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Research Article
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Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.
Cellule à l'unité co-détection d'un gène, le produit de l'ARN et des protéines régulatrices cellulaires est critique pour étudier la régulation de l'expression génique. Il s'agit d'un défi dans le domaine de la virologie, en particulier pour les virus à ADN persistants nucléaires répliquant qui impliquent des modèles animaux pour leur étude. Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) établit une infection latente permanente dans les neurones périphériques. Virus latent sert de réservoir, d'où il réactive et induit un nouvel épisode herpétique. La biologie de la cellule de HSV-1 de latence reste mal compris, en partie en raison de l'absence de méthodes pour détecter les génomes de HSV-1 in situ dans des modèles animaux. Nous décrivons un ADN hybridation fluorescente in situ (FISH) dans l'approche détecter efficacement faible nombre de copies de génomes viraux dans des coupes de tissus neuronaux de modèles animaux infectés. La méthode repose sur démasquage antigénique à base de chaleur, et des sondes d'ADN directement marqués maison, ou des sondes disponibles dans le commerce. Nous avons développé un stai tripleapproche ning, combinant l'ADN à l'ARN FISH-FISH et immunofluorescence, en utilisant la peroxydase en fonction d'amplification du signal pour accueillir chaque exigence de coloration. Une amélioration majeure est la possibilité d'obtenir, dans les 10 sections um de tissu, les signaux basse fond qui peuvent être imagés à haute résolution par microscopie confocale et à grand champ épifluorescence classique. De plus, la coloration triple a travaillé avec une vaste gamme d'anticorps dirigés contre les protéines cellulaires et virales. Le protocole complet 2,5 jours pour accueillir anticorps et la pénétration de la sonde dans le tissu.
Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l'établissement d'une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l'hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte 1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l'expression des gènes est limitée à la transcription associé à la latence (LAT) locus, à partir de l'établissement de la latence initiation de réactivation 3. LAT produit une longue 8,5 kb non codantes de l'ARN transformé en un 2 ko lasso majeur stable, et plusieurs miARN 4-7. HSV-1 de latence se caractérise donc par la présence de l'ADN viral génomique, ARN LAT, et l'absence de protéines du cycle de replication détectables.
ontenu "> modèles animaux, principalement la souris et le lapin, sont des modèles expérimentaux récapitulant quelques éléments sur la latence chez l'homme. L'un des principaux intérêts de ces modèles est qu'ils permettent d'étudier les aspects physiologiques de HSV-1 de latence dans les sujets immunocompétents. cours des dernières décennies , de nombreux outils expérimentaux, tels que des virus et des souris génétiquement modifiées, ont été développées pour étudier la physiologie, de la génétique et de la biologie cellulaire de HSV-1 de latence, à partir de tissus animaux. Jusqu'à présent, l'ADN génomique viral a été détecté et quantifié par transfert de Southern et qPCR de dissocier les TG. Toutefois, il n'existe actuellement aucune méthode pour détecter le HSV-1 génomique par hybridation in situ sur des coupes de tissu 8. En conséquence, la latence est couramment évaluée sur des coupes histologiques par la détection de l'ARN LAT par hybridation d'ARN in situ, plutôt que la détection du génome viral. Comme il a été impossible de caractériser les cellules infectées en fonction de la présence de génomes viraux, this limitation technique a été un inconvénient majeur pour l'analyse de nombreux aspects des interactions hôte-virus, tels que la relation entre le génome viral et l'expression cellulaire et virale ou gène de l'hôte à médiation cellulaire réponse immunitaire 9,10.Plus important encore, l'hétérogénéité de l'infection latente de cellule à cellule reste relativement inexploré et a été montré pour être un élément clé de la latence chez la souris et dans les neurones ganglionnaires sensorielles humaines implantées dans des souris SCID 11-17. En règle générale, il a été montré par qPCR que le génome de HSV-1 du nombre de copies par cellule varie de 5 à plusieurs centaines. Bien que LAT apparaît comme un régulateur clé de la latence et la réactivation, les données qPCR sur les neurones isolés et en PCR in situ ont indiqué que seul un sous-ensemble de neurones infectés de manière latente, aussi bas que 30%, exprime le locus LAT 11,12,18-21. Comment la cellule hôte et l'environnement cellulaire à l'intérieur de l'impact de la mise en place sur le tissu de la latence du virus etexpression des gènes viraux reste incertaine. Nous décrivons ici un solide hybridation fluorescente in situ (FISH) de la méthode pour la détection efficace de la copie de faible HSV-1 de l'ADN génomique à l'intérieur des sections de tissus neuronaux animales dans. Cette méthode a été conçue et utilisée par nous pour obtenir l'accès à haut microscopie imagerie de résolution qui est nécessaire pour étudier l'interaction du génome viral avec les cellules de l'hôte composants intra-nucléaires 22. En outre, nous décrivons un procédé de coloration multiple pour la détection simultanée de l'ADN viral à ARN et des protéines, qui est un outil unique pour décrire les interactions virus-hôte qui régulent l'expression des gènes viraux. La méthode peut également être appliquée à un large éventail d'analyses nécessitant la détection de HSV-1 génome latent, comme la quantification des neurones infectés dans grand nombre de sections. Une étape clé est d'appliquer un traitement de récupération de l'antigène de faire l'ADN viral accessible à l'hybridation. Ainsi, ce protocole pourrait également être efficace pour la détectiond'autres virus ADN double brin, qui ne sont actuellement pas détectable par des approches ADN-FISH conventionnels dans les tissus animaux.
Cette méthode a été utilisée dans une étude publiée précédemment 22. Pour le fond général et la description de la manipulation classique sur ISH, IF et FISH, nous suggérons la littérature disponible après 23.
Une. Infection des animaux
Toutes les procédures impliquant des animaux expérimentaux conformes aux questions d'éthique de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) Déclaration de l'utilisation des animaux en recherche, et ont été approuvés par le comité d'éthique local UPR-3296-CNRS, en conformité avec la Communauté européenne Directive 86/609/CEE du Conseil. Tous les animaux ont reçu un accès illimité à la nourriture et de l'eau.
Le procédé de l'infection de la souris par le HSV-1 décrit ci-dessous a été utilisée dans des études précédemment publiées 24-26.
2. Souris Perfusion-fix
3. TG récolte
4. Cryosection Préparation
5. HSV-1 Sonde étiquetage
Le protocole décrit ci-après pour la détection de HSV-1 par de l'ADN génomique de poisson a été utilisé avec succès deux types de sondes. La première est une marqué au Cy3 sonde fluorescente fait maison qui est approprié pour l'analyse fine de l'organisation nucléaire dans des cellules individuelles, par microscopie fluorescente haut de grossissement. La seconde est une sonde biotinylé disponible dans le commerce, qui peuvent être combinerd à la peroxydase avec une amplification du signal pour fournir un signal lumineux. Celui-ci est approprié pour l'identification et la quantification des virus contenant des neurones à faible grossissement dans l'article entier, et pour l'analyse des modèles de génome de HSV-1. Les utilisateurs finals devraient évaluer quelle approche convient le mieux à l'objectif de leur étude. La sonde disponible dans le commerce est listé dans la section de réactif, et la préparation de la sonde de home-made est décrite ci-dessous.
6. ADN-FISH
La figure 1 montre une vue d'ensemble des principales étapes du protocole ADN-FISH, et comment effectuer ADN-FISH dans le cadre d'une expérience de coloration multiple à codetect ARN et de protéines, comme décrit dans les protocoles 7-9.
7. Double FISH ARN-ADN
Voir la figure 1, les cases vertes pour un aperçu.
Pour multiplecoloration procédures, y compris une étape ARN-FISH, il est généralement conseillé d'effectuer la première détection de l'ARN en tant que telle cible est sensible à la dégradation par la RNAse et de produits chimiques. De plus, la procédure de l'ADN-FISH comprend des traitements qui réduisent l'efficacité de coloration autre. Pour ARN-FISH, nous avons choisi une approche de détection enzymatique basé (tyramide amplification du signal (TSA) en utilisant des sondes biotinylés et la peroxydase (HRP) streptavidine couplée). TSA est basé sur un substrat de tyramide fluorescent (voir le tableau de réactif pour plus de détails), qui est lié de manière covalente au tissu par une réaction enzymatique de la peroxydase. Le signal ARN-FISH est ainsi préservée pendant ADN-FISH.
8. Immuno-ADN FISH
Voir la figure 1, les cases violettes pour un aperçu.
De même pour l'ARN-ADN-FISH, il est conseillé d'effectuer d'abord le immunofluorescence, car l'ADN-FISH est susceptible de dénaturer les protéines et éviter leur détection par des anticorps. La qualité du signal d'immunofluorescence est très dépendante des caractéristiques de l'anticorps, et plusieurs anticorps doit être testée lorsque cela est possible. Épitope démasquage est effectué une fois avant l'immunofluorescence pour améliorer à la fois la détection des protéines et de l'ADN-FISH. Pour conserver le signal d'immunofluorescence sur l'échantillon au cours de la procédure de l'ADN-FISH il est nécessaire de covalently lier au tissu. Nous présentons ici deux approches qui ont fourni de bons résultats dans nos mains, la détection basée post-fixation et tyramide anticorps (voir l'étape 8.5). Le choix devrait être guidé par des essais préliminaires pour chaque paire cible / anticorps.
9. Double FISH ADN-ARN Couplé avec immunofluorescence
Voir la figure 1, les cases orange pour un aperçu.
ARN-FISH est réalisée en premier, suivi par immunofluorescence, et enfin ADN-FISH. Si immunofluorescence est détecté par réaction tyramide, il est essentiel d'éteindre complètement l'activité HRP de l'étape ARN-FISH avec H 2 O 2, et de vérifier que la trempe est efficace. Ceci est réalisé en utilisant une lame en tant que témoin «sans anticorps primaire".
Parce que la déshydratation à base d'éthanol est délétère pour certaines protéines de solvants sensibles, cette étape de l'ARN-FISH peut inhiber immunofluorescence. Si c'est le cas, l'ARN-FISH peut être effectuée avecvec un autre protocole, comme indiqué ci-dessous dans STPE 9.3.
10. Glisser de montage et d'imagerie
Après plusieurs mois de tests, nous avons découvert que le démasquage chimique à base de chaleur latente fait HSV-1 génome disponible pour hybridation fluorescente in situ. Au cours du processus, nous avons essayé différentes procédures démasquer, et les traitements ne chaleur à base (c.-à-chauffer les sections à la température sous-ébullition dans un four à micro-ondes) comparu efficace. Nous avons ensuite testé plusieurs tampons de sel qui sont couramment utilisés en immunohistochimie (IHC) et la microscopie électronique à récupérer épitopes 31,32, y compris 0,01 M pH tampon 6.0 Citrate (que nous avons utilisé dans toutes nos études), 1x PBS, EDTA 1 mM, 0,1 M Tris-HCl pH 7,4 et de l'eau distillée. Alors que les tampons EDTA ont tendance à endommager les tissus, tous les autres tampons étaient de nature à HSV-1 détection, qui apparaît comme des taches simples ou multiples dans le noyau des neurones (Figure 2A, notez que ces tissus sont très auto-fluorescent, qui apparaît dans certains images en un signal homogène à l'cytopLASM). Dans nos mains, tampon citrate semble toujours fournir un bon signal sans endommager les tissus et ainsi a été choisi pour notre protocole routine.
L'utilisation de sondes d'ADN-Cy3 directement marqués (fabriqués à partir de parties du génome de HSV-1 clone dans cosmides) fournit des résultats fiables et reproductibles. Toutefois, il exige d'avoir accès à HSV-1 bibliothèques génomiques. Nous avons donc vérifié que notre protocole serait travailler pour n'importe qui ayant accès uniquement aux sondes commerciales. Figure 2B montre HSV-1 latent détection du génome par l'ADN-FISH utilisant un pan-HSV-1 sonde biotinylé obtenu à partir d'Enzo Biochem. Dans cette optique, nous avons testé si le protocole de l'ADN-FISH pourrait être utilisée par les chercheurs en utilisant d'autres HSV-1 des modèles animaux. Figure 3A illustre la détection de HSV-1 génome sur des échantillons provenant de souris et de lapin, infectés avec trois souches couramment utilisées, SC16, 17syn + et McKrae, au stade aiguë ou latente de l'infection, dans les sections de g trijumeauAnglia. Dans tous les cas HSV-1 génomes montrent comme un signal tacheté, de la luminosité et l'intensité qui varie de cellule à cellule. Enfin, nous avons étendu l'applicabilité de notre protocole pour le cycle réplicatif du virus HSV-1, en effectuant ADN-FISH sur des tissus provenant de souris subissant une infection générale de l'herpès. Chez ces animaux, les agrégats et les grosses lumineuses de génomes de HSV-1 ont pu être détectés dans divers tissus y compris le cerveau, la moelle épinière, les yeux et les ganglions de la racine dorsale (Figure 3B).
De nombreux aspects de HSV-1 de latence sont encore mal connus, tels que la façon dont le HSV-1 expression des gènes est régulée grâce à ses interactions avec l'architecture nucléaire 33-35, si un sous-ensemble spécifique de neurones sont préférés de la cellule hôte pour l'établissement de latence et la réactivation 13 , 14,36,37, ou comment la surveillance immunitaire a lieu dans les ganglions de la fonction de la charge de virus ou de l'expression du gène de virus 9,10. Le protocole décrit ici permettra de s'attaquer à ces questions, parco-détection de HSV-1 et le génome d'ARN et de protéines virales ou cellulaires. figure 4 illustre la co-détection de HSV-1, en même temps que le génome de HSV-1 LAT ARN (figures 4A et 4C), avec des protéines cellulaires tels que la protéine centromérique CENP-A (figure 4B, si elle est suivie d'une post-fixation PFA), ou la chromatine et protéine associée PML-NB ATRX (figure 4C, si elle est suivie par une détection basée TSA). figure 4C illustre données d'une expérience de coloration triple montrant HSV-1 DNA ( rouge), sa table des adresses locales de produit d'ARN (en bleu) et une protéine de régulation de candidat, ATRX (vert). La combinaison de notre protocole ADN-FISH et la détection directe ou enzymatique à base d'ARN-FISH et le signal d'immunofluorescence, représentent un ensemble polyvalent et largement applicable des outils pour explorer in situ la relation virus-hôte, au niveau cellulaire et tissulaire.
Figure 1. Présentation du protocole ADN-FISH et l'intégration dans la coloration de cibles multiples. Les principales étapes du protocole ADN-FISH et la connexion avec les protocoles de co-détection d'ARN et de protéines sont représentés schématiquement. Les étapes critiques sont indiqués par des panneaux d'avertissement. Principales étapes ADN-FISH sont réhydratation, perméabilisation, traitement de démasquage de l'acide acétique et méthanol-hybridation. Dans la procédure, démasquage est une étape cruciale, qui doit être soigneusement mis en place et respecté. Les deux autres étapes critiques dépendent des procédures techniques sont compatibles avec les anticorps utilisés pour l'immunodétection. Ces auront un impact sur la procédure ARN-FISH pour la coloration triple, et sur la stratégie de détection des immunofluorescence. Clécher ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Détection de HSV-1 génome latent après démasquage antigénique. Sections A. TG de 28 souris infectées dpi ont été préparés comme indiqué dans la section de protocole. TG sections ont été traitées pour l'ADN-FISH, comme indiqué à la figure 1, et le démasquage basé chaleur était effectuer en utilisant le tampon indiqué sur le dessus de chaque image. Le contour du noyau est représentée comme une ligne en pointillés. Le signal observé dans le cytoplasme est due à l'auto-fluorescence des tissus. Sections B. TG préparées comme dans A. ont été traitées pour l'ADN-FISH utilisant un biotinylé HSV-1 sonde obtenu dans le commerce. La sonde hybridée a été détectée à l'aide d'un TSA et SUBSTRA marqué Alexa Fluorte (vert). Noyaux ont été contre avec Hoechst 33352 (bleu). Une image recadrée élargie est affichée dans la colonne de droite. Deux types de HSV-1 sont présentés génome schéma pour illustrer une caractéristique de HSV-1 localisation intranucléaire. Toutes les images ont été recueillies sur un microscope à épifluorescence grand champ. La barre d'échelle est de 5 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. La détection de HSV-1 dans le génome de plusieurs modèles. A. Le protocole ADN-FISH norme a été appliquée à des sections TG d'origines diverses. SC16 souris infectées sections TG ont été préparés comme décrit dans la section de protocole. + Sections de souris infectées 17syn et sections de lapin infectées McKrae ont été fournis par colrateurs. Les images ont été recueillies sur un microscope à épifluorescence grand champ. La barre d'échelle est de 5 um. souris infectées B. SC16 subissant une infection générale de l'herpès ont été sacrifiés à 6 dpi et plusieurs tissus ont été prélevés, congelés et sectionnés. Le protocole de l'ADN-FISH norme a été appliquée, comme indiqué à la figure 1. Les images ont été recueillies sur un microscope à épifluorescence grand champ. La barre d'échelle est de 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Codétection de HSV-1 ADN et ARN et des protéines sur des sections simples génomique. SC16 sections infectés de souris TG ont été traitées pour FISH ARN-ADN, ADN immuno-FISH ou le triple staining comme indiqué à la figure 1. A. ARN-ADN FISH utilisant un génome de HSV-1 Cy3 sonde marquée (rouge) et un biotinylé ribo-sonde d'ARN-LAT (vert). Sonde d'ARN LAT a été détectée en utilisant TSA et un substrat marqué Alexa Fluor 488. Noyaux ont été contre avec Hoechst 33352 (bleu) B. Immuno-ADN FISH utilisant un anticorps anti-CENP-A anticorps (vert) et un génome de HSV-1 Cy3 sonde marquée (rouge). Les anticorps étaient 10min post-fixe avec 1% de PFA dans du PBS avant d'exécuter l'ADN-FISH. Noyaux ont été contre avec Hoechst 33352 (bleu). C. Immuno-ARN-ADN-FISH en utilisant un ARN-LAT biotinylé ribo-sonde (bleu), un anticorps anti-ATRX (vert) et un génome de HSV-1 Cy3 sonde marquée ( rouge). La sonde d'ARN LAT a été détectée en utilisant la détection de tyramide et un substrat marqué par fluorescence bleue, et l'anti-ATRX et des anticorps secondaires ont été détectés par la détection de tyramide et un substrat marqué par fluorescence verte. Toutes les images ont été recueillies sur un grand champ épifluorescence microscope. La barre d'échelle est de 5 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.
Nous remercions N. Sawtell (Hospital Medical Center de Cincinnati Children, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (Université de Cambridge, Royaume-Uni) et James Hill (LSU Health Sciences Center, La Nouvelle-Orléans, États-Unis) pour fournir des échantillons de HSV-1 les souris et les lapins infectés, respectivement, et des réactifs; H. Masumoto (Kazusa Institut de recherche de l'ADN, Chiba, Japon) et S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, France) pour des discussions utiles.
Ce travail a été financé par des subventions du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (programme ATIP, PL, http://www.cnrs.fr), l'Agence nationale française de recherche (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), la Fondation FINOVI ( http://www.finovi.org/:fr:start ), le Labex DEVweCAN (ANR-10-61-labx ) de l'Université de Lyon, dans le programme "Investissements d'Avenir »(ANR-11-IDEX-0007) exploité par l'ANR ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), l'Association pour la Recherche contre le cancer (ARC-7979 et ARC- 4910, http://www.arc-cancer.net ), la Ligue Nationale Contre le Cancer le (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), et l'INCa (programme EpiPro, http://www.e -cancer.fr ). FC et PL sont des chercheurs du CNRS.
| Souris Balb/c | Janvier, France | Femelles de 6 semaines | |
| HSV-1 souche | SC16 (type sauvage) | Voir Labetoule, M. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci 44, 217&ndash ; 225 (2003) pour des détails sur la préparation de la souche HSV-1 et du virus en stock. | |
| Chlorhydrate de kétamine | Sigma | K2753 | Injection intrapéritonéale d’une solution contenant de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) |
| Chlorhydrate de xylazine | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Sigma | 158127 | Mettre en suspension 4 g de PFA dans 90 ml d’eau. Ajouter 50 & micro ; l de 1N NaOH, et chaleur à 60 ° ; C dans un bain-marie avec agitation. Le PFA se dissout en 30 minutes environ. Ajouter 10 ml de 10x PBS. Cette solution peut être préparée à l’avance et stockée à -20 ° ; C en tubes de 5 ml. Prudence. Manipulez sous une hotte. |
| Saline physiologique | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7,4 (stérile) | Life Technologies | 10010-015 | ; |
| Saccharose | Sigma | 84100 | Préparez une solution de saccharose à 20 % dans 1x PBS. |
| Milieu d’enrobage de cryosectionnement - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | ; |
| Kit de purification d’ADN à grand vecteur | Qiagen | 12462 | Pour purifier le vecteur Cosmide ou BAC contenant le génome HSV-1 et le stocker à -20 ° ; |
| C Nick kit de traduction | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | ; |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protection contre la lumière |
| 0,5 M EDTA | Sigma | E6758 | ; |
| G50 Mini colonne de centrifugation | GE Healthcare | 27-5330-01 | ; |
| ADN de spermatozoïdes de saumon 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | ; |
| Éthanol biologie moléculaire grade | Sigma | 87047 | Préparer une solution à 70 % |
| ADN spermatozoïde | de saumon Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | ; |
| Formamid Biologie moléculaire grade | Sigma | F9037 | Attention. Manipulez sous la hotte. |
| Sonde commerciale biotinylée HSV-1 ; | Enzo Sciences de la vie | ENZ-40838 | ; |
| Stylo hydrophobe ImmEdge | Vector Laboratories | H-4000 | ; |
| 20x citrate de sodium salin (SSC) | Sigma | S6639 | Préparez une solution 2x SSC dans ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Préparez une solution mère à 10 % dans l’eau et stockez-la à +4 ° ;C. Préparez la solution à 0,5 % dans 1x PBS juste avant utilisation. |
| 10 mM Citrate de sodium pH 6.0 | Sigma | S1804 | Préparer une solution mère de 100 mM (10x). Peser 10,5 g d’acide citrique (MW 210.14). Attention, irritant et toxique, porter un masque et des gants appropriés) et dissoudre dans 400 ml d’eau. Ajustez le pH à 6,0 avec 1 N de NaOH (prudence, irritant, portez des gants). Ajuster à 500 ml avec de l’eau distillée. Diluer 10x dans de l’eau distillée avant utilisation. |
| Acide acétique | Sigma | 320099 | ; |
| Méthanol, biologie moléculaire grade | Sigma | 322415 | ; |
| Sulfate de dextran - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | ; |
| La solution de Denhardt (100x) | Euromedex | 1020-A | ; |
| Ciment Caoutchouc « FixoGum" | Marabut | 290110000 | ; |
| Kit de purification de l’ADN - Kit de purification PCR Qiaquick | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro kit de transcription | Ambion Life Technologies | AM1314 | ; |
| Biotine-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | ; |
| Minicolonne de purification d’ARN | Qiagen | 73404 | ; |
| Ribonucléoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | ; |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Préparez une solution à 3 % dans de l’eau distillée. Magasin à +4 ° ; C et protéger de la lumière. |
| Levure ARNt | Invitrogen | 15401011 | préparer une solution à 10 mg/ml dans de l’eau exempte d’ARNase |
| Sérum de chèvre normal | Invitrogen | PCN5000 | ; |
| Les | anticorps primaires suivants ont été utilisés dans la section des résultats : anti-souris CENP-A (mAb de lapin C51A7, Cell Signaling Technologies) et anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | ||
| Anticorps fluorescents secondaires | Invitrogen Life Technologies | Les anticorps secondaires fluorescents couramment utilisés dans notre protocole sont des anticorps de chèvre marqués au fluor Alexa (IgG H+L). L’anticorps utilisé dans la section des résultats est un anticorps anti-lapin de chèvre labé avec Alexa Fluor 488 (référence A11001) | |
| Kit d’amplification du signal Tyramide (TSA) - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (fluorescence bleue) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | Les kits TSA sont également disponibles chez Perkin Elmer |
| Kit d’amplification du signal tyramide (TSA) - Streptavidine + Alexa Fluor 488 (fluorescence verte) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Préparer un 0.5 & micro ; g/ml dans 1x PBS immédiatement avant l’utilisation. Jetez la solution restante. |
| lamelle de recouvrement de 22 mm x 50 mm. n° ; 1.5 | Microscopie électronique à | verreSciences 72204-04 | ; |
| Support de montage avec agent anti-décoloration - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Un autre produit conventionnel est le Fluoromount G de Electron Microscopy Science |
| Superfrost | lames de verreFisherScientific | 12-550-15 | ; |
| Équipement/Matériel | Note | de référence | de l’entreprise |
| Aiguille pour infection | Micropipette en verre étirée à chaud. Sur mesure. | ||
| Matériel de dissection | Moria, France | Ciseaux et pinces microchirurgicaux | |
| Pompe péristaltique | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Dispositif de pompe à microseringue (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | ; |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | ; |
| -80 ° ; C congélateur | Sanyo | Ultra Low -80 ° ; C | |
| Four à micro-ondes | domestique | ||
| Chauffe-moteur à sec | Eppendorf | 022670204 | ; |
| Incubateur Toboggan | Toboggan Boekel Scientific | 240000 | ; |
| Pot Coplin | Dominique Dutscher | 68512 | ; |
| Récipient pour vitrail | Dominique Dutscher | 68506 | ; |
| Les | images présentées dans la section des résultats ont été collectées avec un Zeiss AxioObserver avec objectif 40X LD NeoFluor N.A 0.6, et 100X PlanApochromat N.A 1.3. Ensemble de filtres #38, #43 et #43. Source lumineuse à fluorescence HXP 120. Photométrie CoolSNAP HQ2 Caméra CCD. Le signal sera plus facilement observé sur un microscope récent à haut rendement tel que les séries Zeiss AxioImager/AxioObserver, les séries Nikon Ti-E/Ni-E ou les séries Leica DM/DMI6000 |
