Article de méthode

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

DOI :

10.3791/51114

⸱

17 janvier 2014

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1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malgré la disponibilité du traitement et du vaccin, la tuberculose (TB) reste l’une des infections bactériennes les plus mortelles et les plus répandues dans le monde. Depuis plusieurs décennies, l’explosion soudaine de souches multirésistantes et largement résistantes aux médicaments constitue une menace sérieuse pour le contrôle de la tuberculose. Par conséquent, il est essentiel d’identifier de nouvelles cibles et voies critiques pour l’agent causal de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)et de rechercher de nouveaux produits chimiques qui pourraient devenir des médicaments antituberculeux. Une approche consiste à mettre en place des méthodes adaptées aux écrans génétiques et chimiques des bibliothèques à grande échelle permettant la recherche d’une aiguille dans une botte de foin. À cette fin, nous avons développé un test phénotypique en nous appuyant sur la détection de Mtb marqué par fluorescence dans les cellules hôtes marqués par fluorescence à l’aide de la microscopie confocale automatisée. Ce test in vitro permet une quantification basée sur l’image du processus de colonisation de Mtb dans l’hôte et a été optimisé pour le format de microplaque de 384 puits, qui convient aux cribles de siRNA, de composé chimique ou de Mtb mutant-bibliothèques. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse multiparamétrique, qui fournit la lecture inférer sur la pathogénie de Mtb dans les cellules hôtes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parmi les agents pathogènes infectieux émergents et réémergents signalés au cours des dernières années, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)occupe une place de choix en étant responsable de 1,4 million de décès et de 8,7 millions de nouvelles infections en 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Malgré la disponibilité de thérapies multidrogues, le nombre de personnes infectées est toujours en hausse et multirésistante (MDR) ainsi que le Mtb très résistant aux médicaments (XDR) se propagent rapidement dans le monde entier1. De plus, si l’on tient compte de la présence d’antigènes Mtb, il est évident qu’un tiers de la population mondiale est considéré comme étant infecté de manière latente par Mtb. Statistiquement, dans un cas sur dix, il y a évolution vers la forme active de la maladie avec les symptômes cliniques suivants2. Par conséquent, de nouveaux moyens de lutter contre le VTT sont nécessaires de toute urgence. Dans ce contexte, nous avons développé un test phénotypique visuel in vitro s’appuyant sur la surveillance de l’invasion et de la multiplication du Mtb dans les cellules hôtes par microscopie confocale automatisée à fluorescence3. L’adaptation du test dans des plaques de microtitration de 384 puits en combinaison avec l’acquisition et l’analyse automatisées d’images, a permis un criblage à haute teneur / haut débit (HC / HTS) de bibliothèques à moyenne échelle de composés, de siARN et de mutants bactériens. Le criblage d’une bibliothèque d’ARNi à l’échelle du génome sur ce dosage phénotypique a ainsi permis d’identifier les principaux facteurs hôtes impliqués dans le trafic de Mtb et la réplication intracellulaire mais aussi l’élucidation des voies de l’hôte exploitées par le bacille tuberculeux. Une autre adaptation de ce test phénotypique particulier était pour l’identification des facteurs bactériens essentiels à la persistance intra-phosomique de Mtb. Par exemple, l’arrêt de la maturation du phagosome est considéré comme l’un des principaux mécanismes qui facilitent la survie et la réplication du Mtb dans les macrophages. La surveillance de la localisation subcellulaire des mutants knock-out Mtb dans les compartiments acides marqués par fluorescence a permis d’identifier les gènes bactériens impliqués dans le processus de survie4. Enfin, l’imagerie à haute teneur de Mtb offre également une excellente méthode pour quantifier l’efficacité des médicaments pour inhiber divers phénomènes tels que la croissance bactérienne intracellulaire3. Au total, ce type de dosage phénotypique à haut débit permet d’accélérer la découverte de médicaments contre la tuberculose et les données collectées par ces différentes approches contribuent à une meilleure compréhension de la manipulation de l’hôte exercée par Mtb.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome

Criblage effectué dans une lignée cellulaire humaine de pneumocytes de type II modèle A549 lors de l’infection par Mtb H37Rv exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). Cette procédure est décrite à la figure 1A.

  1. Remettre en suspension la bibliothèque d’ARNsi séchés qui est stockée dans des plaques mères (plaques de 96 puits) avec 1x tampon d’ARNsi pour atteindre une concentration de 4 μM, puis transférer 10 μl du mélange dans une plaque fille de 384 puits (plaque fille 1).
  2. Ajouter 10 μl de tampon d’ARNsi 1x dans la plaque fille 1 pour diluer l’ARNsi par 2 fois. Après la remise en suspension de l’ARNsi, les plaques sont scellées avec un joint en aluminium pelable et peuvent être stockées à -20 ° C au moins 6 mois et jusqu’à 2-3 ans, mais le temps de stockage peut varier en fonction des recommandations du fabricant de la bibliothèque siRNA.
  3. Diluer les siARN de la plaque fille 1 en plaque fille 2 pour atteindre une concentration de 500 nM. Après la remise en suspension de l’ARNsi, les plaques sont scellées avec un joint en aluminium pelable et peuvent être stockées à -20 ° C au moins 6 mois et jusqu’à 2-3 ans, mais le temps de stockage peut varier en fonction des recommandations du fabricant de la bibliothèque siRNA.
  4. Avant utilisation, décongeler la plaque fille 2 à température ambiante.
  5. Prendre 2,5 μl d’ARNsi de la plaque fille 2 et placer dans une plaque d’analyse à 384 puits.
  6. Dans la même plaque d’analyse de 384 puits à l’étape 1.5, ajouter 2,5 μl d’ARNsi témoin négatif et positif à leurs puits respectifs.
  7. Diluer le réactif de transfection dans 1x D-PBS pour donner suffisamment de solution pour fournir 0,1 μl de réactif de transfection dans chaque puits et pré-incuber la solution de transfection diluée à température ambiante pendant 5 min.
  8. Ajouter 7,5 μl du mélange réactif de transfection/solution PBS à chaque puits de la plaque d’essai et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  9. Ajouter 40 μl de cellules A549 (1 500 cellules/puits) en suspension dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (SBF). Maintenir les cellules pendant une période d’incubation de 3 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Ces cellules se divisent toutes les 24 heures, soit environ 12 000 cellules se trouvent dans les puits trois jours après la transfection.
  10. Laver une culture Mtb H37Rv exprimant le GFP de deux semaines avec du D-PBS (exempt de MgCl2 et CaCl2)par centrifugation à 4 000 x g pendant 5 min et jeter les lavages. Répétez cette étape 3x. (Pour des conditions de culture deGFP-Mtb H37Rv voir le Protocole 3).
  11. Suspendre le culot bactérien dans 10 ml de milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS et décanter pendant 1 heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter.
  12. Recueillir le surnageant bactérien et mesurer la DO600 (LA600 doit être comprise entre 0,6 et 0,8) et la fluorescence GFP (valeur RFU) à l’aide d’un lecteur de microplaques pour déterminer la concentration bactérienne. Calculer le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence affichant la valeur RFU = f (valeur CFU) qui avait été générée avant l’expérience sur une autre culture qui avait été préparée dans les mêmes conditions. Préparer une suspension bactérienne contenant 2,4 x 106 bactéries/ml, ce qui correspond à une multiplicité d’infection (MOI) de 5.
  13. Retirer le milieu dans la plaque d’analyse de 384 puits et ajouter 25 μl de suspension bactérienne fraîchement préparée.
  14. Incuber la plaque d’analyse à 384 puits à 37 °C pendant 5 heures dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
  15. Retirez le milieu et lavez doucement les cellules avec un milieu RPMI complété par 10% FBS 3x.
  16. Pour tuer les bactéries extracellulaires restantes, traiter les cellules avec 50 μl de milieu RPMI-FBS frais contenant 50 μg/ml d’amikacine à 37 °C pendant 1 h dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
  17. Retirer l’amikacine contenant du milieu et ajouter 50 μl de milieu RPMI frais complété par 10 % de FBS. Incuber la plaque d’analyse à 384 puits à 37 °C pendant 5 jours dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
  18. Avant l’acquisition de l’image, ajouter 10 μl de 30 μg/ml de DAPI fraîchement préparés dans du PBS (concentration finale de 5 μg/ml) et incuber pendant 10 min à 37 °C.
  19. Chargez la plaque dans un microscope confocal automatisé.
    figure-protocol-1
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  20. Définissez les paramètres d’exposition. Enregistrer la fluorescence DAPI à l’aide d’un laser d’excitation 405 nm avec filtre d’émission de 450 nm et la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm avec filtre d’émission de 520 nm.
    figure-protocol-2
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    figure-protocol-3
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  21. Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, ce qui est ensuite appelé paramètres de mise en page et de sous-disposition.
    figure-protocol-4
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  22. Générez le fichier d’expérience à l’aide des paramètres des étapes 1.20 et 1.21, puis exécutez l’acquisition automatique.
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    figure-protocol-7
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  23. Transférer des images vers un serveur distant.
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  24. Évaluer les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Détecter les noyaux cellulaires du canal DAPI à l’aide de l’algorithme de détection des noyaux et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels (Figure 4A).

Remarque: Ce protocole est optimisé pour étudier l’effet du silençage génique sur la croissance intracellulaire de Mtb. Le VTT est une bactérie à croissance lente qui se divise toutes les 20 heures dans des conditions optimales. Après 5 jours post-infection, la quantité de VTT extracellulaire est encore faible en l’absence de lyse cellulaire et n’a pas affecté la qualité de l’analyse. Ce protocole doit être optimisé en termes de durée de traitement antibiotique et de temps d’incubation pour être adapté aux criblages siRNA utilisant des bactéries à croissance rapide comme Mycobacteria smegmatis et Escherichia coli qui sont largement libérées et peuvent infecter de nouvelles cellules.

2. Criblage composé à haut débit

Dépistage effectué sur des cellules hôtes infectées par Mtb H37Rv. Cette procédure est décrite à la figure 1B.

  1. Décongeler les plaques mères de 384 puits contenant la bibliothèque composée solubilisée dans le DMSO à 100%. Transférer 0,5 μl des composés dans des plaques filles de 384 puits contenant 10 μl de milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS.
  2. Laver une culture Mtb H37Rv exprimant le GFP de deux semaines avec du D-PBS (exempt de MgCl2 et CaCl2)par centrifugation à 4 000 x g pendant 5 min et jeter les lavages. Répétez cette étape 3x (pour les conditions de cultureGFP-Mtb H37Rv voir protocole 3).
  3. Suspendre le culot bactérien dans 10 ml de milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS et décanter pendant 1 heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter.
  4. Recueillir le surnageant bactérien et mesurer la DO600 (DO600 doit être comprise entre 0,6 et 0,8) et la fluorescence GFP (valeur RFU) à l’aide d’un lecteur de microplaque. Calculer le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence affichant la valeur RFU = f (valeur CFU) qui avait été générée avant l’expérience. La concentration typique est de 1 x 108 bactéries/ml.
  5. Récoltez des macrophages humains primaires âgés de 6 jours à 4 x 105 cellules/ml dans le milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 50 ng/ml de M-CSF humain recombinant (pour la purification des cellules monocytaires du sang périphérique humain et la différenciation des macrophages, voir le protocole 4).
  6. Incuber les cellules primaires diluées avec des bacilles à différents MOI, allant de 1 à 5, en suspension avec des secousses légères à 90 rpm pendant 2 heures à 37 °C.
  7. Laver les cellules infectées par centrifugation à 350 x g pour éliminer les bactéries extracellulaires. Après chaque étape de centrifugation, ressusciter la pastille dans un milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS. Répétez cette étape 2x.
  8. Suspendre les cellules infectées dans le milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS et d’amikacine à 50 μg/ml et incuber la suspension avec des secousses légères pendant 1 h à 37 °C.
  9. Retirer le milieu de culture cellulaire contenant de l’amikacine par centrifugation à 350 x g et laver les cellules infectées avec un milieu RPMI 1640 complet complété par 10 % de FBS et 50 ng/ml de M-CSF humain recombinant. Répétez une fois.
  10. Ajouter 40 μl de la suspension de macrophages infectés dans la même plaque d’essai à l’étape 2.1, qui contient déjà 10 μl des dilutions composées. La concentration finale de DMSO dans chaque puits a maintenant atteint 1%.
  11. Incuber les plaques d’essai pendant 5 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.
  12. Colorer les cellules vivantes avec un colorant fluorescent rouge lointain perméant.
  13. Chargez la plaque dans un microscope confocal automatisé.
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  14. Définissez les paramètres d’exposition. Enregistrer la fluorescence rouge lointain à l’aide d’un laser d’excitation 640 nm avec filtre d’émission de 690 nm et la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm avec filtre d’émission de 520 nm.
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    figure-protocol-11
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  15. Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, ce qui est ensuite appelé paramètres de mise en page et de sous-disposition.
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    figure-protocol-13
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  16. Générez le fichier d’expérience à l’aide des paramètres des étapes 2.14 et 2.15 et exécutez l’acquisition automatique.
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    figure-protocol-15
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  17. Transférer des images vers un serveur distant.
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  18. Évaluer les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Détecter la zone cellulaire du canal rouge lointain à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels(Figure 4B).

Remarque : Ce protocole peut être adapté pour le criblage de la bibliothèque mutante Mtb en remplaçant les composés par des mutants exprimant une protéine fluorescente (Un puits/Un mutant) (Figure 1C, voir aussi Brodin et al. 4). Les mutants fluorescents sont d’abord ensemencés dans des puits (20 μl de suspension bactérienne par puits). Les bactéries sont ensuite récupérées par 30 μl de suspension cellulaire. Après centrifugation à 350 x g pendant 1 min, la plaque est incubée à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Le temps d’incubation et le MOI dépendent du test. Par exemple, pour la visualisation des premiers événements cellulaires tels que l’acidification des phagosomes, les cellules peuvent être infectées pendant 2 heures avec moi allant de 1-20. Les lysosomes sont colorés à l’aide du colorant Lysotracker à 2 μM pendant 1,5 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2, puis fixés avec 10 % de forcine ou 4 % de paraformaldéhyde (PFA). Les images confocales sont acquises et finalement analysées à l’aide de scripts d’analyse d’images comportant des algorithmes appropriés pour la détection des lysosomes et la localisation subcellulaire4.

3. Protéine fluorescente verte exprimant mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Conditions de culture

Pour le stockage à long terme, les GFP-H37Rv ont été congelés dans du D-PBS (environ 1 x10 8 mycobactéries par flacon).

  1. Résurciez un flacon congelé de GFP-H37Rv dans une fiole d’Erlenmeyer contenant 50 ml de bouillon 7H9 additionnés d’enrichissement en OADC de Middlebrook à 10 %, de glycérol à 0,5 %, de Tween-80 à 0,05 % et d’hygromycine B (50 μg/ml).
  2. Incuber 8 jours à 37 °C.
  3. Mesurer laDO 600 de la culture GFP-H37Rv.
  4. Diluer la culture GFP-H37Rv pour obtenirla DO 600 = 0,1 dans un bouillon 7H9 frais complété par un enrichissement en OADC de Middlebrook à 10 %, du glycérol à 0,5 %, du tween-80 à 0,05 % et de l’hygromycine B (50 μg/ml).
  5. Incuber le GFP-H37Rv à 37 °C pendant 8 jours de plus avant de l’utiliser pour le dosage.

4. Purification des cellules monocytaires du sang périphérique humain à partir de la préparation de sang total ou de buffy-coat

  1. Diluer la poche sanguine 2x dans 1x D-PBS (exempt deMgCl2 et CaCl2)contenant 1% fbs.
  2. Isoler les monocytes par centrifugation de gradient de densité de Ficoll à 400 x g pendant 20 min.
  3. Recueillir les monocytes isolés.
  4. Laver les monocytes 3x avec 1x D-PBS (exempt deMgCl2 etCaCl2)contenant 1% de FBS par centrifugation à 400 x g pendant 10 min à température ambiante.
  5. Concentrer les cellules jusqu’à 1 x 107 cellules/ml.
  6. Purifier les monocytes à l’aide de billes magnétiques CD14 selon le protocole du fabricant (voir Matériaux).
  7. Après purification des cd14-monocytes, ensemencer les cellules à 1,5 x10 6 cellules/ml dans RPMI 1640 complété par 10% FBS et 40 ng/ml de macrophages humains Colony Stimulating Factor (hM-CSF) et incubés pendant 4 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% deCO2.
  8. Après 4 jours, remplacer le milieu par du RPMI 1640 frais complété par 10% de FBS et 40 ng/ml de hM-CSF et incubé pendant 2 jours à 37°C dans une atmosphère contenant 5% deCO2.
  9. Après 6 jours, les cellules peuvent être utilisées pour le test.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome

Mtb est capable de coloniser les cellules immunitaires in vitro ainsi que plusieurs autres cellules épithéliales pulmonaires. Par exemple, Mtbest capable d’infecter et d’endommager les cellules épithéliales A549 qui sont couramment utilisées comme modèle pour les pneumocytes humains de type II5-7. Dectin-1 a été rapporté comme un récepteur de la cellule hôte impliqué dans l’absorption de Mtb, la ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici les méthodes requises pour un essai phénotypique utilisant une contrainte de Mtb H37Rv exprimant GFP pour infecter les cellules hôtes fluorescentement étiquetées, ce qui le rend approprié pour des écrans à haute teneur/à haut débit. Ce protocole pourrait être appliqué à un large éventail de composés, de sondes fluorescentes et de mutants Mtb. Pour chaque protocole décrit ci-dessus, des étapes de fixation et d’immunomarquage pourraient être effectuées avant l’acquisition de l’image. No...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu financièrement par la Communauté européenne (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), l’Agence Nationale de Recherche, le Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), et la Région Nord Pas de Calais. Nous remercions Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni et Frank Lafont de la plateforme BICeL pour leur assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
et micro ; Plaque transparente noire, 384 puitsGreiner Bio-One781091127,8/86/15 MM avec couvercle,
CellCarrier traité TC Plaque 384 puitsPerkinElmer6007550Noir, Fond transparent, avec couvercle, Fond
en V traité TC blanc, Plaque 384 puitsGreiner Bio-One781280  ;
ruban d’étanchéité, respirant, stérileCorning3345  ;
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150réactif de transfection
DiméthylsulfoxydeSigma-Aldrich34943  ;
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010Milieu de culture cellulaire
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco' ; s Tampon Phosphate Salin
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco' ; s Phosphate Salin Buffer
Fetal bovinsérum Life Technologies2610040-79  ;
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll pour la purification des cellules monocytaires du sang périsphérique
Microbilles CD14, humainMiltenyi130-050-201Purification des monocytes CD14+
M-CSF humain, gr. premium (1000 &mu ; g)Miltenyi130-096-493Facteur de stimulation des colonies de macrophages
LS ColonnesMiltenyi130-042-401Colonnes pour l’isolement des monocytes CD14+
Tween 80Euromedex2002-ACulture de mycobactéries
Glycérol haute pureté  ;Euromedex50405-EX Culture demycobactéries
  ; Middlebrook Enrichissement OADCBecton-Dickinson211886Culture de mycobactéries
7H9Becton-DickinsonW1701PCulture de mycobactéries
Versene 1xLife Technologies15040033Solution de dissociation cellulaire non enzymatique
DAPILife TechnologiesD1306Colorant des noyaux
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Colorant des noyaux
Syto60Life TechnologiesS11342Colorant noyaux/cytoplasme
FormolSigma-AldrichHT5014Solution de fixation cellulaire
siRNA ciblant Dectin-1Santa-Cruzsc-63276  ;
*siGenome* Pool de siRNA non ciblé  ;DharmaconD-001206-14  ;
RifampicineSigma-AldrichR3501antibiotique
Isoniazide (INH)Sigma-AldrichI3377-50Gantibiotique
Hygromycin BLife Technologies10687-010antibiotique
AmikacinSigma-AldrichA1774
Microscope confocal automatisé OPERAPerkinElmerAcquisition d’images
Base de données serveur Columbus 2.3.1PerkinElmerTransfert, stockage et analyse de données
Logiciel Acapella 2.6PerkinElmerAnalyse basée sur l’image
Logiciel GraphPad Prism5statistiqueGraphPad
Excel 2010MicrosoftAnalyse statistique
Analyse

Références

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