Détection du génome et des transcriptions d'un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L'hybridation combinée avec immunocoloration

Résumé

Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.

Résumé

Cellule à l'unité co-détection d'un gène, le produit de l'ARN et des protéines régulatrices cellulaires est critique pour étudier la régulation de l'expression génique. Il s'agit d'un défi dans le domaine de la virologie, en particulier pour les virus à ADN persistants nucléaires répliquant qui impliquent des modèles animaux pour leur étude. Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) établit une infection latente permanente dans les neurones périphériques. Virus latent sert de réservoir, d'où il réactive et induit un nouvel épisode herpétique. La biologie de la cellule de HSV-1 de latence reste mal compris, en partie en raison de l'absence de méthodes pour détecter les génomes de HSV-1 in situ dans des modèles animaux. Nous décrivons un ADN hybridation fluorescente in situ (FISH) dans l'approche détecter efficacement faible nombre de copies de génomes viraux dans des coupes de tissus neuronaux de modèles animaux infectés. La méthode repose sur démasquage antigénique à base de chaleur, et des sondes d'ADN directement marqués maison, ou des sondes disponibles dans le commerce. Nous avons développé un stai tripleapproche ning, combinant l'ADN à l'ARN FISH-FISH et immunofluorescence, en utilisant la peroxydase en fonction d'amplification du signal pour accueillir chaque exigence de coloration. Une amélioration majeure est la possibilité d'obtenir, dans les 10 sections um de tissu, les signaux basse fond qui peuvent être imagés à haute résolution par microscopie confocale et à grand champ épifluorescence classique. De plus, la coloration triple a travaillé avec une vaste gamme d'anticorps dirigés contre les protéines cellulaires et virales. Le protocole complet 2,5 jours pour accueillir anticorps et la pénétration de la sonde dans le tissu.

Introduction

Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l'établissement d'une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l'hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte ^1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l'expression des gènes est limitée à la transcription associé à la latence (LAT) locus, à partir de l'établissement de la latence initiation de réactivation ^3. LAT produit une longue 8,5 kb non codantes de l'ARN transformé en un 2 ko lasso majeur stable, et plusieurs miARN ^4-7. HSV-1 de latence se caractérise donc par la présence de l'ADN viral génomique, ARN LAT, et l'absence de protéines du cycle de replication détectables.

ontenu "> modèles animaux, principalement la souris et le lapin, sont des modèles expérimentaux récapitulant quelques éléments sur la latence chez l'homme. L'un des principaux intérêts de ces modèles est qu'ils permettent d'étudier les aspects physiologiques de HSV-1 de latence dans les sujets immunocompétents. cours des dernières décennies , de nombreux outils expérimentaux, tels que des virus et des souris génétiquement modifiées, ont été développées pour étudier la physiologie, de la génétique et de la biologie cellulaire de HSV-1 de latence, à partir de tissus animaux. Jusqu'à présent, l'ADN génomique viral a été détecté et quantifié par transfert de Southern et qPCR de dissocier les TG. Toutefois, il n'existe actuellement aucune méthode pour détecter le HSV-1 génomique par hybridation in situ sur des coupes de tissu ^8. En conséquence, la latence est couramment évaluée sur des coupes histologiques par la détection de l'ARN LAT par hybridation d'ARN in situ, plutôt que la détection du génome viral. Comme il a été impossible de caractériser les cellules infectées en fonction de la présence de génomes viraux, this limitation technique a été un inconvénient majeur pour l'analyse de nombreux aspects des interactions hôte-virus, tels que la relation entre le génome viral et l'expression cellulaire et virale ou gène de l'hôte à médiation cellulaire réponse immunitaire ^9,10.

Plus important encore, l'hétérogénéité de l'infection latente de cellule à cellule reste relativement inexploré et a été montré pour être un élément clé de la latence chez la souris et dans les neurones ganglionnaires sensorielles humaines implantées dans des souris SCID ^11-17. En règle générale, il a été montré par qPCR que le génome de HSV-1 du nombre de copies par cellule varie de 5 à plusieurs centaines. Bien que LAT apparaît comme un régulateur clé de la latence et la réactivation, les données qPCR sur les neurones isolés et en PCR in situ ont indiqué que seul un sous-ensemble de neurones infectés de manière latente, aussi bas que 30%, exprime le locus LAT ^11,12,18-21. Comment la cellule hôte et l'environnement cellulaire à l'intérieur de l'impact de la mise en place sur le tissu de la latence du virus etexpression des gènes viraux reste incertaine. Nous décrivons ici un solide hybridation fluorescente in situ (FISH) de la méthode pour la détection efficace de la copie de faible HSV-1 de l'ADN génomique à l'intérieur des sections de tissus neuronaux animales dans. Cette méthode a été conçue et utilisée par nous pour obtenir l'accès à haut microscopie imagerie de résolution qui est nécessaire pour étudier l'interaction du génome viral avec les cellules de l'hôte composants intra-nucléaires ^22. En outre, nous décrivons un procédé de coloration multiple pour la détection simultanée de l'ADN viral à ARN et des protéines, qui est un outil unique pour décrire les interactions virus-hôte qui régulent l'expression des gènes viraux. La méthode peut également être appliquée à un large éventail d'analyses nécessitant la détection de HSV-1 génome latent, comme la quantification des neurones infectés dans grand nombre de sections. Une étape clé est d'appliquer un traitement de récupération de l'antigène de faire l'ADN viral accessible à l'hybridation. Ainsi, ce protocole pourrait également être efficace pour la détectiond'autres virus ADN double brin, qui ne sont actuellement pas détectable par des approches ADN-FISH conventionnels dans les tissus animaux.

Protocole

Cette méthode a été utilisée dans une étude publiée précédemment ^22. Pour le fond général et la description de la manipulation classique sur ISH, IF et FISH, nous suggérons la littérature disponible après ^23.

Une. Infection des animaux

Toutes les procédures impliquant des animaux expérimentaux conformes aux questions d'éthique de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) Déclaration de l'utilisation des animaux en recherche, et ont été approuvés par le comité d'éthique local UPR-3296-CNRS, en conformité avec la Communauté européenne Directive 86/609/CEE du Conseil. Tous les animaux ont reçu un accès illimité à la nourriture et de l'eau.

Le procédé de l'infection de la souris par le HSV-1 décrit ci-dessous a été utilisée dans des études précédemment publiées ^24-26.

1. Préparer les solutions suivantes pour se préparer avant départ:
   
   Solution HSV-1 stock de virus
   Solution anesthésier - Kétaminee-100 mg / kg et xylazine-10 mg / kg
   
2. Prenez 1 pl de virus (10 ⁶ pfu) dans une micro-5 de verre pi reliée à un dispositif de pompe à microseringue fournir 0,1 pi / sec. Remarque: Reprendre le stock de virus dans un milieu dépourvu de rouge phénol pour voir la limite entre l'huile rouge présenter dans le capillaire et la solution de virus et d'éviter l'injection d'air au niveau du site de l'inoculation du virus.
3. Posez la souris anesthésiée (kétamine-100 mg / kg et de xylazine-10 mg / kg) sur sa face vers le haut.
4. Positionner la tête de souris anesthésiée sous un stéréo-microscope binoculaire et insérer l'aiguille dans la couche sous-épithéliale de la lèvre supérieure gauche à la frontière cutanéo-muqueuse. Injecter la solution de virus en deux étapes (deux fois 0,5 ul) à une vitesse de 0,5 ul toutes les 5 sec. Remarque: respecter une pause de 10 secondes entre les deux injections de 0,5 ul, pour permettre à la suspension virale à absorber au niveau du site d'injection.
5. Placez la souris dansun 37 ° C incubateur jusqu'à réveillant.
6. Laissez la souris dans les animaleries pour récupérer le temps nécessaire. Remarque: Dans le modèle de la souris, le HSV-1 induit une primo-infection, appelée infection aiguë, qui dure moins de 10 jours sur le site de l'inoculation et dans plusieurs tissus neuronaux, y compris TG, supérieure ganglions cervicaux (SCG), et les ganglions rachidiens (DRG) en fonction du site d'inoculation. Des signes d'infection primaire disparaissent progressivement et la latence est considéré comme pleinement établie sur 28-30 jours post-infection (dpi) et suivants. Tissus neuronaux peuvent être récoltés habituellement de 4 dpi pour les études sur l'infection aiguë, et de 28 dpi pour les études de latence.

2. Souris Perfusion-fix

1. Préparer les solutions suivantes avant de commencer: 50ml de tampon de sérum physiologique
   
   60 ml de PBS 1x
   150 ml de paraformaldehyde fraîchement préparée de 4% dans du PBS 1x
   60 ml de saccharose à 20% dans du PBS 1X.
   
2. Préparer la tubulure de perfusion: relier l'aiguille à un tube capillaire, qui est relié à une pompe péristaltique.
3. Anesthésier la souris comme décrit ci-dessus (SREP 1.2) et le poser sur le dos sur un plateau de dissection, attachée par les quatre pattes avec des épingles.
4. L'aide de ciseaux coupent la peau du ventre jusqu'à la gorge *. Arracher la couche de tissu mince recouvrant les organes. Ouvrir la cage thoracique en coupant les nervures sur un côté du sternum. Enlever la peau en arrachant. Eloignez-vous de l'autre le droit et les pièces à gauche de la cage thoracique pour révéler le cœur. Remarque: Faites attention à ne pas inciser les entrailles, les poumons et les grands vaisseaux (artères carotides et les veines jugulaires), ce qui rendra perfuse fixation impossible.
5. Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche *. Inciser l'oreillette droite avec les ciseaux. Procéder à la saignée en injectant 20 ml de sérum physiologique dans les vaisseaux sanguins dans le coeur. Laissez le débit sanguin dans le bac. Aucunete: Au cours de cette procédure, faites attention à ne pas percer à travers l'autre côté du coeur.
6. Perfuser avec 150 ml de PFA à 4% dans du PBS 1X pendant 15 min * (Attention: PFA est toxique, manipuler sous une hotte). Perfuser 60 ml de saccharose à 20% dans PBS 1x pendant 6 min. A ce stade, la souris est prête pour la récolte TG. Remarque: Régler la pompe de 10 ml / min. Une bonne perfusion est perceptible lorsque la queue de la souris se raidit, lève alors retomber.

3. TG récolte

1. Préparer la solution suivante avant de commencer:
   
   20% de saccharose dans du PBS 1x
   
2. Couper la tête au niveau du cou. Couper le bout du nez juste derrière les incisives afin de révéler la cavité nasale. Inciser la bouche en deux avec des ciseaux et de s'éloigner de chaque côté de la bouche. Remarque: Les GT apparaît juste sous la bouche, comme deux masses blanches et oblongues de 2-3 mm de longueur situé sur la droite etcôté gauche et reliée au nerf trijumeau.
3. Couper les branches du nerf trijumeau de chaque côté de la TG pour libérer la TG du tronc cérébral. Retirez le TG avec des pinces chirurgicales et les conserver dans une solution stérile de saccharose à 20% pendant 24 heures. Remarque: Utilisez deux Les différents destinataires pour la gauche et la droite TG, pour éviter toute confusion entre le TG gauche (infectés) et le droit TG (pas ou faiblement infectés). Incuber la TG en saccharose à 20% dans PBS 1x pendant 24 heures avant de l'intégrer.
4. Incorporer TG en un seul bloc dans cryosectioning milieu d'inclusion et le gel à -80 ° C.
5. blocs de magasins à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe.

4. Cryosection Préparation

1. Coupez les en longueur TGS comme sections de 10 pm sur un -20 ° C cryostat, et de les placer sur des lames (30 ° C) Superfrost légèrement chauffés. Laissez les tranches sécher pendant 5-10 minutes puis congeler et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Remarque: Jusqu'à 4-5 sections peuvent être placed sur une seule lame, si grand nombre de sections doivent être traitées en même temps. Nous procédons comme suit: des coupes en série sont déposés sur 3 séries de diapositives marqué A1, B1, C1 et, alors A2, B2, C2 et ainsi de suite. Ainsi, chaque série de coulissement (A, B, et C) peuvent être traitées pour une coloration différente (hybridation in situ, du poisson dans, la PCR in situ, LCM) et des données obtenues en utilisant les différentes techniques peut être comparé sachant que les lames portant le même numéro correspondent à la même région de la TG.

5. HSV-1 Sonde étiquetage

Le protocole décrit ci-après pour la détection de HSV-1 par de l'ADN génomique de poisson a été utilisé avec succès deux types de sondes. La première est une marqué au Cy3 sonde fluorescente fait maison qui est approprié pour l'analyse fine de l'organisation nucléaire dans des cellules individuelles, par microscopie fluorescente haut de grossissement. La seconde est une sonde biotinylé disponible dans le commerce, qui peuvent être combinerd à la peroxydase avec une amplification du signal pour fournir un signal lumineux. Celui-ci est approprié pour l'identification et la quantification des virus contenant des neurones à faible grossissement dans l'article entier, et pour l'analyse des modèles de génome de HSV-1. Les utilisateurs finals devraient évaluer quelle approche convient le mieux à l'objectif de leur étude. La sonde disponible dans le commerce est listé dans la section de réactif, et la préparation de la sonde de home-made est décrite ci-dessous.

1. Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
   
   HSV-1 du génome contenant des vecteurs (voir l'étape 1)
   70% d'éthanol, qualité de biologie moléculaire.
   
2. . Préparer cosmides contenant des portions de 30 ko de HSV-1 génomes (cosmides numéro 14, 28 et 56 décrits dans la référence ²⁰ en utilisant des colonnes de purification dédiés aux vecteurs Remarque: D'autres types de bibliothèques contenant HSV-1 génomes, comme les chromosomes bactériens artificiels devraient fonctionner aussi bien, aussi longtemps que la sonde couvre alpartie de arge du génome HSV-1 pour produire un signal suffisamment ^27-29. En nos mains, les sondes réalisées à partir du squelette du vecteur cosmidique ne produisaient aucun signal, et ont été utilisés comme contrôle négatif. Ainsi vecteurs cosmides entiers contenant la séquence de HSV-1 ont été utilisés dans notre étude. Il est également possible de découper la séquence de HSV-1 et de l'utiliser pour préparer la sonde.
3. . Étiquette 2 pg de chaque cosmide avec Cy3-dCTP en utilisant un kit pseudo-traduction selon les directives du fabricant Remarque: Effectuez l'étiquetage d'un mélange réactionnel contenant seulement Cy3-dCTP et pas dCTP non marqué.
4. Arrêter la réaction en ajoutant 3 ul d'EDTA 0,5 M dans le mélange et le chauffage à 70 ° C pendant 10 min. Refroidir sur glace.
5. Purifier la sonde sur une mini-colonne d'exclusion sur gel G50. Ajouter 150 ug d'ADN de sperme de saumon pour précipiter la sonde et la sonde par précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN doit être rose en raison de Cy3 incorporation. Laver le culot avec 70% d'éthanol et de supprimer plus d'éthanolque possible avec une pipette. Ne laissez pas le culot sec.
6. Dissoudre le culot avec 100 pi de formamide désionisée (Attention: le formamide est toxique Manipuler sous une hotte.). La concentration de la sonde ne peut pas être évaluée de façon fiable à ce stade. Les quantités de sondes mentionnées dans le texte se réfèrent à la quantité de la matrice d'ADN utilisée pour effectuer la sonde. Le protocole est basé sur 2 pg de matrice d'ADN et 100 ul de formamide, il est considéré comme étant de 20 ng / ul. Conserver à -20 ° C. La sonde marquée peut être préparé en grande quantité et stockées congelées pendant plusieurs mois.

6. ADN-FISH

La figure 1 montre une vue d'ensemble des principales étapes du protocole ADN-FISH, et comment effectuer ADN-FISH dans le cadre d'une expérience de coloration multiple à codetect ARN et de protéines, comme décrit dans les protocoles 7-9.

1. Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
   
   0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1x
   2x SSC et le tampon de SSC 0,2 x
   Mm 100 mm pH 6.0 tampon citrate (10x solution mère) et 10 pH 6,0 tampon citrate (solution de travail)
   Tampon d'hybridation 2x (voir protocole n ° 4)
   
2. Au jour 1, placer les lames sur un support de diapositives à la température ambiante, et que les sections sécher pendant 10 min. Encerclez les sections avec un stylo hydrophobe. Réhydrater les sections 1x PBS pendant 10 min. Incuber les sections 20 min avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1x pour perméabiliser les tissus. Laver pendant 3x 10 min avec 2x SSC, et garder en 2x SSC jusqu'à ce que le tampon de démasquage est chauffé (voir ci-dessous).
3. Pour démasquer, préparer une plaque à lame de verre (20 lames de la capacité) rempli de 200 ml de 10 mM de tampon de citrate de sodium (pH 6,0). Placer le plateau dans un grand récipient, rempli avec 500 ml d'eau distillée. Ce réglage permet une meilleure maîtrise des impulsions de chauffage. Avant de placer les lames dans le bac, préchauffer le tampon dans le four à micro-ondes jusqu'à ce que la buffre atteint ébullition (environ 8 min à 800 W).
4. Placer les lames dans le bac contenant de tampon citrate préchauffé, et vérifier qu'ils sont complètement recouverts de tampon. Feu doux pendant environ 20 secondes jusqu'à ce que le tampon atteint ébullition. Attention, ne laissez pas le tampon sur ébullition, ce qui pourrait endommager les tissus. Refroidir à la température ambiante pendant 2 min. Répéter le cycle de 6x de chauffage (7 cycles de chauffage au total) *. Refroidir 2 min et transférer les lames dans du SSC 2x pendant 5 min.
   * Remarque: Il s'agit d'une des étapes les plus critiques. Le nombre optimal et la durée des cycles de chauffage doivent être déterminées de manière empirique, et peut varier le type de tissu ou du type de sonde utilisée. Le four micro-ondes, un plateau, d'un conteneur et le volume de tampon dans le bac et de l'eau dans le conteneur doivent être conservées identiques pour la reproductibilité de démasquage. Ébullition excessive pourrait entraîner la perte de tissus et cellules endommagées. Pour chaque impulsion de chauffage, l'apparition d'ébullition est soigneusement surveillé, et de la chaleurtion devrait être arrêter aux premiers signes d'ébullition. Une fois mis en place, démasquage semble robuste et reproductible. Figure 2A montre que le HSV-1 génome peut être détectée par démasquer avec différents tampons, ce qui indique que les conditions de démasquage peuvent être explorées. Démasquage base de citrate a été trouvé à fournir régulièrement un bon signal FISH, et la préservation des tissus, avec des sections de différents modèles de laboratoire et les animaux.
5. Incuber les lames dans un mélange méthanol: acide acétique: PBS mélange (03:01:04) pendant 15 min, puis dans un mélange méthanol: mélange d'acide acétique (3:1) pendant 15 min (Attention: l'acide acétique est corrosif Manipuler sous fumées. capot et utiliser une protection adéquate. Préparer cette solution juste avant utilisation).
6. Déshydrater la coupe successives de 10 minutes d'incubation à 70%, puis 2 fois 10 min dans 100% d'éthanol. Laissez sécher à température ambiante pendant 10 min. Garder au sec jusqu'à sonder.
7. Préparer la solution de sondage comme suit: préparer à l'avance un bilan de 20 ml 2x co tampon d'hybridationntaining 20% ​​de sulfate de dextran (PM 500 000), la solution de Denhardt 2x, 4x SSC *. Aliquoter la solution que 500 pi dans des microtubes, et conserver à -20 ° C. Pour une diapositive (lamelle de 22 mm x 50 mm), mélanger 90 ng de HSV-1 sonde marqué au Cy3 (30 ng de sonde pour chaque cosmide) et compléter le volume à 40 pi avec le formamide. Ajouter 40 ul de tampon d'hybridation 2x. Mélangez bien par aspiration et à plusieurs reprises.
   * Remarque: Pour préparer le tampon 2x d'hybridation, mélanger 4 g de sulfate de 500.000 MW de dextran dans 10 ml d'eau distillée. Elle fait un mélange visqueux qui se dissolvent à 3-4 heures à 70 ° C. Mélanger régulièrement pour aider à dissoudre. Ajouter 4 ml de 20x SSC, 400 pi de solution de Denhardt 100x. Compléter à 20 ml et bien mélanger à l'aide d'un vortex.
8. Baisse de 80 pi de solution de sondage sur les sections sèches. Couvrir avec une lamelle de 22 mm x 50 mm de verre, et de vérifier que la solution de sondage s'étend surtoute la surface de la lamelle. Attention: il devrait y avoir aucune bulle. Présence de bulles diminue l'efficacité de l'hybridation. Sceller la lamelle avec du ciment de caoutchouc, et laisser sécher. Gardez les diapositives dans l'obscurité à la température ambiante pendant au moins 2 h pour le signal d'hybridation optimale tout au long de la glissière.
   Remarque: ciment caoutchouc est pratique car il sèche rapidement, est imperméable à l'eau, et protège l'échantillon de séchage lors de l'hybridation. Il est aussi facile à enlever pour enlever la lamelle après hybridation. Vernis à ongles est un autre efficace, mais l'option la moins pratique.
9. Procéder à la dénaturation en plaçant les lames sur un coulisseau incubateur à 80 ° C pendant 5 min. Sinon, placez les lames sur un plateau de métal et placer le plateau dans un bain d'eau à 80 ° C (le bac doit flotter). Puis transférer rapidement les diapositives sur un plateau métallique placé sur la glace. Laisser poser 5 min. Transférer les lames à 37 ° C (chauffage de diapositive ou incubateur) pour hybridation pendant la nuit.
   Note: Nous ne recommandons pas l'hybridation plus courte, ce qui se traduit par une faible ou pas de signal.
10. Au jour 2, retirer la colle de caoutchouc avec une pince, tout en maintenant la lame sur l'élément chauffant afin de maintenir la section à 37 ° C. Retirer la lamelle délicatement avec la pointe d'une lame de scalpel.
11. Laver 3 fois avec 2x SSC à 37 ° C pendant 5 min, et trois fois avec 0,2 x SSC à 37 ° C pendant 5 min. Laver une fois avec 2x SSC à température ambiante pendant 5 min, et de procéder à la coloration de l'ADN et de montage (voir le protocole 10 ci-dessous).
    Remarque: Cette méthode permet la détection de cibles génomiques cellulaires, à l'aide de sondes correspondant à la solution de palpage avec HSV-1 en tant que sondes spécifiques pour publiées et des séquences centromériques péricentromériques ^22.

7. Double FISH ARN-ADN

Voir la figure 1, les cases vertes pour un aperçu.

Pour multiplecoloration procédures, y compris une étape ARN-FISH, il est généralement conseillé d'effectuer la première détection de l'ARN en tant que telle cible est sensible à la dégradation par la RNAse et de produits chimiques. De plus, la procédure de l'ADN-FISH comprend des traitements qui réduisent l'efficacité de coloration autre. Pour ARN-FISH, nous avons choisi une approche de détection enzymatique basé (tyramide amplification du signal (TSA) en utilisant des sondes biotinylés et la peroxydase (HRP) streptavidine couplée). TSA est basé sur un substrat de tyramide fluorescent (voir le tableau de réactif pour plus de détails), qui est lié de manière covalente au tissu par une réaction enzymatique de la peroxydase. Le signal ARN-FISH est ainsi préservée pendant ADN-FISH.

1. Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
   
   Vecteur pour la transcription in vitro de locus LAT (pSLAT-2)
   1x PBS contenant 2 mM RVC
   0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1X contenant 2 mM de RVC
   3% de H ₂ 0 ₂ dans l'eau distillée.
   70%, 80%, éthanol à 95%, qualité de biologie moléculaire.
   Solution d'hybridation d'ARN 4x (voir protocole n ° 4)
   
2. Au moins un jour avant l'expérience ARN-FISH, préparer la sonde FISH ARN. Pour détecter le HSV-1 associé à la latence Transcription (LAT), préparer un ribo-sonde biotinylé du pSLAT-2 vecteur ^30, ou un autre vecteur pour la transcription in vitro du locus LAT, comme décrit précédemment en référence ^26. En bref: 10 ug de Linéariser pSLAT-2 avec HindIII et on purifie le vecteur digéré avec un kit de purification d'ADN. Synthétiser un brin unique ribo-sonde à partir de 2 ug d'digéré pSLAT-2 avec un kit T7 in vitro de la transcription en présence de la biotine-16-UTP *. Purifier la sonde avec une mini-colonne ARN et quantifier à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. Diluer la sonde à 50 ng / ul dans DNAse / RNAse eau libre et conserver à -80 ° C, en petites portions pour éviter les cycles de congélation-décongélation.
   * Remarque: La biotine-16-UTP: rapport UTP doit être déterminée de manière empirique. Nous fplaies un rapport de 40:60 à fournir des sondes de détection efficace LAT par l'ARN-FISH.
3. Au jour 1, placer les lames sur un support de diapositives à la température ambiante, et que les sections sécher pendant 10 min. Encerclez les sections avec un stylo hydrophobe. Réhydrater les sections 1x PBS contenant 2 mM ribonucléoside Vanadyl complexe (RVC) * pendant 10 min. Incuber les sections pendant 20 minutes avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS 1X contenant 2 mM de RVC pour perméabiliser les tissus. Laver 3x 10 min avec du PBS 1x, 2 mM RVC. Pour étancher toute activité de peroxydase endogène, incuber la section 3% _de H ₂ O ₂ pour 2x 10 min, puis laver une fois avec PBS 1x, 2 mM RVC.
   * Remarque: Tout au long de la procédure ARN-FISH, ribonucléosidique vanadyle complexe (RVC) est ajouté aux tampons et des solutions pour prévenir la dégradation de l'ARN.
4. Incuber 2 x 10 min dans 70% d'éthanol. A ce stade, les articles peuvent être stockés dans 70% d'éthanol à -20 ° C pendant plusieurs semaines. Déshydrater les sections par incubation dans 80%, 95% et 100% ethanol, 5 min chacun. Laissez la section sec pendant au moins 10 min.
   Remarque: Dans certains cas, le traitement à l'éthanol peut être néfaste pour la détection des autres cibles. Un autre protocole utilisant une étape de pré-hybridation dans 50% de formamide - 2x SSC peut être utilisé (voir ci-dessous dans le protocole 9 pour plus de détails sur triple coloration). Cependant, le traitement de l'éthanol est l'approche la plus souple pour l'ARN-FISH et fournit l'arrière-plan le plus bas.
5. Préparer la solution de sondage comme suit: préparer à l'avance un 10 ml actions d'une solution d'hybridation d'ARN contenant 4x 8x SSC, 20x solution de Denhardt, 4 mM EDTA, 40% de dextran *. Aliquoter la solution que 500 pi dans des microtubes, et conserver à -20 ° C. Pour une diapositive préparer 80 pi de solution (lamelle de 22 mm x 50 mm), en mélangeant 20 ng de ribosonde LAT biotinylé, 40 ng d'ARNt de levure, 2 mM RVC et complet à 20 pi avec de l'eau. Ajouter 20 pi de 4x solution d'hybridation d'ARN, et 40 plde formamide (50% concentration finale). Pour faciliter le pipetage et de mélange, il est recommandé de préchauffer la solution d'hybridation de l'ARN 4x à 75 ° C. Mélangez bien par aspiration et à plusieurs reprises.
   * Remarque: Pour préparer la solution d'hybridation ARN 4x, mélanger 4 g de sulfate de dextran (MW 500.000) dans 3 ml d'eau distillée et 4 ml de 20x SSC. Elle fait un mélange visqueux qui se dissout lors de 3-4 heures à 70 ° C. Mélanger régulièrement pour aider à dissoudre. Ajouter 2 ml de solution de Denhardt 100x, et 80 ul d'une solution 0,5 M d'EDTA. Compléter à 10 ml avec de l'eau et bien mélanger à l'aide d'un vortex. Attention: utiliser uniquement RNase / DNase produits gratuits.
6. Dénaturer la sonde 10 min à 75 ° C. Pendant ce temps, placer les lames sur un incubateur de diaporama à 65 ° C. Baisse de 80 pi de solution de sonde sur les sections et rapidement placer une lamelle sur la goutte. Attention: il devrait y avoir aucune bulle. Présence de bulles diminue hybridation efficacité. L'incubation doit avoir lieu dans une chambre humide depuis la lamelle n'est pas étanche. Utilisez un incubateur de diapositives qui peuvent contenir de l'eau (voir le tableau des matériaux), ou préparer une chambre humidifiée dans une boîte scellée et le placer dans un 65 ° C four à hybridation.
7. Incuber pendant une nuit à 65 ° C. Remarque: LAT ARN-FISH est réalisée à 65 ° C pour éviter la liaison non spécifique de la sonde, qui est observée à 37 ° C. Beaucoup d'autres sondes ARN FISH devraient aboutir à bon signal à 37 ° C.
8. Le jour 2, avant de commencer à laver, préparer les réactifs de détection selon les instructions du fabricant du kit de détection TSA. La détection est effectuée avec un kit de détection TSA commercial comprenant une peroxydase de raifort (HRP) couplée streptavidine et un substrat à fluorescence verte ou bleue.
9. Gardez les lames sur le chauffe-lame à 65 ° C. Retirez délicatement la lamelle et rapidement ajouter 1 ml de formamide à 50% en 2x SSC, préchauffé unt 65 ° C. Attention, ne laissez pas la partie sèche. Laver deux fois 10 min à 65 ° C dans 50% de formamide dans du SSC 2x et 2x 10 min en 2x SSC à 65 ° C. Laver une fois avec 2x SSC et placer la lame sur une lame de chauffage à 37 ° C.
10. Procéder à l'étape de détection selon l'instruction kit de détection TSA du fabricant. La concentration de la HRP-streptavidine, la concentration de substrat fluorescent et le temps de réaction doit être déterminée empiriquement *. Pour la détection de l'ARN LAT, nous avons utilisé en routine à la condition suivante: HRP-streptavidine diluée à 1/500, le réactif fluorescent à 1/100 de la fluorescence bleue et 1/500 de la fluorescence verte, et le temps de réaction de 10 min. Le signal peut être rapidement vérifié avec un microscope à fluorescence inversé sans montage, avant de procéder à l'ADN-FISH.
    * Remarque: Le protocole d'amplification sera la conception en fonction des principaux objectifs de l'expérience. Par exemple, pour localiser finement l'ARN cible, il est adVised d'utiliser peu de temps de réaction. En revanche, pour identifier et compter les cellules positives à faible grossissement rapidement, le temps de réaction peut être augmentée pour produire un signal lumineux.
11. Pour l'ADN-FISH, suivez la procédure indiquée ci-dessus, à partir de l'étape de démasquage (étape 6.2).

8. Immuno-ADN FISH

Voir la figure 1, les cases violettes pour un aperçu.

De même pour l'ARN-ADN-FISH, il est conseillé d'effectuer d'abord le immunofluorescence, car l'ADN-FISH est susceptible de dénaturer les protéines et éviter leur détection par des anticorps. La qualité du signal d'immunofluorescence est très dépendante des caractéristiques de l'anticorps, et plusieurs anticorps doit être testée lorsque cela est possible. Épitope démasquage est effectué une fois avant l'immunofluorescence pour améliorer à la fois la détection des protéines et de l'ADN-FISH. Pour conserver le signal d'immunofluorescence sur l'échantillon au cours de la procédure de l'ADN-FISH il est nécessaire de covalently lier au tissu. Nous présentons ici deux approches qui ont fourni de bons résultats dans nos mains, la détection basée post-fixation et tyramide anticorps (voir l'étape 8.5). Le choix devrait être guidé par des essais préliminaires pour chaque paire cible / anticorps.

1. Préparer les solutions suivantes avant de commencer:
   
   1x PBS contenant 3% de sérum de chèvre normal (NGS).
   PFA 2% en 1x PBS (dilution de la solution mère de 4%)
   
2. Au jour 1, les premières étapes sont identiques à l'ADN-FISH, à l'étape de démasquage (étapes 6.1 à 6.2).
3. Après démasquer, incuber les sections avec 1x PBS contenant 3% NGS pendant 1 heure.
4. Incuber avec l'anticorps primaire dilué dans 1 x PBS contenant 3% de NGS à 24 h. Temps d'incubation plus faible peut être utilisé pour raccourcir le protocole, mais nous avons constaté qu'une incubation pendant une nuit se traduit généralement par un signal plus fort. Jusqu'à 48-72 heures d'incubation peut être nécessaire pour les anticorps primaires faible affinité tels que IgM.
5. Au jour2, se laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
6. Protocole d'anticorps post-fixation: incuber 1 heure avec l'anticorps secondaire couplé à un colorant fluorescent vert, à 1/200 en 1x PBS contenant 3% de NGS. Laver trois fois 10 min avec du PBS 1X. Post-fixation est réalisée avec 2% de PFA en 1x PBS pendant 10 min *. Laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
   Protocole de détection TSA: incuber 1 h avec l'anticorps secondaire couplé à la HRP au 1/250 dans 1 x PBS contenant 3% de NGS. Laver trois fois 10 min avec du PBS 1X. Procéder à la détection de tyramide selon les instructions du fabricant. Comme indiqué ci-dessus (étape 7.9), le réactif de dilution et le temps de réaction doit être déterminée empiriquement. Dans la plupart des cas, notre protocole a été basé sur un 1/500 dilution du substrat fluorescent et un temps de réaction de 10 min. Laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
   * Remarque: post-fixation est une étape critique dans l'immuno-FISH, et nécessite une étude minutieuse set-up. Le plus fort de la post-fixation de lameilleur est le signal SI, et plus le rendement ADN-FISH.
7. Procéder à l'ADN-FISH de l'étape de l'acide acétique-méthanol (étape 6.3). Durée de l'immuno-ADN-FISH est typiquement de 3 jours, avec le premier anticorps incube pendant une nuit.

9. Double FISH ADN-ARN Couplé avec immunofluorescence

Voir la figure 1, les cases orange pour un aperçu.

ARN-FISH est réalisée en premier, suivi par immunofluorescence, et enfin ADN-FISH. Si immunofluorescence est détecté par réaction tyramide, il est essentiel d'éteindre complètement l'activité HRP de l'étape ARN-FISH avec H ₂ O _2, et de vérifier que la trempe est efficace. Ceci est réalisé en utilisant une lame en tant que témoin «sans anticorps primaire".

Parce que la déshydratation à base d'éthanol est délétère pour certaines protéines de solvants sensibles, cette étape de l'ARN-FISH peut inhiber immunofluorescence. Si c'est le cas, l'ARN-FISH peut être effectuée avecvec un autre protocole, comme indiqué ci-dessous dans STPE 9.3.

1. Préparer la solution suivante avant de commencer:
   
   Formamide à 50% dans du PBS 1x contenant 2 mM RVC
   
2. Au jour 1, préparer la sonde ARN-FISH et procédez comme pour double ARN-FISH, à l'H ₂ O ₂ de l'étape de refroidissement (étape 7.2).
3. Cas 1, la coloration par immunofluorescence fonctionne après déshydratation de l'éthanol: procéder à l'ARN-FISH, comme indiqué ci-dessus dans les étapes 7.3 à 7.9. Puis passez à l'étape 9.6 ci-dessous.
4. Cas n ° 2, la coloration par immunofluorescence est empêché par traitement à l'éthanol: Placer les lames dans une chambre humide sur un dispositif de chauffage de glissière fixé à 65 ° C et incuber pendant 1,5 heure dans une solution de pré-hybridation contenant 50% de formamide, 1 x PBS, et 2 mM RVC. Videz la solution de pré-hybridation et déposer 80 ul de solution d'hybridation comme indiqué dans les étapes 7.4 et 7.5. Ensuite, passez à l'ARN-FISH hybridation et de détection Abov indiquée dans les étapes 07.06 à 07.09 (jours 2 et 3).
5. Le jour 2, après ARN-FISH est terminé, procéder à l'immuno-ADN-FISH en commençant par l'étape de démasquage (voir l'étape 6.2). Ensuite, suivez le protocole d'immuno-ADN-FISH, comme indiqué ci-dessus dans les étapes 8.2 à 8.6.

10. Glisser de montage et d'imagerie

1. Préparer la solution suivante avant de commencer:
   
   Hoechst 33342 à 0,5 ug / ml dans du PBS 1x
   
2. noyaux de coloration pendant 10 min avec du DAPI ou Hoechst 33342 * à 0,5 ug / ml dans PBS 1x pour 10 min. Laver 3x 10 min avec du PBS 1X.
   Note *:. Attention Si l'un des systèmes de détection utilise un colorant bleu fluorescent, ne pas utiliser DAPI ou Hoechst. Au lieu de cela, utilisez un colorants fluorescents d'ADN avec un spectre d'émission dans la longueur d'onde rouge lointain comme Topro3.
3. Drainer autant de liquide que possible à partir de la diapositive. Déposer 80 ul de milieu de montage contenant un agent antidécoloration sur une extrémité du coulisseau. Couvrir les sections avec une haute qualité optiquelamelle (n ° 1.5 verre). Laissez la lamelle descendre lentement en le maintenant à une extrémité avec une pince, afin de laisser le milieu propagation de montage sur la section sans bulles.
4. Sceller avec du vernis à ongles et conserver à 4 ° C dans une boîte de glissement sombre.
5. L'observation directe du signal de l'ADN-FISH latentes HSV-1 génomes nécessite un grossissement de l'objectif 40X ou supérieur à immersion d'huile, avec une ouverture numérique élevée (par exemple 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) et une source de lumière d'excitation au moins équivalent à une lampe à mercure de 100 W. Nous conseillons l'aide d'un microscope à transmission à haute efficacité tels que ceux fournis par les fabricants dans les 5 dernières années (voir le tableau de l'équipement). La microscopie confocale fournit des outils pour recueillir des images avec le fond inférieur en raison de l'auto-fluorescence des tissus, tels que le sectionnement mince ou l'imagerie spectrale.

Résultats

Après plusieurs mois de tests, nous avons découvert que le démasquage chimique à base de chaleur latente fait HSV-1 génome disponible pour hybridation fluorescente in situ. Au cours du processus, nous avons essayé différentes procédures démasquer, et les traitements ne chaleur à base (c.-à-chauffer les sections à la température sous-ébullition dans un four à micro-ondes) comparu efficace. Nous avons ensuite testé plusieurs tampons de sel qui sont couramment utilisés en immunohistochimie (IHC) et la mic...

Discussion

Le protocole décrit ici permet la détection de HSV-1 génome latent dans les neurones de coupes de tissus neuronaux de souris. Notre compréhension des voies de régulation de l'expression des gènes viraux a été limitée par l'absence de méthode pour détecter le HSV-1 de l'ADN génomique in situ dans les tissus neuronaux. Informations sur le génome nombre de copies et la proportion de neurones infectés provenaient principalement de l'analyse par PCR sur les neurones dissociés ^11,12. À éluc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris Balb/c	Janvier, France		Femelles de 6 semaines
HSV-1 souche	SC16 (type sauvage)		Voir Labetoule, M. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci 44, 217&ndash ; 225 (2003) pour des détails sur la préparation de la souche HSV-1 et du virus en stock.
Chlorhydrate de kétamine	Sigma	K2753	Injection intrapéritonéale d’une solution contenant de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg)
Chlorhydrate de xylazine	Sigma	X1251
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma	158127	Mettre en suspension 4 g de PFA dans 90 ml d’eau. Ajouter 50 & micro ; l de 1N NaOH, et chaleur à 60 ° ; C dans un bain-marie avec agitation. Le PFA se dissout en 30 minutes environ. Ajouter 10 ml de 10x PBS. Cette solution peut être préparée à l’avance et stockée à -20 ° ; C en tubes de 5 ml. Prudence. Manipulez sous une hotte.
Saline physiologique	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7,4 (stérile)	Life Technologies	10010-015	;
Saccharose	Sigma	84100	Préparez une solution de saccharose à 20 % dans 1x PBS.
Milieu d’enrobage de cryosectionnement - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583	;
Kit de purification d’ADN à grand vecteur	Qiagen	12462	Pour purifier le vecteur Cosmide ou BAC contenant le génome HSV-1 et le stocker à -20 ° ;
C Nick kit de traduction	Roche Applied Sciences	10 976 776 001	;
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protection contre la lumière
0,5 M EDTA	Sigma	E6758	;
G50 Mini colonne de centrifugation	GE Healthcare	27-5330-01	;
ADN de spermatozoïdes de saumon 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011	;
Éthanol biologie moléculaire grade	Sigma	87047	Préparer une solution à 70 %
ADN spermatozoïde	de saumon Invitrogen Life Technologies	15632-011	;
Formamid Biologie moléculaire grade	Sigma	F9037	Attention. Manipulez sous la hotte.
Sonde commerciale biotinylée HSV-1  ;	Enzo Sciences de la vie	ENZ-40838	;
Stylo hydrophobe ImmEdge	Vector Laboratories	H-4000	;
20x citrate de sodium salin (SSC)	Sigma	S6639	Préparez une solution 2x SSC dans ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Préparez une solution mère à 10 % dans l’eau et stockez-la à +4 ° ;C. Préparez la solution à 0,5 % dans 1x PBS juste avant utilisation.
10 mM Citrate de sodium pH 6.0	Sigma	S1804	Préparer une solution mère de 100 mM (10x). Peser 10,5 g d’acide citrique (MW 210.14). Attention, irritant et toxique, porter un masque et des gants appropriés) et dissoudre dans 400 ml d’eau. Ajustez le pH à 6,0 avec 1 N de NaOH (prudence, irritant, portez des gants). Ajuster à 500 ml avec de l’eau distillée. Diluer 10x dans de l’eau distillée avant utilisation.
Acide acétique	Sigma	320099	;
Méthanol, biologie moléculaire grade	Sigma	322415	;
Sulfate de dextran - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A	;
La solution de Denhardt (100x)	Euromedex	1020-A	;
Ciment Caoutchouc « FixoGum"	Marabut	290110000	;
Kit de purification de l’ADN - Kit de purification PCR Qiaquick	Qiagen	28104
T7 in vitro kit de transcription	Ambion Life Technologies	AM1314	;
Biotine-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910	;
Minicolonne de purification d’ARN	Qiagen	73404	;
Ribonucléoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S	;
H2O2	Sigma	H3410	Préparez une solution à 3 % dans de l’eau distillée. Magasin à +4 ° ; C et protéger de la lumière.
Levure ARNt	Invitrogen	15401011	préparer une solution à 10 mg/ml dans de l’eau exempte d’ARNase
Sérum de chèvre normal	Invitrogen	PCN5000	;
Les			anticorps primaires suivants ont été utilisés dans la section des résultats : anti-souris CENP-A (mAb de lapin C51A7, Cell Signaling Technologies) et anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Anticorps fluorescents secondaires	Invitrogen Life Technologies		Les anticorps secondaires fluorescents couramment utilisés dans notre protocole sont des anticorps de chèvre marqués au fluor Alexa (IgG H+L). L’anticorps utilisé dans la section des résultats est un anticorps anti-lapin de chèvre labé avec Alexa Fluor 488 (référence A11001)
Kit d’amplification du signal Tyramide (TSA) - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (fluorescence bleue)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	Les kits TSA sont également disponibles chez Perkin Elmer
Kit d’amplification du signal tyramide (TSA) - Streptavidine + Alexa Fluor 488 (fluorescence verte)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Préparer un 0.5 & micro ; g/ml dans 1x PBS immédiatement avant l’utilisation. Jetez la solution restante.
lamelle de recouvrement de 22 mm x 50 mm. n° ; 1.5	Microscopie électronique à	Sciences 72204-04	;
Support de montage avec agent anti-décoloration - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Un autre produit conventionnel est le Fluoromount G de Electron Microscopy Science
Superfrost	FisherScientific	12-550-15	;
Équipement/Matériel	Note	de référence	de l’entreprise
Aiguille pour infection			Micropipette en verre étirée à chaud. Sur mesure.
Matériel de dissection	Moria, France		Ciseaux et pinces microchirurgicaux
Pompe péristaltique	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Dispositif de pompe à microseringue (Nano Pump)	kdScientific	KDS310	;
Cryostat	Leica France	CM 1510-1	;
-80 ° ; C congélateur	Sanyo		Ultra Low -80 ° ; C
Four à micro-ondes
Chauffe-moteur à sec	Eppendorf	022670204	;
Incubateur Toboggan	Toboggan Boekel Scientific	240000	;
Pot Coplin	Dominique Dutscher	68512	;
Récipient pour vitrail	Dominique Dutscher	68506	;
Les			images présentées dans la section des résultats ont été collectées avec un Zeiss AxioObserver avec objectif 40X LD NeoFluor N.A 0.6, et 100X PlanApochromat N.A 1.3. Ensemble de filtres #38, #43 et #43. Source lumineuse à fluorescence HXP 120. Photométrie CoolSNAP HQ2 Caméra CCD. Le signal sera plus facilement observé sur un microscope récent à haut rendement tel que les séries Zeiss AxioImager/AxioObserver, les séries Nikon Ti-E/Ni-E ou les séries Leica DM/DMI6000