Détection du génome et des transcriptions d'un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L'hybridation combinée avec immunocoloration

L'objectif général de cette procédure est de détecter le génome du virus de l'herpès simplex de type 1 dans des coupes de ganglions trijumeaux provenant de souris infectées de manière latente par hybridation in situ fluorescente. Cela est réalisé en inoculant d'abord le virus dans la lèvre de l'animal, suivi d'une période d'incubation de 28 jours au cours de laquelle le virus s'installe dans les ganglions trijumeaux. Ensuite, les ganglions trijumeaux sont prélevés, inclus et découpés en cryosections.

Les sections sont soumises à plusieurs traitements préparatoires, notamment l'étape clé consistant à les chauffer dans un tampon de citrate de sodium. Enfin, une hybridation in situ fluorescente est réalisée à l'aide de sondes fluorescentes spécifiques de l'herpès. En définitive, les résultats peuvent montrer la localisation du génome viral à l'intérieur du noyau de neurones individuellement infectés grâce à la microscopie confocale.

Dans de nombreux cas, l'étude d'un cycle biologique varié nécessite l'utilisation de modèles animaux. Le principal avantage de la technique présentée ici est qu'elle fournit des données au niveau de la cellule unique en utilisant une approche d'immunofluorescence institutionnelle. Le modèle de l'agent tueur royal des infections à HS reproduit la plupart des aspects de l'histoire naturelle de l'infection par HSV-1 chez l'homme.

C'est l'hôte naturel du virus. L'infection primaire se produit dans les tissus buccaux, puis le virus progresse des lèvres vers le ganglion trijumeau. C'est le principal site de latence du VHS chez l'homme. Association de deux techniques : immunomarquage et coloration.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la latence du virus de l’herpès, telles que la manière dont le virus interagit avec les composants nucléaires, et comment ces interactions influenceraient le maintien de la latence et, éventuellement, la réactivation du virus. Pour commencer, préparez une souris anesthésiée et une solution stock de virus HSV-1, resuspendue dans un milieu sans rouge de phénol.

À l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire, insérez l’aiguille dans la couche sous-épithéliale de la lèvre supérieure gauche au niveau de la frontière muqueuse-cutanée. Injectez 0,5 microlitre de solution virale sur une durée de cinq secondes, puis effectuez une seconde injection de virus au même site. Transférez la souris dans une enceinte thermostatée à 37 degrés Celsius ou sur un tapis chauffant jusqu’à son réveil.

Ensuite, remettez-le dans sa cage d'origine pour le temps de récupération requis avant de le perfuser et de le fixer selon le protocole décrit dans le texte. Incisez de chaque côté de la mâchoire inférieure. Puis, coupez l'extrémité du nez juste derrière les incisives afin de mettre au jour la cavité nasale.

Couper le palais en deux avec des ciseaux, puis le placer sur le côté. Les ganglions trijumeaux se trouvent sous le palais. Ce sont des masses blanches oblongues, mesurant deux à trois millimètres de long, et reliées au nerf trijumeau.

Coupez les branches du nerf trijumeau de chaque côté des ganglions pour les libérer de la moelle allongée. À l’aide de pinces chirurgicales, retirez les ganglions et transférez-les dans une solution de saccharose à 20 % dans du PBS, puis laissez-les incuber pendant 24 heures. Le jour suivant, à température ambiante, incluez les deux ganglions trijumeaux dans un même bloc destiné à la cryodisséction.

Placer le bloc dans un milieu d'inclusion et le congeler à moins 80 degrés Celsius jusqu'à sa sectionnement au cryostat. Couper les ganglions trijumeaux longitudinalement en sections de 10 micromètres et les déposer sur des lames Super Frost préchauffées à 30 degrés Celsius. Quatre à cinq sections peuvent être disposées sur une seule lame.

Attribuer plusieurs étiquettes de série à la lame peut être utile. Si plusieurs applications en aval sont prévues, laissez les tranches sécher de cinq à dix minutes avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour ce protocole, la sonde est préparée en marquant des cosmides contenant des portions de 30 kilobases du génome du VHS-1 avec du SI 3D CTP par traduction NIC.

Il est précipité et mis en suspension dans de l'amide déionisé et doit apparaître rose en raison de l'incorporation de S SI trois le premier jour. Placez les lames sur un porte-lame à température ambiante et laissez sécher les sections pendant 10 minutes. Réhydratez ensuite les sections dans du PBS 1X pendant 10 minutes.

Ensuite, rendre le tissu perméable dans du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS 1X pendant 20 minutes. Puis laver les lames trois fois pendant 10 minutes par lavage avec du SSC 2X et les conserver dans du SSC 2X jusqu'à ce que le tampon de démasquage soit chauffé. Pour le démasquage, préchauffer le tampon citrate au micro-ondes jusqu'à ébullition du tampon.

Cela se fait en remplissant un plateau pour lame en verre avec 200 millilitres de tampon. Placer le plateau dans un récipient plus grand rempli de 500 millilitres d'eau distillée et préchauffer le tampon jusqu'à ébullition. Ensuite, transférer les lames dans le plateau.

Vérifiez qu'ils sont entièrement recouverts de tampon au four à micro-ondes. Chauffez les lames dans le tampon pendant environ 20 secondes, jusqu'à ce que le tampon atteigne l'ébullition. Ne laissez pas le tampon déborder par ébullition.

Ensuite, laissez refroidir les lames à température ambiante pendant deux minutes et répétez le cycle de chauffage six fois supplémentaires. Il est essentiel de déterminer empiriquement le nombre et la durée des cycles de chauffage afin d'assurer la reproductibilité de l'étape de démasquage. Le four à micro-ondes, le plateau, le récipient, le volume de tampon dans le plateau.

Le volume d'eau dans le récipient doit être maintenu identique une fois le chauffage terminé. Transférez les lames dans deux fois SSC pendant cinq minutes sous une hotte, puis incubez les lames dans une solution de méthanol, d'acide acétique et de PBS dans un rapport de trois à un à quatre pendant 15 minutes. Incubez ensuite les lames dans un mélange fraîchement préparé de méthanol et d'acide acétique dans un rapport de trois à un pendant 15 minutes.

Déshydratez maintenant les sections par des incubations successives de 10 minutes dans de l'éthanol à 70 %, suivies de deux incubations de 10 minutes dans de l'éthanol pur. Laissez les lames sécher à température ambiante pendant 10 minutes afin de les préparer pour la sonde. Appliquez 80 microlitres de solution de sondage goutte à goutte sur les sections séchées et recouvrez-les d'un coverslip.

Vérifiez que la solution de sonde recouvre entièrement la surface du coverslip et qu'aucune bulle n'est présente. Scellez ensuite le coverslip avec du ciment caoutchouc et laissez sécher. Procédez à la dénaturation en incubant les lames à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez ensuite rapidement les lames sur un plateau métallique placé sur de la glace pendant cinq minutes. Procédez ensuite à une hybridation pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Retirez le ciment caoutchouc à l’aide de pinces, les lames étant placées sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius.

Retirez délicatement le couvre-objet à l’aide de la pointe d’un scalpel. Ensuite, lavez les sections plusieurs fois avec du SSC. Coloriez maintenant les échantillons pendant 10 minutes avec le colorant approprié, comme le DAPI ou les hooks 3 3 3 4 2 à 0,5 microgramme par millilitre dans un XPBS.

Ensuite, laver les lames trois fois avec du PBST 1× pendant 10 minutes par lavage. Après le troisième lavage, éliminer autant de liquide que possible de la lame. Puis, à l'extrémité de chaque lame, appliquer 80 microlitres de milieu de montage contenant un agent anti-fading.

Couvrez lentement le milieu avec une lamelle de haute qualité optique, en évitant la formation de bulles. Scellez ensuite la préparation avec du vernis à ongles et conservez-la à l'obscurité à quatre degrés Celsius. Lors de l'élaboration de ce protocole, plusieurs tampons salins ont été testés pour la révélation des épitopes.

Bien que les tampons EDTA aient tendance à endommager les tissus, le tris-citrate de sodium, l'acide chlorhydrique et l'eau distillée se sont révélés adaptés à la détection du VHS de type 1 afin de vérifier que le protocole fonctionnerait avec des sondes commerciales. La détection du génome latent du VHS de type 1 a été réalisée à l'aide d'une sonde biotinylée PAN VHS de type 1 obtenue auprès d'Enzo Biochem ; aussi bien les profils à tache unique que multiples pour le génome du VHS de type 1 ont pu être détectés.

En outre, le protocole FISH ADN a été testé sur des souris et des lapins infectés par trois souches couramment utilisées de l'HSV de type 1. Dans tous les cas, les génomes de l'HSV de type 1 ont présenté un signal tacheté avec une luminosité et une intensité variables. De plus, l'applicabilité du protocole a été évaluée au cours du cycle réplicatif de l'HSV de type 1 en réalisant une hybridation in situ en ADN sur des tissus prélevés chez des souris présentant une infection herpétique généralisée.

Dans ces animaux, de grands agrégats brillants de génomes d'HSV de type 1 ont été détectés dans divers tissus, notamment les ganglions de la racine dorsale, les yeux et le cerveau. Le protocole d'hybridation in situ en fluorescence de l'ADN est très polyvalent. Il permet la détection concomitante du génome d'HSV de type 1 et des ARN ou protéines viraux ou cellulaires.

Par exemple, la détection concomitante du génome du VHS de type 1 ainsi que du ARN lat du VHS de type 1 est réalisable. La détection concomitante du génome du VHS de type 1 avec des protéines cellulaires telles que la protéine centromérique CENP-A a été utilisée pour la détection concomitante du VHS de type 1 avec la chromatine et les corps nucléaires PML. La protéine associée A TRX a été visualisée au moyen d'une triple coloration montrant l'ADN du VHS-1 en rouge, son produit ARN lat en bleu et la TRX en vert.

Une fois le démasquage configuré, la procédure FISH ADN est très robuste. Elle peut être réalisée en moins de 24 heures par lots de 20 lames ou plus. Le développement de cette technique permettra aux chercheurs qui étudient les herpèsvirus et d'autres virus persistants d'explorer au niveau de la cellule unique comment les composants cellulaires et l'architecture nucléaire pourraient influencer la biologie de ces virus.