Name: Détection du génome et des transcriptions dun virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ Lhybridation combinée avec immunocoloration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Découvrez une méthode d'hybridation in situ fluorescente pour détecter le génome du virus herpès simplex de type 1 dans les ganglions trigémineaux de souris. Cette technique permet de visualiser le génome viral et ses ARN au niveau cellulaire.

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Nous remercions N. Sawtell (Hospital Medical Center de Cincinnati Children, Cincinnati, Ohio, USA), S. Efstathiou (Université de Cambridge, Royaume-Uni) et James Hill (LSU Health Sciences Center, La Nouvelle-Orléans, États-Unis) pour fournir des échantillons de HSV-1 les souris et les lapins infectés, respectivement, et des réactifs; H. Masumoto (Kazusa Institut de recherche de l&#39;ADN, Chiba, Japon) et S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, France) pour des discussions utiles. Ce travail a été financé par des subventions du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (programme ATIP, PL, http://www.cnrs.fr), l&#39;Agence nationale française de recherche (ANR) (ANR-05-MIIM- 008-01, CENTROLAT, <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ), la Fondation FINOVI ( <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ), le Labex DEVweCAN (ANR-10-61-labx ) de l&#39;Université de Lyon, dans le programme &quot;Investissements d&#39;Avenir »(ANR-11-IDEX-0007) exploité par l&#39;ANR ( <a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ), l&#39;Association pour la Recherche contre le cancer (ARC-7979 et ARC- 4910, <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ), la Ligue Nationale Contre le Cancer le (LNCC, <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ), et l&#39;INCa (programme EpiPro, <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e -cancer.fr</a> ). FC et PL sont des chercheurs du CNRS.

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Le protocole décrit ici permet la détection de HSV-1 génome latent dans les neurones de coupes de tissus neuronaux de souris. Notre compréhension des voies de régulation de l&#39;expression des gènes viraux a été limitée par l&#39;absence de méthode pour détecter le HSV-1 de l&#39;ADN génomique in situ dans les tissus neuronaux. Informations sur le génome nombre de copies et la proportion de neurones infectés provenaient principalement de l&#39;analyse par PCR sur les neurones dissociés 11,12. À éluc...

<html> Type de virus de l&#39;herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l&#39;établissement d&#39;une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l&#39;hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s&#39;intègrent pas dans le génome de la cellule hôte 1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l&#39;expression des gènes est limitée à la transcription associé à la latence (LAT) locus, à partir de l&#39;établissement de la latence initiation de réactivation 3. LAT produit une longue 8,5 kb non codantes de l&#39;ARN transformé en un 2 ko lasso majeur stable, et plusieurs miARN 4-7. HSV-1 de latence se caractérise donc par la présence de l&#39;ADN viral génomique, ARN LAT, et l&#39;absence de protéines du cycle de replication détectables. ontenu &quot;&gt; modèles animaux, principalement la souris et le lapin, sont des modèles expérimentaux récapitulant quelques éléments sur la latence chez l&#39;homme. L&#39;un des principaux intérêts de ces modèles est qu&#39;ils permettent d&#39;étudier les aspects physiologiques de HSV-1 de latence dans les sujets immunocompétents. cours des dernières décennies , de nombreux outils expérimentaux, tels que des virus et des souris génétiquement modifiées, ont été développées pour étudier la physiologie, de la génétique et de la biologie cellulaire de HSV-1 de latence, à partir de tissus animaux. Jusqu&#39;à présent, l&#39;ADN génomique viral a été détecté et quantifié par transfert de Southern et qPCR de dissocier les TG. Toutefois, il n&#39;existe actuellement aucune méthode pour détecter le HSV-1 génomique par hybridation in situ sur des coupes de tissu 8. En conséquence, la latence est couramment évaluée sur des coupes histologiques par la détection de l&#39;ARN LAT par hybridation d&#39;ARN in situ, plutôt que la détection du génome viral. Comme il a été impossible de caractériser les cellules infectées en fonction de la présence de génomes viraux, this limitation technique a été un inconvénient majeur pour l&#39;analyse de nombreux aspects des interactions hôte-virus, tels que la relation entre le génome viral et l&#39;expression cellulaire et virale ou gène de l&#39;hôte à médiation cellulaire réponse immunitaire 9,10. Plus important encore, l&#39;hétérogénéité de l&#39;infection latente de cellule à cellule reste relativement inexploré et a été montré pour être un élément clé de la latence chez la souris et dans les neurones ganglionnaires sensorielles humaines implantées dans des souris SCID 11-17. En règle générale, il a été montré par qPCR que le génome de HSV-1 du nombre de copies par cellule varie de 5 à plusieurs centaines. Bien que LAT apparaît comme un régulateur clé de la latence et la réactivation, les données qPCR sur les neurones isolés et en PCR in situ ont indiqué que seul un sous-ensemble de neurones infectés de manière latente, aussi bas que 30%, exprime le locus LAT 11,12,18-21. Comment la cellule hôte et l&#39;environnement cellulaire à l&#39;intérieur de l&#39;impact de la mise en place sur le tissu de la latence du virus etexpression des gènes viraux reste incertaine. Nous décrivons ici un solide hybridation fluorescente in situ (FISH) de la méthode pour la détection efficace de la copie de faible HSV-1 de l&#39;ADN génomique à l&#39;intérieur des sections de tissus neuronaux animales dans. Cette méthode a été conçue et utilisée par nous pour obtenir l&#39;accès à haut microscopie imagerie de résolution qui est nécessaire pour étudier l&#39;interaction du génome viral avec les cellules de l&#39;hôte composants intra-nucléaires 22. En outre, nous décrivons un procédé de coloration multiple pour la détection simultanée de l&#39;ADN viral à ARN et des protéines, qui est un outil unique pour décrire les interactions virus-hôte qui régulent l&#39;expression des gènes viraux. La méthode peut également être appliquée à un large éventail d&#39;analyses nécessitant la détection de HSV-1 génome latent, comme la quantification des neurones infectés dans grand nombre de sections. Une étape clé est d&#39;appliquer un traitement de récupération de l&#39;antigène de faire l&#39;ADN viral accessible à l&#39;hybridation. Ainsi, ce protocole pourrait également être efficace pour la détectiond&#39;autres virus ADN double brin, qui ne sont actuellement pas détectable par des approches ADN-FISH conventionnels dans les tissus animaux.

<table><tbody><tr><td>Souris Balb/c</td><td>Janvier, France</td><td></td><td>Femelles de 6 semaines</td></tr> souches <tr><td>HSV-1 souche</td><td>SC16 (type sauvage)</td><td></td><td>Voir Labetoule, M. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci 44, 217&ndash ; 225 (2003) pour des détails sur la préparation de la souche HSV-1 et du virus en stock.</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Sigma</td><td>K2753</td><td>Injection intrapéritonéale d’une solution contenant de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg)</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Mettre en suspension 4 g de PFA dans 90 ml d’eau. Ajouter 50 & micro ; l de 1N NaOH, et chaleur à 60 &deg ; C dans un bain-marie avec agitation. Le PFA se dissout en 30 minutes environ. Ajouter 10 ml de 10x PBS. Cette solution peut être préparée à l’avance et stockée à -20 &deg ; C en tubes de 5 ml. Prudence. Manipulez sous une hotte.</td></tr><tr><td>Saline physiologique</td><td>Sigma</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, pH 7,4 (stérile)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td>Préparez une solution de saccharose à 20 % dans 1x PBS.</td></tr><tr><td>Milieu d’enrobage de cryosectionnement - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de purification d’ADN à grand vecteur</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>Pour purifier le vecteur Cosmide ou BAC contenant le génome HSV-1 et le stocker à -20 &deg ; </td></tr><tr><td>C Nick kit de traduction</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53021</td><td>Protection contre la lumière</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>G50 Mini colonne de centrifugation</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïdes de saumon 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Éthanol biologie moléculaire grade</td><td>Sigma</td><td>87047</td><td>Préparer une solution à 70 %</td></tr><tr><td>ADN spermatozoïde</td><td>de saumon Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Formamid Biologie moléculaire grade</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>Attention. Manipulez sous la hotte.</td></tr><tr><td>Sonde commerciale biotinylée HSV-1&nbsp ;</td><td>Enzo Sciences de la vie</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>20x citrate de sodium salin (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>Préparez une solution 2x SSC dans ddH20.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Préparez une solution mère à 10 % dans l’eau et stockez-la à +4 &deg ;C. Préparez la solution à 0,5 % dans 1x PBS juste avant utilisation.</td></tr><tr><td>10 mM Citrate de sodium pH 6.0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Préparer une solution mère de 100 mM (10x). Peser 10,5 g d’acide citrique (MW 210.14). Attention, irritant et toxique, porter un masque et des gants appropriés) et dissoudre dans 400 ml d’eau. Ajustez le pH à 6,0 avec 1 N de NaOH (prudence, irritant, portez des gants). Ajuster à 500 ml avec de l’eau distillée. Diluer 10x dans de l’eau distillée avant utilisation.</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Méthanol, biologie moléculaire grade</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sulfate de dextran - MW 500,000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>La solution de Denhardt (100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciment Caoutchouc « FixoGum"</td><td>Marabut</td><td>290110000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de purification de l’ADN - Kit de purification PCR Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>T7 in vitro kit de transcription</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Biotine-16-UTP</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>11388908910</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Minicolonne de purification d’ARN</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ribonucléoside Vanadyl Complex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>Préparez une solution à 3 % dans de l’eau distillée. Magasin à +4 &deg ; C et protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>Levure ARNt</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>préparer une solution à 10 mg/ml dans de l’eau exempte d’ARNase</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Les</td><td></td><td></td><td>anticorps primaires suivants ont été utilisés dans la section des résultats : anti-souris CENP-A (mAb de lapin C51A7, Cell Signaling Technologies) et anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)</td></tr><tr><td>Anticorps fluorescents secondaires</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>Les anticorps secondaires fluorescents couramment utilisés dans notre protocole sont des anticorps de chèvre marqués au fluor Alexa (IgG H+L). L’anticorps utilisé dans la section des résultats est un anticorps anti-lapin de chèvre labé avec Alexa Fluor 488 (référence A11001)</td></tr><tr><td>Kit d’amplification du signal Tyramide (TSA) - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (fluorescence bleue)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20937</td><td>Les kits TSA sont également disponibles chez Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Kit d’amplification du signal tyramide (TSA) - Streptavidine + Alexa Fluor 488 (fluorescence verte)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Préparer un 0.5 & micro ; g/ml dans 1x PBS immédiatement avant l’utilisation. Jetez la solution restante.</td></tr><tr><td>lamelle de recouvrement de 22 mm x 50 mm. n&deg ; 1.5</td><td>Microscopie électronique à</td> verre <td>Sciences 72204-04</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Support de montage avec agent anti-décoloration - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Un autre produit conventionnel est le Fluoromount G de Electron Microscopy Science</td></tr><tr><td>Superfrost</td> lames de verre <td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Équipement/Matériel</td><td>Note</td><td>de référence</td><td>de l’entreprise</td></tr><tr><td>Aiguille pour infection</td><td></td><td></td><td>Micropipette en verre étirée à chaud. Sur mesure.</td></tr><tr><td>Matériel de dissection</td><td>Moria, France</td><td></td><td>Ciseaux et pinces microchirurgicaux</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Cole Palmer Instruments</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>Dispositif de pompe à microseringue (Nano Pump)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica France</td><td>CM 1510-1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>-80 &deg ; C congélateur</td><td>Sanyo</td><td></td><td>Ultra Low -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td></td><td></td><td></td> domestique</tr><tr><td>Chauffe-moteur à sec</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Incubateur Toboggan</td><td>Toboggan Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pot Coplin</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68512</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Récipient pour vitrail</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Les</td><td></td><td></td><td>images présentées dans la section des résultats ont été collectées avec un Zeiss AxioObserver avec objectif 40X LD NeoFluor N.A 0.6, et 100X PlanApochromat N.A 1.3. Ensemble de filtres #38, #43 et #43. Source lumineuse à fluorescence HXP 120. Photométrie CoolSNAP HQ2 Caméra CCD. Le signal sera plus facilement observé sur un microscope récent à haut rendement tel que les séries Zeiss AxioImager/AxioObserver, les séries Nikon Ti-E/Ni-E ou les séries Leica DM/DMI6000</td></tr></tbody></table>

détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à adn persistant dans neuronaux tissus par fluorescence in situ l&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Cellule à l&#39;unité co-détection d&#39;un gène, le produit de l&#39;ARN et des protéines régulatrices cellulaires est critique pour étudier la régulation de l&#39;expression génique. Il s&#39;agit d&#39;un défi dans le domaine de la virologie, en particulier pour les virus à ADN persistants nucléaires répliquant qui impliquent des modèles animaux pour leur étude. Type de virus de l&#39;herpès simplex 1 (HSV-1) établit une infection latente permanente dans les neurones périphériques. Virus latent sert de réservoir, d&#39;où il réactive et induit un nouvel épisode herpétique. La biologie de la cellule de HSV-1 de latence reste mal compris, en partie en raison de l&#39;absence de méthodes pour détecter les génomes de HSV-1 in situ dans des modèles animaux. Nous décrivons un ADN hybridation fluorescente in situ (FISH) dans l&#39;approche détecter efficacement faible nombre de copies de génomes viraux dans des coupes de tissus neuronaux de modèles animaux infectés. La méthode repose sur démasquage antigénique à base de chaleur, et des sondes d&#39;ADN directement marqués maison, ou des sondes disponibles dans le commerce. Nous avons développé un stai tripleapproche ning, combinant l&#39;ADN à l&#39;ARN FISH-FISH et immunofluorescence, en utilisant la peroxydase en fonction d&#39;amplification du signal pour accueillir chaque exigence de coloration. Une amélioration majeure est la possibilité d&#39;obtenir, dans les 10 sections um de tissu, les signaux basse fond qui peuvent être imagés à haute résolution par microscopie confocale et à grand champ épifluorescence classique. De plus, la coloration triple a travaillé avec une vaste gamme d&#39;anticorps dirigés contre les protéines cellulaires et virales. Le protocole complet 2,5 jours pour accueillir anticorps et la pénétration de la sonde dans le tissu.

Après plusieurs mois de tests, nous avons découvert que le démasquage chimique à base de chaleur latente fait HSV-1 génome disponible pour hybridation fluorescente in situ. Au cours du processus, nous avons essayé différentes procédures démasquer, et les traitements ne chaleur à base (c.-à-chauffer les sections à la température sous-ébullition dans un four à micro-ondes) comparu efficace. Nous avons ensuite testé plusieurs tampons de sel qui sont couramment utilisés en immunohistochimie (IHC) et la mic...

Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d&#39;hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l&#39;ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l&#39;étude de processus de l&#39;infection par co-détection du génome viral, de ses produits d&#39;ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l&#39;intérieur des cellules individuelles.

Détection du génome et des transcriptions d&#39;un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L&#39;hybridation combinée avec immunocoloration

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter le génome du virus de l'herpès simplex de type 1 dans des coupes de ganglions trijumeaux provenant de souris infectées de manière latente par hybridation in situ fluorescente. Cela est réalisé en inoculant d'abord le virus dans la lèvre de l'animal, suivi d'une période d'incubation de 28 jours au cours de laquelle le virus s'installe dans les ganglions trijumeaux. Ensuite, les ganglions trijumeaux sont prélevés, inclus et découpés en cryosections.Les sections sont soumises à plusieurs traitements préparatoires, notamment l'étape clé consistant à les chauffer dans un tampon de citrate de sodium. Enfin, une hybridation in situ fluorescente est réalisée à l'aide de sondes fluorescentes spécifiques de l'herpès. En définitive, les résultats peuvent montrer la localisation du génome viral à l'intérieur du noyau de neurones individuellement infectés grâce à la microscopie confocale.Dans de nombreux cas, l'étude d'un cycle biologique varié nécessite l'utilisation de modèles animaux. Le principal avantage de la technique présentée ici est qu'elle fournit des données au niveau de la cellule unique en utilisant une approche d'immunofluores

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Nous décrivons un protocole utilisant l'hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour visualiser les ARN herpèsvirs multiples dans les cellules humaines lytically infectées, en suspension ou adhérentes. Ce protocole comprend la quantification de la fluorescence produisant un rapport nucléocytoplasmique et peut être étendu pour la visualisation simultanée des protéines hôtes et virales avec immunofluorescence (IF).

Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

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Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

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Découvrez une méthode d'hybridation in situ fluorescente pour détecter le génome du virus herpès simplex de type 1 dans les ganglions trigémineaux de souris. Cette technique permet de visualiser le génome viral et ses ARN au niveau cellulaire.

Détection du génome et des transcriptions dun virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ Lhybridation combinée avec immunocoloration (Vidéo) | JoVE Journal

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