Une procédure d'implantation de tableaux organisés de microfils pour enregistrements unitaires dans Awake, se comportant Animaux

Résumé

L'implantation des réseaux organisés de microfils pour une utilisation dans une seule unité enregistrements électrophysiologiques présente un certain nombre de défis techniques. Méthodes pour effectuer cette technique et l'équipement nécessaire sont décrits. En outre, l'usage bénéfique des baies de microfilaires organisés pour enregistrer des sous-régions distinctes de neurones avec une grande sélectivité spatiale est discutée.

Résumé

Dans les enregistrements électrophysiologiques in vivo chez l'éveillé, animal comporter fournir une méthode puissante pour comprendre la signalisation neuronale au niveau d'une seule cellule. La technique permet expérimentateurs pour examiner le temps et régional modes de cuisson spécifiques afin de corréler les potentiels d'action enregistrés avec un comportement continu. En outre, les enregistrements unitaires peuvent être combinés avec une pléthore d'autres techniques afin de produire des explications détaillées de la fonction neuronale. Dans cet article, nous décrivons l'anesthésie et la préparation de micro-fil implantation. Par la suite, nous énumérons les équipements nécessaires et les étapes chirurgicales à insérer avec précision une gamme de micro-fil dans une structure cible. Enfin, nous décrivons brièvement l'équipement utilisé pour enregistrer de chaque électrode dans le tableau. Les tableaux de microfilaires fixes décrits sont bien adaptés pour l'implantation chronique et permettent des enregistrements longitudinaux des données de neurones dans presque toutes les preparati comportementsur. Nous discutons de traçage des pistes d'électrodes pour trianguler positions microfilaires ainsi que des façons de combiner microfils implantation avec des techniques d'immunohistochimie afin d'augmenter la spécificité anatomique des résultats enregistrés.

Introduction

Des enregistrements électrophysiologiques permettent aux scientifiques d'examiner les propriétés électriques des cellules biologiques. Dans le système nerveux central, où les impulsions électriques servent de mécanisme de signalisation, ces enregistrements sont d'une importance particulière pour la compréhension de la fonction neurale ^2.1. Au cours des enregistrements unitaires dans comporter animaux, une micro-électrode qui a été inséré dans le cerveau est capable d'enregistrer des changements dans la génération d'un neurone de potentiels d'action au fil du temps.

Alors que de nombreuses techniques permettent d'enregistrer l'activité du cerveau, unitaire électrophysiologie est une des méthodes les plus précises en permettant la résolution au niveau du neurone unique. Lorsqu'un degré élevé de spécificité spatiale est recherchée, microfils peuvent être utilisés pour cibler des sous-ensembles ou des noyaux de cellules au sein de la brain3 discrètes. Enregistrements unitaires bénéficient également d'une haute résolution temporelle que les enregistrements sont précis au niveau de la microseconde. Et, in vivo, uneenregistrements d'éveil permettent une interaction de circuits intacts, avec le milieu naturel de afférentes et efférentes projections, les influences hormonales chimique systémique et et les paramètres physiologiques. Signaux neuronaux sont dérivées de données sensorielles, des comportements moteurs, traitement cognitif, la neurochimie / pharmacologie, ou une combinaison. En conséquence, la ségrégation des, moteur, cognitif et chimiques influences sensorielles nécessite des expériences bien conçues avec risques et des contrôles efficaces qui peuvent permettre à l'évaluation de chacun des influences précitées. Dans l'ensemble, les enregistrements de comportement des animaux permettent expérimentateurs d'observer l'intégration de multiples sources d'information au sein d'un circuit de fonctionnement et d'obtenir un modèle plus complet de la fonction de circuit.

Enregistrements unitaires souffrent aussi d'un certain nombre d'inconvénients dont un expérimentateur doit être conscient. Tout d'abord, les enregistrements peuvent être difficiles à mener. En effet, les propriétés de ee amplificateurs de headstage et les microfils implantées qui permettent spécificité spatiale et temporelle de ces enregistrements fait aussi des enregistrements sensibles à l'influence de signaux électriques parasites (c.-à-électrique "bruit"). En conséquence, la capacité de résoudre les problèmes dans un système électrophysiologique nécessite une compréhension technique bien développé des principes et appareils électrophysiologiques. Il est également important de noter que, dans certaines circonstances, les signaux électriques enregistrés dans des enregistrements extracellulaires peuvent représenter la somme de plusieurs signaux neuronaux. En outre, la généralisation de l'activité unitaire à l'activité de la population dans une région cible peut souvent être limitée par le degré d'hétérogénéité cellulaire dans la région cible (mais voir Cardin ^4). Par exemple, les électrodes peuvent être sollicités vers l'enregistrement de neurones de sortie de forte amplitude à la place d'autres cellules. L'intelligibilité des enregistrements unitaires est augmentéeen combinant les enregistrements avec d'autres techniques, y compris, mais sans s'y limiter, électrique (orthodromique ou antidromique), de stimulation (par exemple, par iontophorèse ou récepteur de créateur) optogenetic ou ^4, inactivations neuronaux temporaires, sensorimoteurs examens ^5, les procédures de déconnexion, ou l'immunohistochimie chimique ^3.

Dans le protocole qui suit, nous allons énumérer les matériaux et les mesures nécessaires pour implanter un réseau de micro-fil organisée chez le rat (bien que le protocole peut être adapté pour une utilisation dans d'autres espèces). La procédure et le style de tableaux fixes utilisés dans notre laboratoire ont prouvé leur fiabilité pour les enregistrements longitudinaux et peuvent supporter des enregistrements de la même neurone de plus de temps d'un mois ^6-8. Cela rend cette procédure idéale pour examiner les réponses phasiques à des stimuli expérimentaux, les changements plastiques dans les réponses de neurones, ou de mécanismes d'apprentissage et de motivation.

Protocole

Le plus grand soin doit être pris pour maintenir des conditions aseptiques (comme décrit dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire ⁹⁾ lors de la préparation et la conduite de la procédure suivante. Le protocole suivant est en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Rutgers. On estime que les procédures ultérieures, il faudra 3-6 heures pour compléter.

L'implantation de la baie Microwire:

1. La place des animaux sous anesthésie à l'aide de 50 mg / kg de pentobarbital de sodium (IP) et l'administration de 10 mg / kg de nitrate d'atropine de méthyle (IP; Glycopyrrolate peut être substitué) et 0,25 mg de pénicilline (300 000 U / ml im) pour maintenir la fonction respiratoire et prévenir l'infection , respectivement.
   Remarque: Avec la longueur de 3-6 h de cette chirurgie d'implantation, le pentobarbital de sodium est utilisé parce qu'il est rentable et limite l'exposition humaine àanesthésiques (cela peut se produire avec l'utilisation prolongée d'anesthésiques de gaz) tout en offrant une anesthésie de longue durée. La substitution d'autres anesthésiques est acceptable.
2. Vérifiez que l'anesthésie a pris effet en utilisant le test de pincement queue avant de poursuivre.
3. Le cas échéant, donner alternatif injections de chlorhydrate de kétamine (60 mg / kg IP) et de pentobarbital de sodium (5-10 mg / kg IP) pour maintenir l'anesthésie pendant toute la chirurgie.
4. Raser le cuir chevelu à l'aide d'une lame de scalpel n ° 22.
5. Désinfecter le cuir chevelu rasé avec de la povidone iode.
6. Donnez injections sous-cutanées de bupivacaïne (~ 1 mg / kg SC, réparties sur 4 sites d'injection) pour anesthésier localement le cuir chevelu. Laisser 5-10 min pour l'anesthésique local pour prendre effet.
7. Placez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour maintenir l'humidité pendant l'anesthésie.
8. Fixez l'animal dans les barres d'oreilles et le nez pince d'un appareil stéréotaxique.
9. Utilisez repères visuels (par exemple une barre horizontale sur le stercadre eotaxic) à peu près au niveau de la tête de l'animal. Cette étape est uniquement destinée à peu près au niveau du crâne.
10. Faire une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu à l'aide d'une lame de scalpel # 11 monté sur un support de scalpel. L'incision doit s'étendre à partir de juste en arrière des oreilles à la partie postérieure de l'os nasal.
11. Avec une spatule de dissection, effacer le crâne de tous les tissus restants jusqu'à ce que les crêtes du crâne latérales et le crâne crête postérieure ont été atteints.
12. Tirez la peau autour de l'incision à l'aide d'un certain nombre de pinces hémostatiques (6x).
13. Nettoyez le crâne de tout le sang et laisser sécher. Si un saignement se produit restant, mettre fin à l'hémorragie résiduelle avec un petit outil de cautérisation. Faire en sorte que le crâne reste propre et sec permet la acrylique dentaire utilisé dans des étapes ultérieures de se lier de manière permanente sur le crâne.
14. Mark bregma et lambda (figure 2D) par interpolation l'intersection des sutures du crâne. Un micro dissectionroscope est nécessaire de marquer précisément ces positions.
15. Attacher un objet pointu petit (par exemple, une broche ou foret dentaire) à un bras stéréotaxique et l'abaisser pour déterminer la dorsale / ventrale (DV) de coordonnées de bregma et lambda.
16. Ajuster le collier de nez jusqu'à ce que les coordonnées DV pour bregma et lambda sont à moins de 100 pm (0,1 mm) les unes des autres.
17. Une fois stabilisée, enregistrer la partie antérieure / postérieure (AP), médial / latéral (ML) et coordonne DV de bregma avec la position de la pince de nez. Vérifiez les coordonnées pour la précision, comme le reste de l'opération dépend de la précision de ces coordonnées.
18. Utilisez les coordonnées mesurées pour calculer la ML et coordonne AP pour les quatre coins de la "fenêtre de crâne" par rapport à bregma (c.-à-craniotomie; Figure 1). La fenêtre de crâne est un rectangle positionné précisément par lequel le réseau de micro-fil va passer.
19. Utilisez les coordonnées calculées à l'occasion ducoordonne fenêtre crâne sur le crâne à l'aide d'une fixation de stéréotaxique pointu et encre de stylo-plume. Pour obtenir des notes précises, appliquer une petite quantité d'encre à la pointe de l'outil de marquage à l'aide d'un coton.
20. Percer la fenêtre de crâne en enlevant l'os dans une série de petites couches.
    1. Commencez par percer les coins marqués de la fenêtre où les marques ont été placés.
    2. Ensuite, connectez les coins et définir la fenêtre.
    3. Enfin, effacer la zone à l'intérieur du contour à la profondeur de la dure-mère. Le trou doit être plus large (c.-à-biseauté) au-dessous des couches superficielles de la boîte crânienne à faire en sorte que la fenêtre maintient une largeur appropriée de haut en bas.
21. Utilisez microforceps à retirer soigneusement les copeaux d'os tout en restant, des débris ou la dure-mère dans la fenêtre de crâne. Cette étape est très importante, car ces morceaux de matériau peuvent compromettre l'intégrité de la matrice lors de la descente. Une fois autorisé, il faut garder èmee fenêtre humide avec une solution saline bactériostatique pour le reste de la chirurgie.
22. Placez des marques sur le crâne pour 5 vis du crâne et 1 fil de terre (figure 1). Ces positions peuvent varier en fonction de la région ciblée du cerveau. Le headstage sera plus sûre si une vis est placée sur chacun des 5 os du crâne. Placez les deux vis du crâne et fil de terre dans des endroits qui ne sera pas interférer avec la mise en place de réseau de micro-fil.
23. Percer les trous pour les vis de crâne et serrez les vis en place. Les vis doivent être abaissés jusqu'à ce que seulement 3-4 les discussions montrent (ou, si l'aide de vis autres que celles recommandées, assez profond pour traverser l'épaisseur du crâne de promouvoir la stabilité de la matrice mais pas trop profonde afin d'endommager le cortex). Nettoyer les filets des vis après le placement.
24. Percez un trou pour le fil de terre. Abaissez le fil lentement (1-2 min) à la prise DV cible coordonner et fixer le fil en place utilisant l'acrylique dentaire.
25. Ajouter acrylique autour des filetsdes vis de crâne. Avant le séchage acryliques, enlever tout excès de ciment qui s'écoule à partir du fil de terre ou vis de crâne. Laisser 15 min pour le acrylique dentaire à sécher / durcir.
26. Fixez l'ensemble à bras stéréotaxique. Niveler le tableau et l'orienter de sorte qu'il sera carrément passer à travers les limites de la fenêtre de crâne.
27. Placer la solution saline dans la fenêtre de crâne de sorte qu'il est au niveau du crâne. Abaissez le tableau jusqu'à ce qu'elle crée une fossette dans la solution saline. Cette coordination est utilisé comme niveau de crâne pour le tableau. Utilisez cette valeur pour calculer la DV finale coordonnées de la matrice.
28. Abaissez lentement le tableau jusqu'à ce qu'il atteigne sa DV finale coordonnées. Arrêter chaque 1mm d'abaissement et d'attendre pendant plusieurs minutes afin de permettre aux tissus du cerveau à se remettre de capitonnage et pour dissoudre la partie de fond du polyéthylène glycol (PEG) sur la matrice (PEG est utilisé pour conserver temporairement les fils dans leur conformation, tout en réduisant , et se dissout lentement dans une solution saline).
29. Lorsque le tableau est de 1mmà une distance de la cible, plus l'abaisser lentement jusqu'à ce que l'objectif final est atteint. L'abaissement de 0,1 à 0,2 mm, à un moment avant de permettre au tissu de se reposer pendant une période de 5 min est destinée à préserver le tissu au niveau du site cible, ainsi que des connexions synaptiques proximales. Si le matériel est disponible, la précision abaissement de la matrice peut être assistée en utilisant un manipulateur motorisé.
30. Dissoudre le PEG restant et utiliser acrylique dentaire à cimenter les microfils en place. Ajouter plusieurs couches de ciment afin de s'assurer que les fils sont en sécurité, puis laisser 15-20 min pour le ciment durcir avant de poursuivre. Cela garantit que les fils ne seront pas bousculés de leur classement final.
31. Construire le reste de la headstage de l'animal à l'acrylique dentaire. Utilisez l'acrylique pour envelopper les vis de crâne, fil de terre, et le connecteur pour les microfils. Laissez le chapeau acrylique durcir suffisamment avant de procéder.
32. Suturer l'incision du cuir chevelu à l'aide sutures absorbables et administrer 2 ml of saline bactériostatique (sc) pour restaurer l'hydratation de la chirurgie.
33. Retirer l'animal à partir des barres d'oreilles et placer le sujet dans un endroit propre. Observer l'animal fréquemment pendant la récupération post-opératoire jusqu'à la thermorégulation et de la locomotion ont récupéré. Après récupération de l'anesthésie, déplacer l'animal dans un seul boîtier pour le reste de la récupération post-opératoire.
34. Donnez animaux surveillance postopératoire quotidienne et des soins dans les jours suivant la procédure. Récupération de cette procédure est optimale lorsque sept jours ou plus sont autorisés.
35. Donnez animaux des injections de Carprofen (5mg/kg) et Enrofloxacine (5-10 mg / kg) ou leurs équivalents lors de la récupération par le calendrier recommandé par le vétérinaire traitant.

Résultats

Une liste de l'équipement utilisé par ce laboratoire pour l'enregistrement de signaux électrophysiologiques peuvent être trouvées dans le tableau 3. Après récupération de la chirurgie, simples unités sont enregistrées en branchant un headstage gain unité dans le connecteur implanté. Cette headstage est relié par un câble à un commutateur, qui est capable d'une rotation libre sans interruption dans l'enregistrement électrophysiologique grâce à l'utilisation de bagues collectrices élec...

Discussion

Enregistrements extracellulaires représentent une technique expérimentale puissante qui peut être incorporé dans presque toute la préparation expérimentale en neurosciences. Fils qui ont été implantés dans des réseaux organisés peuvent être suivis comme leurs arbres traversent le cerveau et dans leur région cible (figure 5A). Quand une petite lésion, post-expérimental est créé à la pointe de micro-fil non isolé pour créer un petit dépôt de fer du fil d'acier inoxydable, on peut précisément marquer l...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tableau 1. Liste des matériaux chirurgicaux.
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotons-tiges	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropine Methyl Nitrate	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein ( Bayer)	1040007
Chlorhydrate de kétamine	Butler Shein	SKU# 023061
Bétadine (Povidone-Iode)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Model 900
Outil de cautérisation	Stoelting	59017
Microscope de dissection	Nikon	SMZ445
Foret dentaire	Buffalo	37800
Bactériostatique Saline	Bulter Schein	8973
Bijoux Vis	Stoelting	51457
Microsondes	à réseau de microfils Personnalisé	(flexible)
Fil de terre	Omnetics	Prise
Acrylique dentaire	Fisher (BAS)	50-854-402
Sutures résorbables	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (pommade/lubrifiant ophtalamique)	Fisher (Henry Schein)	008897
Tableau 2. Liste des instruments chirurgicaux.
2x Microforceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multi-usage (par exemple, dégager les débris dans la fenêtre du crâne)
2x Pince	George Tiemann Co.	#160-93	Multi-usage (par exemple attacher des sutures)
6x Hémostats	George Tiemann Co.	#105-1125	Pince et incision ouverte
1x Petits ciseaux	George Tiemann Co.	#105-411	Couper les sutures après avoir attaché
1x pince à tissus	George Tiemann Co.	#105-222	Tenir le tissu pendant la suture
1x Porte-aiguille	George Tiemann Co.	#105-1259 Maintien de	l’aiguille de suture
1x Porte-scalpel (avec lame #11)	George Tiemann Co.	#105-80 (avec lame #105-71)	Faire une incision du crâne
1x #22 Lame de scalpel	George Tiemann Co.	#160-381	Rasage du cuir chevelu
1x Spatule chirurgicale	George Tiemann Co.	#160-718	Grattage du crâne pour effacer les tissus sur le crâne
Vis de machine/bijouterie Divers		N/A	0/80 x 1/8"
Tableau 3. Liste des équipements pour l’enregistrement des signaux électrophysiologiques.
Microwire Array & Connecteur	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (N° de pièce basé sur les caractéristiques du réseau)	Implanté crânalement dans la région d’enregistrement cible. Les réseaux sont personnalisés en fonction de l’espacement des fils, de la longueur, de l'etc.
Single-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Amplification initiale du signal neuronal ; permet la propagation de petits signaux neuronaux.
Commutateur (et pivot de fluide en option)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Permet aux animaux de tourner librement tout en propageant le signal électrique au préamplificateur
Préamplificateur	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Amplifie différentiellement les signaux neuronaux contre une électrode de référence.
Filtre et amplificateur	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	filtre et amplifie davantage le signal amplifié différentiellement.
Ordinateur d’acquisition	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Exécute des logiciels et du matériel pour l’acquisition de données comportementales et neuronales.
Carte A/D  ;	Traduction de données (Marlboro, MA)	DT-3010	Numérise les signaux neuronaux pour l’échantillonnage par ordinateur.
carte d’E/S numériques	(Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquiert des entrées et des sorties comportementales

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