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance et le nombre d'animaux requis pour l'étude.

Une. Protection des animaux et du Logement

1. Tous les animaux utilisés dans les protocoles décrits ici doivent être conservés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques, tels que définis par l'Association Fédération européenne des sciences des animaux de laboratoire (FELASA).
2. Souris doivent être gardés dans des cages standard pour une température et à l'humidité contrôlée (22 ° C) dans des conditions diurnes chambre (12 h cycle lumière / obscurité) avec filtre HEPA air.
3. Aliment normalisé et l'eau doivent être fournis ad libitum. </ Li>
4. Si IkB / tTA et IkB / - souris de contrôle sont utilisés, le génotypage par PCR devrait être effectué pour chaque animal, tel que décrit dans ^{7, 18.}
5. Les mâles avec une différence d'âge de moins de quatre jours devraient à être utilisés pour réduire la variabilité individuelle.
6. (OPTION): Pour NF-kB expériences de réactivation, la doxycycline doit être administré dans l'eau potable (2 mg / ml avec 2,5% de saccharose) pendant au moins 14 jours.

2. Motif spatiale séparation-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Tous les tests de comportement doit être effectuée conformément aux directives internationales et locales.
2. IMPORTANT! Utilisez uniquement des souris mâles avec un âge de six mois ou plus. La différence d'âge entre les animaux d'une série d'essais doit être inférieur à quatre jours. Le test doit être effectué par le même opérateur, pour chaque série. La souris devrait recevoir une alimentation standard avant l'épreuve d'augmenter encore la motivation partiellement entraîné par commeweet récompense alimentaire.
3. Mettre en place une plaque blanche circulaire réalisée à partir de plastique dur (diamètre de 120 cm, voir Figure 5A) dans une et à l'humidité ambiante à température contrôlée (22 ° C), éclairé par au moins 4 x 80 W et 3 x 215 lampes fluorescentes W néon . IMPORTANT! Assurer l'éclairage correct est utilisé, comme la motivation des souris pour entrer dans les maisons des aliments est partiellement entraîné par leur aversion pour les endroits lumineux, exposés.
4. Mettre en place le système de vidéo-tracking. L'appareil doit être placé 115 cm au-dessus du centre de la plaque (voir figure 5A).
5. Fixez multicolores indices extra-labyrinthe (CEM) à un tissu de couleur blanche dans des positions bien visibles pour les animaux, environ 100 cm de la frontière de la plaque (voir figure 5A).
6. Nettoyez soigneusement la plaque avec un désinfectant rapide qui peut éliminer toute odeur de l'expérimental.
7. Placez sept maisons identiques jaune alimentaires (12 cm x 7 cm x 8 cm, voir la figure 5A figure 5A).
8. Placez douces récompenses à granulés de nourriture (un trimestre d'une maison de boucle de Froot / alimentaire de l `Kellogs) à l'intérieur toutes les maisons de nourriture sur des positions définies (voir figure 5A) avec une seule maison de la nourriture défini étant librement accessible à l'animal (lieu F, voir la figure 5A ). Fermer les maisons alimentaires non ciblés avec une feuille transparente.
9. Avant l'essai, effectuer accoutumance (un jour avant de commencer la tâche). Faire toutes les maisons alimentaires librement accessibles et permettent aux souris pour explorer le labyrinthe librement et de récupérer une récompense de boulette de nourriture (10 min / animal).
10. Mettez l'ordinateur et l'appareil photo et lancer le logiciel de système de vidéo-tracking.
11. Commencer l'enregistrement.
12. Placez l'animal au point de départ défini sur la plaque circulaire (figure 5A, S: position de départ) et de permettre aux souris de rechercher la maison de la nourriture cible pendant 10 min.
13. Stop la vidéo de suivi.
14. IMPORTANT! Nettoyez la plaque circulaire et les maisons de nourriture après chaque essai avec un désinfectant rapide.
15. Répétez le test par jour pendant sept jours consécutifs (pour chaque animal).
16. Analyser les résultats (temps de latence, la distance parcourue et erreurs) en utilisant un logiciel de statistiques appropriées. Définir des erreurs que l'on approche de la maison et / ou contact avec la boîte appropriée sans entrer et récupérer la récompense de boulette de nourriture aliments mal. Pour une analyse groupée utiliser deux ANOVA avec test de Bonferroni post-hoc.
17. (OPTION) Sacrifiez les souris et analyser l'hippocampe comme décrit ci-dessous.

3. BrdU Labeling

1. Injecter par voie intrapéritonéale de 50 mg / kg ip BrdU une fois par jour pendant 3 jours (analyse de la différenciation et l'intégration) ou 200 mg / kg ip pour une seule injection (analyse de la prolifération).
2. Sacrifier les animaux, disséquer l'hippocampe et préparer 40 sections um comme décrit ci-dessous.
3. Dénaturer l'des sections avec du HCl 2 M pendant 10 min et incuber dans 0,1 M de tampon de borate pendant 10 min.
4. Étiqueter une série unique en douze sections um 40 (240 um d'intervalle) de chaque animal par immunohistochimie, comme décrit ci-dessous en utilisant des anticorps dirigés contre BrdU.
5. Quantifier les cellules marquées par une analyse par microscopie confocale dans toute la mesure rostrocaudal de la couche de cellules granulaires et la zone sous-granulaire. Multiplier les chiffres obtenus par 12 pour obtenir le nombre total estimé de cellules marquées à la BrdU par l'hippocampe et diviser par deux pour obtenir le nombre total de cellules marquées par la DG.

4. Retrait des cerveaux et préparation de cryosections de non perfusés Animaux

1. Respecter les procédures approuvées localement pour euthanasier les animaux. Les souris peuvent être directement euthanasiés par luxation du rachis cervical.
2. (Facultatif) Les animaux peuvent être anesthésiés avant l'euthanasie conformément aux directives locales et internationales, par exemple en Inje intrapéritonéalection de 0,8 ml Avertin pour 33 g de souris (fraîchement préparé en mélangeant 150 ml de solution d'achat d'actions en 2,2 mg 2,2,2-tribromoéthanol dans 1 ml d'isoamyle éthanol avec 1,85 ml d'une solution saline ou un tampon physiologique).
3. Stériliser la tête à la Bétadine (10% de povidone-iode)-gaze imbibée et écouvillon ensuite avec de la gaze trempé dans 70% d'éthanol.
4. Décapiter l'animal à l'aide des ciseaux chirurgicaux appropriés et tirer la peau de côté.
5. (Facultatif) fixateurs peuvent être appliquées pour éviter repliement de la peau retardée.
6. Faire une incision médiane dans le crâne et tirez délicatement les fragments de crâne de côté.
7. Retirez délicatement l'ensemble du cerveau à l'aide d'un instrument chirurgical approprié (par exemple la Moria cuillère).
8. Pré-refroidissement 25 ml de 2-méthylbutane dans un bécher de 50 (par exemple Schott Duran) à -30 à -40 ° C sur de la glace sèche.
   Remarque: Pour la coloration flottant de sections «épais» qui sont parfaitement adaptés pour la microscopie confocale à balayage laser, retirez cerveau, laver 3fois dans du tampon et stocker à 4 ° C dans un tampon phosphate la solution de saccharose à 30% dans 50 ml tube jusqu'à ce que le cerveau a coulé vers le bas vers le bas (typiquement durant la nuit).
9. Placez délicatement le cerveau sur un morceau de Nescofilm (Parafilm) et couvrir avec un grand quantité de composé TissueTek PTOM geler sur Nescofilm en 2-méthylbutane, conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
   Remarque: Pour un entreposage de longue date à -20 ° C magasin dans 9% de saccharose, 7 mM de _MgCl2, 50 mM de tampon phosphate, 44% de glycérol.
10. Couper le cerveau en 10-12 sections um d'épaisseur sur cryomicrotome approprié.
    Remarque: Pour les sections flottantes épaisses, geler cerveau sur cryotome stade de cryotome approprié (par exemple Reichert Jung, Frigomobil.) Et couper 40 um sections horizontales de -20 ° à - 25 ° C. Recueillir sections de couteau avec une brosse fine et collecter dans un tampon ou de garder dans une solution de stockage (étape 4.9) à -20 ° C pour le stockage à long terme.
11. Monter soigneusement deux tranches sur des lames de microscope simples. Le nouse de diapositives Superfrost Ultraplus est fortement recommandée afin de maximiser l'adhérence des sections.
12. Sécher les lames pendant 5 min à température ambiante. Lames peuvent être stockées à -80 ° C jusqu'à utilisation.

5. Préparation des sections de perfusé Animaux

1. Anesthésier les animaux décrits ci-dessus (étape 4.2).
2. Perfuser soigneusement l'animal transcardiaque avec du tampon phosphate salin (PBS) contenant de l'héparine (0,025 g/100 ml de PBS) et la procaine (0,5 g/100 ml de PBS) pendant 2 à 4 min, suivi par du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 à 15 min . La perfusion est réalisée de façon optimale par perfusion via le ventricule gauche et l'orifice de l'oreillette droite en utilisant une pression hydrostatique de l'ordre de 1.2 à 1.4 m ou en utilisant une pompe péristaltique fixé à environ 15 ml / min. Résultats de la perfusion optimales dans un cerveau blanc pâle avec pas de vaisseaux sanguins rouges sont visibles.
3. Disséquer et post-fixer le cerveau dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant 24 heures.
4. Cryoprotéger le cerveau en saccharose à 30% dans du PBS à 4 ° C pendant au moins 24 h.
5. Geler le cerveau sur la scène cryotome.
6. Préparer 40 um sections horizontales de forebrains entiers en utilisant un cryotome approprié.
7. Les lames peuvent être stockées dans une solution de cryoprotecteur (0,1 M de tampon phosphate, 50% de glycerol, 0,14% de _MgCl2, 8,6% de saccharose) à -20 ° C jusqu'à utilisation.

6. Immunohistochimie de cerveau Sections de non perfusés Animaux

1. Post-fixer les coupes cryogéniques, préparés comme décrit ci-dessus, en utilisant du méthanol à -20 ° C pendant 10 minutes à froid.
2. Bloquer avec 5% de sérum normal contenant 0,3% de Triton-X (à partir de l'espèce qui a été utilisé pour élever l'anticorps secondaire) pendant une nuit à 4 ° C.
3. Rincer 3 fois avec PBS 1x et incuber avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C.
4. Rincer 3 fois avec PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires à température ambiante pendant une heure.
5. Rincer 3 fois avec PBS 1x
6. Counterstain la section de l'ADN en utilisant vert SYTOX, ou DAPI (ou un colorant de l'ADN de remplacement).
7. Rincer 3 fois avec PBS 1x
8. Incluez les sections dans un milieu aqueux intégration.
9. Que le milieu d'inclusion polymériser pendant au moins 48 heures.

7. Immunohistochimie de cerveau articles de perfusé Animaux

1. Bloc tel que décrit dans l'étape 6.2 et incuber les coupes de cerveau fixées dans une solution d'anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 0,3% de Triton-X (flottant) pendant une nuit à 4 ° C par la suite
2. Rincer trois fois avec PBS 1x et incuber dans une solution d'anticorps secondaire dilué dans du PBS contenant 0,3% de Triton-X (flottant librement) à la température ambiante pendant 3 heures.
3. Rincer 3 fois avec PBS 1x
4. Contre-colorer la section de l'ADN en utilisant SYTOX vert ou DAPI (ou un colorant de l'ADN de remplacement).
5. Rincer trois fois avec PBS 1x
6. Incluez les sections dans un milieu aqueux intégration.
7. Que le milieu d'inclusion polymériser pour unt moins 48 heures.

8. Enquête sur les projections Mossy fibre

1. Sacrifier les animaux, préparer 40 um coupes coronales comme décrit ci-dessus et tacher la section de l'hippocampe en utilisant un anticorps pour neurofilaments M.
2. Parcourez les sections à la longueur d'onde appropriée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser microscope pour visualiser les fibres moussues et les noyaux. Démarrez le balayage à faible grossissement.
3. Utilisez les images à faible grossissement d'orientation et de cibler l'hippocampe avec des projections de fibres moussues.
4. Parcourez les sections (z) sectionnement à haute résolution et fort grossissement.
5. Analyser l'aspect morphologique et la connectivité des fibres moussues visualisées par coloration de NF-M.
6. (OPTION) Analyser la taille et le volume de l'hippocampe lames. Utiliser le signal d'ADN pour les mesures.

9. Fluoro-Jade C Assay (mort cellulaire neuronale)

1. Sacrifier les animaux, disséquer le hippocAmpus, et préparer 12 sections um comme décrit ci-dessus.
2. Laissez les sections sécher pendant 30 min à température ambiante.
3. Fixer les sections à 4% de PFA pendant 40 min à température ambiante.
4. Laver rapidement les sections 3x avec le trou DDH ₂ O.
5. Incuber les sections avec 0,06% de permanganate de potassium (KMnO ₄₎ pendant 10 min sous continu, agitant doucement.
6. Lavez les sections 3x avec le trou DDH ₂ O.
7. Incuber les sections avec une solution C Fluoro-Jade 0,002% pendant 20 min à température ambiante.
8. (En option) pour colorations nucléaires simultanées, solution 0,002% Fluoro-Jade C peut être complétée avec 10 pg / ml DAPI.
9. Laver rapidement les sections 3x avec le trou DDH ₂ O.
10. Laissez les sections sécher pendant 30 min à température ambiante.
11. Incuber les sections avec du xylene (1 min)
12. Montez les sections en utilisant un milieu de montage à base de xylène (DPX).

Representative Results

Le croisement des IkB / - lignées de souris transgéniques et tTA mène à l'inhibition de l'activité de NF conditionnel-kB dans l'hippocampe.

Pour étudier l'expression de la IKBa-AA1-transgène dans la double transgénique souris (figure 1A), les cerveaux ont été isolés, cryosectioned et colorées en utilisant un anticorps contre la GFP (protéine fluorescente verte). La microscopie confocale à balayage laser a révélé une forte expression du transgène dans les régions CA1 et CA3, et dans le DG (figure 1B).

Le IKBa-AA1-transgène est exprimé dans les progéniteurs de type 2b, et est actif dans les Etats immatures intermédiaires et dans les cellules granulaires matures.
Pour déterminer le premier type de cellule exprimant le IKBa-AA1 CAMKIIα mécanique dans la région neurogène hippocampe, cryosections de hippocampe d'animaux IKB / TTA ont été colorées pour doublecortine(DCX) et le transgène (GFP). Analyse confocale a révélé des signaux de GFP dans les jeunes cellules granulaires DCX-positives, ce qui indique l'induction de l'expression du transgène par CAMKIIα-activité (figure 2, les flèches).

L'inhibition neuronale NF-kB par IKBa-AA1 réduit projections de fibres moussues, et l'épaisseur et le volume de la DG.

Des sections coronales de l'hippocampe de IkB / tTA et IkB / - ont été colorés pour neurofilament M (NF-M) pour visualiser des projections de fibres moussues, et révèlent organisation complexe et fasciculaire (Figure 3). Chez les souris IKB / TTA, les projections de fibres moussues ont été gravement altérées. En outre, l'inhibition de NF-kB a conduit à une épaisseur de lame suprapyramidal significativement réduite et un plus petit volume de DG (Figure 3B).

L'inhibition neuronale de NF-kB dans les souris IKB / TTA conduit à dégénérescence neuronale élevéetion, l'augmentation de la neurogenèse, et une migration perturbé des progéniteurs exprimant DCX.

Pour étudier les raisons possibles pour les défauts de structure dramatique, frais, des tranches d'hippocampe de souris non fixées IKB / TTA ont été colorées avec Fluoro-Jade C, ce qui permet la détection spécifique de la mort des cellules neuronales (figure 4A). Ici, un nombre considérablement accru de neurites en dégénérescence ont été observés chez les animaux doublement transgéniques, par rapport aux témoins transgéniques simples. De plus, une augmentation significative des cellules apoptotiques de la caspase-3-positif clivés a été détectée chez les souris IkB / tTA. En revanche, la coloration immunohistochimique contre DCX révélé significativement quantités de cellules DCX + augmenté dans les cerveaux des souris IKB / TTA. En outre, DCX + cellules dans IKB / TTA-hippocampes ne sont pas disposés uniquement dans la zone sous-granulaire mais ont également été trouvés dans les régions les plus profondes de la DG (figure 4B), tandis que les DCX +-i progéniteursn les animaux témoins ont été localisés près exclusivement dans la zone sous-granulaire. Pour tester si la quantité accrue de cellules DCX-exprimant un résultat de la maturation des progéniteurs antérieures ou directement en raison de la prolifération des DCX cellules +, BrdU a été injectée dans l'hippocampe de souris IkB / tTA et de contrôle, qui ont été ensuite cryosectioned et coloré avec du DCX et BrdU (figure 4). Pour l'analyse de la prolifération, de BrdU a été injecté une fois (voir la figure 4B, régime), suivie d'une analyse après 24 h. Pour l'analyse de la différenciation, trois injections ont été effectuées tous les jours, suivie d'une analyse au bout de sept jours. Après une BrdU-injection unique, aucune différence significative dans le nombre total de cellules BrdU-positives entre IκB/tTA- et les animaux de contrôle ont été observés, alors que les trois injections de série approche a révélé une quantité nettement augmenté de BrdU / DCX + cellules de la DG de souris IkB / tTA. Cela indique que la différenciation ou intégration de DCX-ex perturbécellules de pression peuvent avoir causé l'augmentation du nombre de cellules DCX +, et suggère que de type 3 ont été impliqués.

L'inhibition neuronale des résultats NF-kB dans les défauts d'apprentissage graves, comme l'a démontré par le test de séparation-Barnes Maze configuration spatiale. Pour tester spécifiquement le comportement de la souris à double transgénique dans une tâche DG-dépendante, nous avons utilisé le SPS-BM, où les animaux avoir de différencier entre des endroits où des différences subtiles (figure 5). Dans ce test comportemental, les IkB / - animaux témoins ont exploré les maisons de bouche en série sur le premier jour de l'expérience (Figure 5). Après sept jours de formation, les animaux ont réussi à trouver la maison de la nourriture ouvert directement. En revanche, les animaux IKB / TTA ont continué d'explorer les maisons alimentaires en série, même après la formation (figure 5B). L'observation des augmentations significatives dans les distances parcourues et les temps de latence plus et ertaux de ror chez les animaux IKB / TTA, contre les IkB / - animaux de contrôle, suggère que ces animaux avaient des défauts graves d'apprentissage (figure 5C).

Figure 1. La génération d'une inhibition spécifique de cerveau antérieur conditionnelle de l'activité de NF-kB. Dessin A. Schéma des modèles transgéniques utilisées pour étudier le rôle de NF-kB dans la neurogenèse hippocampique adulte. Calcium-calmoduline-dépendante kinase IIa (CAMKIIα) promoteur axée transactivateur de tétracycline souris (TTA) ont été utilisés pour réguler l'expression d'un mutant négatif trans-dominant IκBa (IκBa-AA1 super-répresseur chez la souris IKB) combinée avec une protéine fluorescente verte traceur (GFP). Chez les souris IkB / tTA, NF-kB est conservé dans le cytoplasme dans sa sta inactivete non dégradable par IκBa-AA1, qui peut être détectée par l'intermédiaire de la fluorescence GFP. L'inhibition peut être inversée par la doxycycline, qui inhibe tTA. B. représentant l'expression du transgène dans les différentes régions de l'hippocampe de souris IkB / tTA (CA1, CA3 et DG). Cryosections ont été préparés à partir de cerveaux isolés de IkB / - et les souris IkB / tTA, et ont été fixées et colorées en utilisant un anticorps contre la GFP. Notez que le transgène est fortement exprimé dans la DG. De: dendrites, DG: gyrus denté, ML: couche moléculaire; SL: Stratum lucidum. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2. Le transgène IκBa-AA1 est exprimée en DCX-positif, de type 2b progenit ors et est actif dans d'autres états intermédiaires et dans les cellules granulaires matures. Hippocampes A. Cryosectioned d'animaux IkB / tTA avec doublecortine (DCX) la coloration et l'expression de GFP révèle l'expression du transgène chez les jeunes cellules granulaires DCX-positifs (flèches). DG: gyrus denté, ML: couche moléculaire dessin B. Schéma de l'expression du transgène dans les différents stades de développement au cours du développement de cellules granulaires.. IκBa-AA1-expression du transgène a été détectée dans les progéniteurs, de type 2b DCX-positifs, tous les états intermédiaires immatures et dans les cellules granulaires matures. En revanche, les progéniteurs de type 1 et de type 2a début (manquant DCX-expression) n'ont pas exprimé le transgène, et ne sont donc pas affectées par l'inhibition NF-kB. Modifié d'après Kempermann et al. ²⁰ Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Figure 3. Inhibition de NF-kB conduit à douteux projections de fibres moussues et à une épaisseur réduite DG et le volume des souris IKB / TTA, par rapport à une seule commande transgénique (IKB / -). A. Immunocoloration hippocampes cryosectioned pour neurofilaments M (NF-M) pour visualiser les projections de fibres moussues. Chez les souris de contrôle (IkB / -), une organisation complexe et fasciculaire de fibres moussues de liaison des cellules granulaires de leurs cellules cibles dans CA3 est évident, qui a été altéré après l'inhibition neuronale de NF-kB chez des souris IkB / tTA. En outre, l'expression de la super-répresseur a conduit à une épaisseur sensiblement réduite suprapyramidal de lame (comparer flèche dans le panneau gauche et droite) et un volume DG diminuée. B. Quantification et analyse statistique des défauts structurels résultant de l'inhibition du NF-kB. Test t non apparié, bilatéral. Données tirées de l'OA-version de Imielski et al. ² Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4. L'inhibition du NF-kB chez des souris IkB / tTA entraîne une augmentation de la mort cellulaire neuronale, la neurogenèse renforcée, et un motif de migration des cellules perturbées DCX-exprimant. Fluoro-Jade C coloration A. Neuron-spécifique et une augmentation du nombre de cellules de la caspase-3-positif clivés dans les sections de l'hippocampe révèle un niveau de mort neuronale chez les souris IKB / TTA plus élevé que dans les IkB / - contrôles. Neurites dégénérescence sont indiqués par des flèches, et les noyaux sont indiquées par des astérisques. Bon site: quantification de caspase-3-pocellules sibles au sein de l'hippocampe suggère l'apoptose ont fortement augmenté chez les animaux doubles transgéniques. B. Coloration des cryosections hippocampe pour DCX révèle une augmentation du nombre de cellules exprimant la DCX dans les animaux doubles transgéniques. Notez que DCX + cellules de IkB / tTA-hippocampes sont pas disposés exclusivement dans la zone sous-granulaire, mais ont migré plus loin dans la direction générale que dans la IkB / -. Contrôle C. Le panneau de gauche: Pour tester l'influence du transgène sur la prolifération, un BrdU-injection unique a été réalisée, qui a donné lieu à aucune différence significative dans le nombre de cellules BrdU-positives entre IKB / TTA et les contrôles de droite:. Évaluation statistique a révélé une importante augmenter dans les cellules exprimant la DCX chez les animaux IKB / TTA après trois BrdU-injections quotidiennes. Cette analyse a été effectuée sept jours après la dernière injection (test de différenciation et d'intégration). Une augmentation significative de BrdU / DCX + a été détecté dans la DG Isouris kB / tTA (n = 3). Données en partie tirées de l'OA-version de Imielski et al. ² Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5. Mise en place et des résultats typiques de l'espace modèle de séparation-Barnes labyrinthe (SPS-BM). A. Gauche: Schéma du dispositif expérimental. Sept maisons alimentaires identiques (même couleur, taille et forme) ont été placés symétriquement sur les taches définies de, une plaque fait maison ronde construite à partir de plastique dur inerte (diamètre de 120 cm), avec une place libre (de point de départ, S). Multicolores indices extra-labyrinthe (CEM) sont fixés à l'avant d'un tissu de couleur blanche dans des positions facilement visible aux animaux, environ 100 cm de la bcommande de la plaque. Pour éviter l'orientation par l'odeur, des boulettes de nourriture sont déposés dans chaque maison, mais une seule maison de la nourriture est accessible (fermeture en feuille transparente). Droite: Caméra vidéo axée sur la plaque (distance à la plaque: 115 cm) et d'une photographie de la mise en place, y compris les indices extra-labyrinthe B. résultats expérimental typique d'un test SPS-BM.. Le IKB / - animal témoin explore les maisons alimentaires en série le premier jour de la série de test, et la maison de la nourriture ouverte se trouve immédiatement après sept jours de formation. En revanche, les souris IKB / TTA révèlent l'apprentissage plus pauvres, comme l'a démontré par l'exploration de série, même après la phase de formation C. Comparaison des paramètres mesurés dans le SPS-BM dans IkB / -. IKB et / TTA animaux. Les souris doublement transgéniques montrent des déficits de mémoire significatives (n = 9) par rapport aux témoins (n = 8) par rapport au temps de latence, la distance parcourue et des taux d'erreur. l'évaluation de l'ANOVA à deux voies; barres d'erreur: SEM. Les données de B etC ont été pris de l'OA-version de Imielski et al. ² Cliquez ici pour agrandir l'image.

Discussion

Neurogenèse adulte, et la possibilité de sa manipulation par l'inhibition de NF-kB dans les neurones, et sa réactivation plus tard par la doxycycline, propose un système fascinant pour les enquêtes sur les nouveaux neurones dans le cerveau adulte, ainsi que dans des neurones de-et re-génération . La beauté de ce système est que le NF-kB voie de signalisation inhibition des neurones non seulement entraîne des changements dans la mort des cellules neuronales, la prolifération des progéniteurs et la migration, et les changements structurels et anatomiques graves, mais aussi des défauts d'apprentissage évidentes. Fait important, le phénotype des animaux IkB / tTA peut être inversé et secouru expérimentalement après l'administration de doxycycline. Cette réversion du phénotype inclut des aspects structurels, et peut aussi conduire à une amélioration significative dans l'apprentissage de la ^DG-2 dépendante.

Pour assurer un résultat interprétable pour les expériences de comportement, il est essentiel que seuls les mâles avec une différe d'âgence de moins de quatre jours être utilisé. En outre, toutes les séries d'essais doivent être effectués par le même opérateur. En ce qui concerne la salle de test, nous vous recommandons vivement d'effectuer le test dans un environnement sonore isolé pour éviter le stress et la perte de l'attention résultant de sources de bruit externes. Pour éviter orientation basée sur la détection des odeurs au lieu de signaux extra-labyrinthe, les maisons closes alimentaires ne doivent pas être accessibles à l'animal, et de l'air et l'odeur circulation normale doit être autorisée. En outre, la plaque utilisée pour le test doit être construit d'un matériau d'odeur neutre et résistant aux détergents, et doit être soigneusement nettoyée entre les expériences. Une autre source potentielle de variation expérimentale est éclairage de la pièce. La source de lumière doit être suffisamment clair pour permettre l'acquisition d'images, la reconnaissance des extra-labyrinthe des indices, et d'induire un comportement de vol, mais ne devrait pas être d'une intensité d'aveugler l'animal. De plus, nous vous conseillons d'effectuer les essais pour chaque animal en même tempsde la journée pour éviter les variations circadiennes.

Mus musculus a une assez bonne capacité de vision qui est, dans des conditions naturelles, entre autres utilisés pour détecter les limites territoriales à caractéristiques visuellement frappantes (des repères visuels comme les arbres) (Latham et al.,. Appl. Animaux Behav. Sci 86 (3-4 ), 261-289, 2004). Dans une expérience classique Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) placé 6, 0 et -7 lentilles de dioptrie en face des yeux de souris et observé aucun changement significatif de la taille des champs récepteurs dans les cellules ganglionnaires de la rétine. En raison de cette énorme profondeur de champ stimuli visuels (par exemple, queues extra-labyrinthe) peut être placé sur une large gamme de distances en face de la souris et rester au foyer. Dans notre approche, la distance de l'extra-labyrinthe indices du point de départ était de 30 cm de la frontière de la plaque, ce qui est en accord avec la littérature (par exemple, 140 cm de Wong et al., gènes cerveau Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Rongeurs ont tendance à rester près des murs d'un champ ouvert. Ce comportement est défini comme thigmotaxis (Barnett, SH, Le rat: une étude de comportement, de l'édition Aldline, Chicago, pp 31-32, 1963). Une étude récente de O `Leary et al. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) a démontré que les souris C57BL/6J ont montré un meilleur apprentissage dans un labyrinthe Barnes rapport à 12 autres souches de souris. 28% des souris testées utilisé la recherche spatiale, tandis que 64% ont utilisé la stratégie de série-thigmotactic. Ceci est vrai pour les données petit labyrinthe avec un diamètre de 69 cm avec une 15 cm paroi environnante. Cependant, les souris testées sur un grand labyrinthe sans murs ou intramaze indices, comme notre configuration (diamètre de 120 um) ont mis en évidence de façon fiable à l'usage principalement de extra-labyrinthe des indices visuels (voir par exemple Bach et al., Cell. 81 par exemple causées par les différences de microstructure, la plaque a été tourné après chaque expérience.

Le test de comportement peut être simplement adaptés à l'étude de l'impact des autres facteurs de transcription sur la neurogenèse hippocampique adulte, en utilisant des modèles de souris appropriés. Cependant, il est principalement conçu pour tester l'apprentissage DG-dépendant (modèle séparation spatiale), et peut ne pas convenir à l'enquête de la neurogenèse ou la dégénérescence neuronale dans d'autres régions du cerveau. À cet égard, l'utilisation de SPS-BM est en outre limitée par son DG spécificité (dépendance stricte sur un circuit fonctionnel entre la CE II et la DG et CA3 et CA1 et CE VI), et ne devrait donc pas être appliquée pour l'étude des tâches qui impliquent la monosynaptic CE III - CA1 - CE V - circuit.

Les futures applications des méthodes décrites ici peuvent comprendre l'étude des effets de la transplantation de cellules souches, pharmatraitements tiques sur la neurogenèse hippocampique adulte, et l'homéostasie du tissu dans l'hippocampe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining