Détection du génome et des transcriptions d'un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L'hybridation combinée avec immunocoloration

L’objectif global de cette procédure est de détecter le génome du virus de l’herpès simplex, de type 1, dans des sections de ganglions du trijumeau de souris infectées de manière latente par hybridation in situ fluorescente. Ceci est accompli en inoculant d’abord le virus dans la lèvre de l’animal, suivi d’une période d’incubation de 28 jours au cours de laquelle le virus s’établit dans les ganglions du trijumeau. Ensuite, les ganglions du trijumeau sont récoltés, intégrés et cryosectionnés.

Les sections sont soumises à plusieurs traitements préparatoires, dont l’étape clé de leur chauffage dans un tampon de citrate de sodium. Enfin, l’hybridation in situ fluorescente est réalisée à l’aide de robes fluorescentes spécifiques à l’herpès. En fin de compte, les résultats peuvent montrer le positionnement du génome viral à l’intérieur du noyau des neurones infectés individuellement grâce à l’utilisation de la microscopie confocale.

Dans de nombreux cas, l’étude d’un cycle de vie varié nécessite l’utilisation de modèles animaux. Le principal avantage de la technique représentée ici est qu’elle fournit des données au niveau de la cellule unique en utilisant une approche de fluidisation en institut. Le modèle royal killer des infections à HS reproduit la plupart des aspects de l’histoire naturelle de l’infection à HSV chez l’homme.

C’est l’hôte naturel du virus. La primo-infection se produit dans les tissus buccaux, puis le virus progresse des lèvres vers les deux ganglions al-ganglionnaires. C’est le principal aspect de la latence HS V chez l’homme combiné à deux immuno et à la coloration.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la latence du virus de l’herpès, telles que la façon dont le virus interagit avec les composants nucléaires et comment ces interactions influenceraient le maintien de la latence et éventuellement la réactivation du virus. Pour commencer, prenez une souris anesthésiée et une solution mère de virus HSV. Mise en suspension dans un milieu sans rouge de phénol.

À l’aide d’un stéréoscope binoculaire, insérez l’aiguille dans la couche sous-épithéliale de la lèvre supérieure gauche au niveau du bord cutanéo-muqueux. Injectez 0,5 microlitre de solution virale pendant cinq secondes, puis faites une deuxième injection de virus au même endroit. Transférez la souris dans un incubateur à 37 degrés Celsius ou un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle se réveille.

Ensuite, mettez-le dans sa cage d’origine pendant le temps de récupération requis avant de le fixer selon le protocole texte. Coupez de chaque côté de la mâchoire inférieure. Coupez ensuite le bout du nez juste derrière les incisives pour révéler la cavité nasale.

Coupez le palais en deux avec des ciseaux, puis placez-le sur le côté. Les ganglions du trijumeau se trouvent sous le palais. Ce sont des masses oblongues blanches, de deux à trois millimètres de long et reliées au nerf trijumeau.

Coupez les branches nerveuses du trijumeau de chaque côté des ganglions pour les libérer du tronc cérébral. À l’aide d’une pince chirurgicale, retirez les ganglions et transférez-les à 20 % de saccharose dans PBS pour les laisser incuber pendant 24 heures. À température ambiante le lendemain, intégrez les deux ganglions du trijumeau dans un seul bloc de cryosection.

Milieu d’enrobage, congelez le bloc à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit sectionné sur un cryostat. Coupez les ganglions du trijumeau dans le sens de la longueur en sections de 10 microns et collectez-les sur des lames super givrées réchauffées à 30 degrés Celsius. Quatre à cinq sections peuvent tenir sur une seule glissière.

Il peut être utile d’attribuer à la diapositive plusieurs étiquettes de série. Si plusieurs applications en aval sont prévues, laissez sécher les tranches pendant cinq à 10 minutes avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour ce protocole, la sonde est préparée en marquant des cosmes contenant des portions de 30 kilobases du génome du HSV un avec SI 3D CTP par traduction NIC.

Il est précipité et en suspension sous forme désionisée d’amide et devrait apparaître rose en raison de l’incorporation de S SI trois le premier jour. Placez les lames sur un support de diapositives à température ambiante et laissez sécher les sections pendant 10 minutes. Ensuite, réhydratez les sections dans un XPBS pendant 10 minutes.

Ensuite, perméez le tissu dans 0,5 % Triton X 100 dans un XPBS pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les lames trois fois pendant 10 minutes par lavage avec deux XSS et conservez-les dans deux XSSC jusqu’à ce que le tampon de démasquage soit chauffé. Pour le démasquage, préchauffez le tampon de citrate au micro-ondes jusqu’à ce que le tampon bout.

Cela se fait en remplissant un plateau de diapositives en verre avec 200 millilitres de tampon. Placez le plateau dans un récipient plus grand rempli de 500 millilitres d’eau distillée et préchauffez le tampon jusqu’à ébullition. Transférez ensuite les lames sur le plateau.

Vérifiez qu’ils sont complètement recouverts de tampon au micro-ondes. Chauffez les lames dans le tampon pendant environ 20 secondes jusqu’à ce que le tampon atteigne l’ébullition. Ne laissez pas le tampon déborder.

Ensuite, refroidissez les lames à température ambiante pendant deux minutes et répétez le cycle de chauffage six fois de plus. Il est essentiel de déterminer empiriquement le nombre et la durée des cycles d’alimentation pour la reproductibilité de l’étape de démasquage. Le four à micro-ondes, le plateau, le récipient, le volume de tampon dans le plateau.

Le volume d’eau dans le récipient doit être maintenu identique lorsque le chauffage est terminé. Transférez les lames dans deux XSSC pendant cinq minutes sous une hotte, incubez les lames dans une solution de trois à une à quatre de méthanol, d’acide acétique et de PBS pendant 15 minutes. Ensuite, incubez les lames dans un mélange de méthanol et d’acide acétique fraîchement préparé pendant 15 minutes.

Maintenant, déshydratez les sections par des incubations successives de 10 minutes dans de l’éthanol à 70 %, suivies de deux incubations de 10 minutes dans de l’éthanol pur. Laissez sécher les lames à température ambiante pendant 10 minutes pour les préparer à la sonde. Appliquez 80 microlitres de solution de sondage sur les sections séchées goutte à goutte et couvrez-les d’une lamelle.

Vérifiez que la solution de sondage se répand sur toute la surface de la lamelle et qu’il n’y a pas de bulles. Scellez ensuite la lamelle avec de la colle de caoutchouc et laissez-la sécher. Procédez à la dénaturation en incubant les lames à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, transférez rapidement les lames sur un plateau métallique sur de la glace pendant cinq minutes. Poursuivez avec une hybridation nocturne à 37 degrés Celsius le lendemain. Retirez le ciment en caoutchouc à l’aide d’une pince avec les lames sur un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius.

Retirez délicatement la lamelle avec la pointe d’une lame de scalpel. Ensuite, lavez les sections à plusieurs reprises avec du SSC. Maintenant, colorez les échantillons pendant 10 minutes avec le colorant approprié comme le DAPI ou les crochets 3 3 3 4 2 à 0,5 microgramme par millilitre dans un XPBS.

Ensuite, lavez les lames trois fois avec un XPBS pendant 10 minutes par lavage. Après le troisième lavage, égouttez autant de liquide que possible de la lame. Puis à la fin de chaque lame, appliquez 80 microlitres de milieu de montage avec un agent anti décoloration.

Couvrez lentement le support avec une lamelle de haute qualité optique, en évitant la formation de bulles. Scellez ensuite la lame avec du vernis à ongles et rangez-la dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Lors de l’élaboration de ce protocole, plusieurs tampons de sel ont été testés pour le démasquage.

Alors que les tampons EDTA avaient tendance à endommager les tissus. Le citrate de sodium, le tris, le HCL et l’eau distillée étaient appropriés pour la détection du HSV afin de vérifier que le protocole fonctionnerait avec des sondes commerciales. La détection du génome latent du HSV a été réalisée à l’aide d’une sonde biotinylée PAN HSV obtenue auprès d’Enzo Biochem, des motifs ponctuels uniques et multiples pour le HSV un seul génome ont pu être détectés.

De plus, le protocole ADN poisson a été testé sur des souris et des lapins infectés par trois souches HSV 1 couramment utilisées. Dans tous les cas, les génomes du HSV one ont montré un signal inégal avec une luminosité et une intensité variables. De plus, l’applicabilité du protocole a été testée dans le cycle réplicatif du HSV un en effectuant de l’ADN de poisson sur des tissus de souris subissant une infection générale par l’herpès.

Chez ces animaux, de grands agrégats brillants de génomes du HSV one ont été détectés dans divers tissus, y compris les yeux et le cerveau du DRG. Le protocole ADN poisson est très polyvalent. Il permet la co-détection du génome du HSV et des ARN et protéines viraux ou cellulaires.

Par exemple, la co-détection d’un génome du HSV avec l’ARN lat du HSV est réalisable, la co-détection d’un génome du HSV avec des protéines cellulaires telles que la protéine Centro MERIC CE NPA A a été utilisée co-détection du HSV un avec la chromatine et les corps nucléaires PML. La protéine A TRX associée a été visualisée avec une triple coloration montrant HSV 1D NA en rouge. Son produit d’ARN est en bleu et un TRX en vert.

Une fois le démasquage mis en place, la procédure d’ADN des poissons est très robuste. Il peut être réalisé en moins de 24 heures par lots de 20 lames ou plus. Le développement de cette technique permettra aux chercheurs qui étudient les virus de l’herpès et d’autres virus persistants d’explorer, au niveau de la cellule unique, comment les composants cellulaires et l’architecture nucléaire pourraient influencer la biologie de ces virus.