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Summary

L'implantation des réseaux organisés de microfils pour une utilisation dans une seule unité enregistrements électrophysiologiques présente un certain nombre de défis techniques. Méthodes pour effectuer cette technique et l'équipement nécessaire sont décrits. En outre, l'usage bénéfique des baies de microfilaires organisés pour enregistrer des sous-régions distinctes de neurones avec une grande sélectivité spatiale est discutée.

Abstract

Dans les enregistrements électrophysiologiques in vivo chez l'éveillé, animal comporter fournir une méthode puissante pour comprendre la signalisation neuronale au niveau d'une seule cellule. La technique permet expérimentateurs pour examiner le temps et régional modes de cuisson spécifiques afin de corréler les potentiels d'action enregistrés avec un comportement continu. En outre, les enregistrements unitaires peuvent être combinés avec une pléthore d'autres techniques afin de produire des explications détaillées de la fonction neuronale. Dans cet article, nous décrivons l'anesthésie et la préparation de micro-fil implantation. Par la suite, nous énumérons les équipements nécessaires et les étapes chirurgicales à insérer avec précision une gamme de micro-fil dans une structure cible. Enfin, nous décrivons brièvement l'équipement utilisé pour enregistrer de chaque électrode dans le tableau. Les tableaux de microfilaires fixes décrits sont bien adaptés pour l'implantation chronique et permettent des enregistrements longitudinaux des données de neurones dans presque toutes les preparati comportementsur. Nous discutons de traçage des pistes d'électrodes pour trianguler positions microfilaires ainsi que des façons de combiner microfils implantation avec des techniques d'immunohistochimie afin d'augmenter la spécificité anatomique des résultats enregistrés.

Introduction

Des enregistrements électrophysiologiques permettent aux scientifiques d'examiner les propriétés électriques des cellules biologiques. Dans le système nerveux central, où les impulsions électriques servent de mécanisme de signalisation, ces enregistrements sont d'une importance particulière pour la compréhension de la fonction neurale ^2.1. Au cours des enregistrements unitaires dans comporter animaux, une micro-électrode qui a été inséré dans le cerveau est capable d'enregistrer des changements dans la génération d'un neurone de potentiels d'action au fil du temps.

Alors que de nombreuses techniques permettent d'enregistrer l'activité du cerveau, unitaire électrophysiologie est une des méthodes les plus précises en permettant la résolution au niveau du neurone unique. Lorsqu'un degré élevé de spécificité spatiale est recherchée, microfils peuvent être utilisés pour cibler des sous-ensembles ou des noyaux de cellules au sein de la brain3 discrètes. Enregistrements unitaires bénéficient également d'une haute résolution temporelle que les enregistrements sont précis au niveau de la microseconde. Et, in vivo, uneenregistrements d'éveil permettent une interaction de circuits intacts, avec le milieu naturel de afférentes et efférentes projections, les influences hormonales chimique systémique et et les paramètres physiologiques. Signaux neuronaux sont dérivées de données sensorielles, des comportements moteurs, traitement cognitif, la neurochimie / pharmacologie, ou une combinaison. En conséquence, la ségrégation des, moteur, cognitif et chimiques influences sensorielles nécessite des expériences bien conçues avec risques et des contrôles efficaces qui peuvent permettre à l'évaluation de chacun des influences précitées. Dans l'ensemble, les enregistrements de comportement des animaux permettent expérimentateurs d'observer l'intégration de multiples sources d'information au sein d'un circuit de fonctionnement et d'obtenir un modèle plus complet de la fonction de circuit.

Enregistrements unitaires souffrent aussi d'un certain nombre d'inconvénients dont un expérimentateur doit être conscient. Tout d'abord, les enregistrements peuvent être difficiles à mener. En effet, les propriétés de ee amplificateurs de headstage et les microfils implantées qui permettent spécificité spatiale et temporelle de ces enregistrements fait aussi des enregistrements sensibles à l'influence de signaux électriques parasites (c.-à-électrique "bruit"). En conséquence, la capacité de résoudre les problèmes dans un système électrophysiologique nécessite une compréhension technique bien développé des principes et appareils électrophysiologiques. Il est également important de noter que, dans certaines circonstances, les signaux électriques enregistrés dans des enregistrements extracellulaires peuvent représenter la somme de plusieurs signaux neuronaux. En outre, la généralisation de l'activité unitaire à l'activité de la population dans une région cible peut souvent être limitée par le degré d'hétérogénéité cellulaire dans la région cible (mais voir Cardin ^4). Par exemple, les électrodes peuvent être sollicités vers l'enregistrement de neurones de sortie de forte amplitude à la place d'autres cellules. L'intelligibilité des enregistrements unitaires est augmentéeen combinant les enregistrements avec d'autres techniques, y compris, mais sans s'y limiter, électrique (orthodromique ou antidromique), de stimulation (par exemple, par iontophorèse ou récepteur de créateur) optogenetic ou ^4, inactivations neuronaux temporaires, sensorimoteurs examens ^5, les procédures de déconnexion, ou l'immunohistochimie chimique ^3.

Dans le protocole qui suit, nous allons énumérer les matériaux et les mesures nécessaires pour implanter un réseau de micro-fil organisée chez le rat (bien que le protocole peut être adapté pour une utilisation dans d'autres espèces). La procédure et le style de tableaux fixes utilisés dans notre laboratoire ont prouvé leur fiabilité pour les enregistrements longitudinaux et peuvent supporter des enregistrements de la même neurone de plus de temps d'un mois ^6-8. Cela rend cette procédure idéale pour examiner les réponses phasiques à des stimuli expérimentaux, les changements plastiques dans les réponses de neurones, ou de mécanismes d'apprentissage et de motivation.

Protocol

Le plus grand soin doit être pris pour maintenir des conditions aseptiques (comme décrit dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire ⁹⁾ lors de la préparation et la conduite de la procédure suivante. Le protocole suivant est en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Rutgers. On estime que les procédures ultérieures, il faudra 3-6 heures pour compléter.

L'implantation de la baie Microwire:

1. La place des animaux sous anesthésie à l'aide de 50 mg / kg de pentobarbital de sodium (IP) et l'administration de 10 mg / kg de nitrate d'atropine de méthyle (IP; Glycopyrrolate peut être substitué) et 0,25 mg de pénicilline (300 000 U / ml im) pour maintenir la fonction respiratoire et prévenir l'infection , respectivement.
   Remarque: Avec la longueur de 3-6 h de cette chirurgie d'implantation, le pentobarbital de sodium est utilisé parce qu'il est rentable et limite l'exposition humaine àanesthésiques (cela peut se produire avec l'utilisation prolongée d'anesthésiques de gaz) tout en offrant une anesthésie de longue durée. La substitution d'autres anesthésiques est acceptable.
2. Vérifiez que l'anesthésie a pris effet en utilisant le test de pincement queue avant de poursuivre.
3. Le cas échéant, donner alternatif injections de chlorhydrate de kétamine (60 mg / kg IP) et de pentobarbital de sodium (5-10 mg / kg IP) pour maintenir l'anesthésie pendant toute la chirurgie.
4. Raser le cuir chevelu à l'aide d'une lame de scalpel n ° 22.
5. Désinfecter le cuir chevelu rasé avec de la povidone iode.
6. Donnez injections sous-cutanées de bupivacaïne (~ 1 mg / kg SC, réparties sur 4 sites d'injection) pour anesthésier localement le cuir chevelu. Laisser 5-10 min pour l'anesthésique local pour prendre effet.
7. Placez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour maintenir l'humidité pendant l'anesthésie.
8. Fixez l'animal dans les barres d'oreilles et le nez pince d'un appareil stéréotaxique.
9. Utilisez repères visuels (par exemple une barre horizontale sur le stercadre eotaxic) à peu près au niveau de la tête de l'animal. Cette étape est uniquement destinée à peu près au niveau du crâne.
10. Faire une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu à l'aide d'une lame de scalpel # 11 monté sur un support de scalpel. L'incision doit s'étendre à partir de juste en arrière des oreilles à la partie postérieure de l'os nasal.
11. Avec une spatule de dissection, effacer le crâne de tous les tissus restants jusqu'à ce que les crêtes du crâne latérales et le crâne crête postérieure ont été atteints.
12. Tirez la peau autour de l'incision à l'aide d'un certain nombre de pinces hémostatiques (6x).
13. Nettoyez le crâne de tout le sang et laisser sécher. Si un saignement se produit restant, mettre fin à l'hémorragie résiduelle avec un petit outil de cautérisation. Faire en sorte que le crâne reste propre et sec permet la acrylique dentaire utilisé dans des étapes ultérieures de se lier de manière permanente sur le crâne.
14. Mark bregma et lambda (figure 2D) par interpolation l'intersection des sutures du crâne. Un micro dissectionroscope est nécessaire de marquer précisément ces positions.
15. Attacher un objet pointu petit (par exemple, une broche ou foret dentaire) à un bras stéréotaxique et l'abaisser pour déterminer la dorsale / ventrale (DV) de coordonnées de bregma et lambda.
16. Ajuster le collier de nez jusqu'à ce que les coordonnées DV pour bregma et lambda sont à moins de 100 pm (0,1 mm) les unes des autres.
17. Une fois stabilisée, enregistrer la partie antérieure / postérieure (AP), médial / latéral (ML) et coordonne DV de bregma avec la position de la pince de nez. Vérifiez les coordonnées pour la précision, comme le reste de l'opération dépend de la précision de ces coordonnées.
18. Utilisez les coordonnées mesurées pour calculer la ML et coordonne AP pour les quatre coins de la "fenêtre de crâne" par rapport à bregma (c.-à-craniotomie; Figure 1). La fenêtre de crâne est un rectangle positionné précisément par lequel le réseau de micro-fil va passer.
19. Utilisez les coordonnées calculées à l'occasion ducoordonne fenêtre crâne sur le crâne à l'aide d'une fixation de stéréotaxique pointu et encre de stylo-plume. Pour obtenir des notes précises, appliquer une petite quantité d'encre à la pointe de l'outil de marquage à l'aide d'un coton.
20. Percer la fenêtre de crâne en enlevant l'os dans une série de petites couches.
    1. Commencez par percer les coins marqués de la fenêtre où les marques ont été placés.
    2. Ensuite, connectez les coins et définir la fenêtre.
    3. Enfin, effacer la zone à l'intérieur du contour à la profondeur de la dure-mère. Le trou doit être plus large (c.-à-biseauté) au-dessous des couches superficielles de la boîte crânienne à faire en sorte que la fenêtre maintient une largeur appropriée de haut en bas.
21. Utilisez microforceps à retirer soigneusement les copeaux d'os tout en restant, des débris ou la dure-mère dans la fenêtre de crâne. Cette étape est très importante, car ces morceaux de matériau peuvent compromettre l'intégrité de la matrice lors de la descente. Une fois autorisé, il faut garder èmee fenêtre humide avec une solution saline bactériostatique pour le reste de la chirurgie.
22. Placez des marques sur le crâne pour 5 vis du crâne et 1 fil de terre (figure 1). Ces positions peuvent varier en fonction de la région ciblée du cerveau. Le headstage sera plus sûre si une vis est placée sur chacun des 5 os du crâne. Placez les deux vis du crâne et fil de terre dans des endroits qui ne sera pas interférer avec la mise en place de réseau de micro-fil.
23. Percer les trous pour les vis de crâne et serrez les vis en place. Les vis doivent être abaissés jusqu'à ce que seulement 3-4 les discussions montrent (ou, si l'aide de vis autres que celles recommandées, assez profond pour traverser l'épaisseur du crâne de promouvoir la stabilité de la matrice mais pas trop profonde afin d'endommager le cortex). Nettoyer les filets des vis après le placement.
24. Percez un trou pour le fil de terre. Abaissez le fil lentement (1-2 min) à la prise DV cible coordonner et fixer le fil en place utilisant l'acrylique dentaire.
25. Ajouter acrylique autour des filetsdes vis de crâne. Avant le séchage acryliques, enlever tout excès de ciment qui s'écoule à partir du fil de terre ou vis de crâne. Laisser 15 min pour le acrylique dentaire à sécher / durcir.
26. Fixez l'ensemble à bras stéréotaxique. Niveler le tableau et l'orienter de sorte qu'il sera carrément passer à travers les limites de la fenêtre de crâne.
27. Placer la solution saline dans la fenêtre de crâne de sorte qu'il est au niveau du crâne. Abaissez le tableau jusqu'à ce qu'elle crée une fossette dans la solution saline. Cette coordination est utilisé comme niveau de crâne pour le tableau. Utilisez cette valeur pour calculer la DV finale coordonnées de la matrice.
28. Abaissez lentement le tableau jusqu'à ce qu'il atteigne sa DV finale coordonnées. Arrêter chaque 1mm d'abaissement et d'attendre pendant plusieurs minutes afin de permettre aux tissus du cerveau à se remettre de capitonnage et pour dissoudre la partie de fond du polyéthylène glycol (PEG) sur la matrice (PEG est utilisé pour conserver temporairement les fils dans leur conformation, tout en réduisant , et se dissout lentement dans une solution saline).
29. Lorsque le tableau est de 1mmà une distance de la cible, plus l'abaisser lentement jusqu'à ce que l'objectif final est atteint. L'abaissement de 0,1 à 0,2 mm, à un moment avant de permettre au tissu de se reposer pendant une période de 5 min est destinée à préserver le tissu au niveau du site cible, ainsi que des connexions synaptiques proximales. Si le matériel est disponible, la précision abaissement de la matrice peut être assistée en utilisant un manipulateur motorisé.
30. Dissoudre le PEG restant et utiliser acrylique dentaire à cimenter les microfils en place. Ajouter plusieurs couches de ciment afin de s'assurer que les fils sont en sécurité, puis laisser 15-20 min pour le ciment durcir avant de poursuivre. Cela garantit que les fils ne seront pas bousculés de leur classement final.
31. Construire le reste de la headstage de l'animal à l'acrylique dentaire. Utilisez l'acrylique pour envelopper les vis de crâne, fil de terre, et le connecteur pour les microfils. Laissez le chapeau acrylique durcir suffisamment avant de procéder.
32. Suturer l'incision du cuir chevelu à l'aide sutures absorbables et administrer 2 ml of saline bactériostatique (sc) pour restaurer l'hydratation de la chirurgie.
33. Retirer l'animal à partir des barres d'oreilles et placer le sujet dans un endroit propre. Observer l'animal fréquemment pendant la récupération post-opératoire jusqu'à la thermorégulation et de la locomotion ont récupéré. Après récupération de l'anesthésie, déplacer l'animal dans un seul boîtier pour le reste de la récupération post-opératoire.
34. Donnez animaux surveillance postopératoire quotidienne et des soins dans les jours suivant la procédure. Récupération de cette procédure est optimale lorsque sept jours ou plus sont autorisés.
35. Donnez animaux des injections de Carprofen (5mg/kg) et Enrofloxacine (5-10 mg / kg) ou leurs équivalents lors de la récupération par le calendrier recommandé par le vétérinaire traitant.

Representative Results

Discussion

Enregistrements extracellulaires représentent une technique expérimentale puissante qui peut être incorporé dans presque toute la préparation expérimentale en neurosciences. Fils qui ont été implantés dans des réseaux organisés peuvent être suivis comme leurs arbres traversent le cerveau et dans leur région cible (figure 5A). Quand une petite lésion, post-expérimental est créé à la pointe de micro-fil non isolé pour créer un petit dépôt de fer du fil d'acier inoxydable, on peut précisément marquer l'emplacement de la pointe de micro-fil non isolé (où la seule unité a été enregistré) en utilisant une solution 5% de ferrocyanure de potassium et 10% de HCl (figures 5A et 5B; points bleus). Ainsi, on peut aisément utiliser une série de tranches de cerveau ultérieures de recréer la position de l'ensemble du réseau, à l'intérieur du cerveau. Enfin, les techniques mentionnées ci-dessus peuvent être facilement combinés avec des immuno-histochimie afin d'augmenter la spécificité spatiale des enregistrements, dans le butpour vérifier placements cibles, et même pour étudier les différences sous-régionales au sein d'un seul noyau cible ³ (figure 5B).

Pour atteindre la spécificité spatiale souhaitée, les tableaux de microfilaires doivent être conçus et implantés avec soin. Tout d'abord, l'espacement des rangées et des colonnes dans la matrice doit être conçu spécialement pour la région d'intérêt. Les tableaux qui sont trop longs ou large pour la cible souhaitée peut diminuer la précision ou de produire un grand nombre de fils qui se situent à la frontière entre deux noyaux adjacents. Dans le même temps, microfils espacées trop étroitement ensemble peuvent interdire une démarcation distincte de chaque électrode. Deuxièmement, les tableaux de microfilaires doivent être manipulés avec soin afin de préserver l'intégrité du réseau. Seule électrode tableaux sont produites à l'aide de minces fils, comme des cheveux qui peut facilement être endommagés ou se bousculaient de leur configuration lorsqu'il est contacté. Les qualités de ces fils sont idéales pour réduire les dommages to tissu sur la voie d'approche de sa cible et aussi permettre aux fils de se déplacent de concert avec de petits mouvements du cerveau. Ainsi, il est généralement conseillé de stocker des tableaux dans un endroit sûr et éviter de supprimer des tableaux de leurs étuis de protection que juste avant l'implantation. En outre, il faut prendre soin lors de la stérilisation des tableaux de microfilaires. Dans certains cas, l'autoclavage d'électrodes peut être acceptable. Cependant, l'oxyde d'éthylène ou de désinfection UV peut être préférable de protéger les tableaux fragiles. Enfin, l'électrode métallique et l'isolation, et le diamètre de chacune, doivent être soigneusement pris en compte. Par exemple, seuls les électrodes qui contiennent du fer (par exemple en acier inoxydable) seront en mesure de produire des réactions bleu de Prusse pour la délimitation individuelle de chaque micro-fil dans le tableau.

À l'occasion, microfils de la matrice seront s'écarter de leur configuration lors de la descente en raison d'obstacles inaperçus (par exemple fragments de crâne dans la fenêtre de crâne) ou pauvres handling. Dans ces cas, un tel micro-fil peut être suivi souvent encore à sa pointe (bien qu'il sera probablement à l'extérieur de la région cible). Si un exemple se produire lorsque toute micro-fil numérotés dans la matrice ne peut pas être vérifiée, il est important pour l'intégrité de l'expérience que cet animal soit retiré de l'ensemble de données. Interprétation erronée de la position d'un micro-fil individuel peut permettre à ses signaux neuronaux de compliquer ou de l'interprétation de corruption des données.

Pendant l'implantation, la précision de la fenêtre de crâne et l'alignement du tableau sont également essentielles pour cibler précision. Crâne fenêtres doivent être suffisamment larges pour permettre le tableau de passer sans se plier ou endommager les fils. D'un autre côté, la fenêtre est également utilisé pour guider avec précision la matrice vers la position cible et doit donc être percé avec précision dans chaque dimension. Lorsque vous êtes prêt pour l'implantation, il faut aussi être certain que le réseau est à l'aplomb de la fenêtre de crâne dans toutes les dimensions. Autrement dit,une légère inclinaison de la matrice dans n'importe quelle dimension peut provoquer la matrice soit partiellement ou totalement manquer le noyau cible. Enfin, une attention particulière doit être prise lors de la descente de la première 1-3 mm. C'est lors de la première descente que des morceaux de débris qui auraient pu passer inaperçus dans la fenêtre de crâne peuvent compromettre l'intégrité du réseau et perturber le chemin de microfils. Si le chemin des microfils est obstruée pendant qu'ils sont lentement abaissé, on peut voir microfils plier ou courber légèrement sous grossissement avant le tableau encourt des dommages (par exemple en utilisant une loupe). À ce stade, microfils peuvent être rétractés et les débris peuvent être effacés de la fenêtre avant de poursuivre l'implantation.

Last but not least, l'implantation réussie de réseaux de microfilaires nécessite une attention particulière au maintien d'une salle d'opération aseptique et des soins post-opératoires approfondie. Lorsqu'il est combiné avec les précautions mentionnées ci-dessus, les enregistrements viables peuvent être obtenus à partir derégions d'intérêt pour la hausse d'un mois; nous avons vérifié les enregistrements jusqu'à 40 jours après la chirurgie ^6. Peut-être le plus important, la longévité de ces enregistrements fournit l'occasion d'étudier les circuits fonctionnels discrets dans le milieu complexe des influences hormonales électrique, chimique, et répondre à des questions essentielles sur le rôle de ces circuits dans l'apprentissage et la motivation.

Materials

<strong>Table 1. List of Surgical Materials.</strong>
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotton Swabs	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropine Methyl Nitrate	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein (Bayer)	1040007
Ketamine Hydrochloride	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Model 900
Cauterizing Tool	Stoelting	59017
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ445
Dental Drill	Buffalo	37800
Bacteriostatic Saline	Bulter Schein	8973
Jewlers Screws	Stoelting	51457
Microwire Array	Microprobes	Custom (Flexible)
Ground Wire	Omnetics	Custom Plug
Dental Acrylic	Fisher (BAS)	50-854-402
Absorbable Sutures	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant)	Fisher (Henry Schein)	008897
<strong>Table 2. List of Surgical Instruments.</strong>
2x Microforceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps	George Tiemann Co.	#160-93	Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats	George Tiemann Co.	#105-1125	Clamp and open incision
1x Small scissors	George Tiemann Co.	#105-411	Cut sutures after tying
1x Tissue forceps	George Tiemann Co.	#105-222	Holding tissue while suturing
1x Needle holder	George Tiemann Co.	#105-1259	Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade)	George Tiemann Co.	#105-80 (w/ #105-71 blade)	Making skull incision
1x #22 Scalpel blade	George Tiemann Co.	#160-381	Shaving scalp
1x Surgical Spatula	George Tiemann Co.	#160-718	Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws	Various	N/A	0/80 x 1/8&rdquo;
<strong>Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.</strong>
Microwire Array &amp; Connector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Part No. based on array characteristics)	Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, <em>etc</em>.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card&nbsp;	Data Translation (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card	Measurement Computing (Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquires behavioral inputs and outputs