Minimalement invasive Création d'murin orthotopique de la vessie xénogreffes

recherche sur le cancer est tributaire des modèles animaux de cancer humain utilisant des lignées cellulaires dérivées de tumeurs de patients afin d'approfondir notre compréhension de la biologie de la tumeur. Pour l'analyse in vivo de la croissance des sous différentes stratégies de traitement des modèles de cancer de la vessie murin orthotopique restent l'étalon de référence ^{de 1,2.} L'inoculation des cellules cancéreuses de la vessie humaines chez des souris immunodéprimées (modèle de xénogreffe) repose sur l'instillation intravésicale ("modèle intravésicale") ^3,4,5 ou injection directe dans la paroi de la vessie ("modèle intra-muros") ^6,7. Les deux techniques peuvent également être effectuées sur des rats ^8,9.

Instillation intravésicale induit la formation de tumeurs sur la surface urothéliale de la vessie, qui sont susceptibles d'être ensuite instillation intravésicale ultérieure de nouveaux agents thérapeutiques. Toutefois, le nombre de lignées cellulaires qui sont de façon fiable lorsque tumorigène envoyé par cette méthode est limitée d'uned l'une de ces lignées cellulaires, KU7, a récemment été démontré que les cellules HeLa ^4,10. Instillation intravésicale est également beaucoup de temps en raison des temps de séjour nécessaires, et il induit souvent la croissance tumorale dans les éléments adjacents de l'appareil urinaire, y compris l'urètre, l'uretère et bassinet ^11. En outre, instillation intravésicale conduit souvent à la croissance de la tumeur sur le plancher de la vessie, où les uretères pénètrent dans la vessie, et cela peut provoquer une obstruction des voies supérieure et une insuffisance rénale concomitante.

Xénogreffes de cancer de la vessie invasifs primaires qui sont appropriées pour des traitements systémiques sont créées par l'injection directe de cellules tumorales dans la paroi de la vessie ^12. Bien que de nombreuses lignées cellulaires croissent convenablement dans ce modèle, la limitation est le pouvoir envahissant du modèle relative à la nécessité d'une incision abdominale ^13. Le modèle est également difficile à apprendre en raison de la difficulté technique de l'injection de cellules précisément dans la paroi du musclede la vessie.

Une nouvelle approche pour établir des xénogreffes primaires orthotopiques de cancer invasif de la vessie chez les souris a été développé dans notre département afin de combler les lacunes existantes du «modèle intra-muros". Nous avons été en mesure d'optimiser l'injection percutanée guidée par ultrasons des cellules du cancer de la vessie dans la paroi antérieure de la vessie résultant de cette nouvelle technique de remplacer avec succès le modèle établi invasive. En outre, nous avons potentiellement accroître la précision et la reproductibilité du "modèle intra-muros".

Toutes les procédures d'animaux ont été réalisés selon les directives du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Le protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l'Université de la Colombie-Britannique (numéro de protocole: A10-0192).

Une. Préparation de lignées cellulaires

1. Confirmer l'identité des lignées de cellules de cancer de la vessie humaine respectifs par les empreintes génétiques ^7.
2. Pour l'analyse de la croissance de tumeurs de xénogreffes par bioluminescence, transfecter des lignées de cellules avec un produit d'assemblage lentiviral portant le gène de la luciférase de luciole ^3.
3. Dégel et d'étendre les lignes de cellules existant dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée _de CO2 à 5%. Passage des cellules au moins 3x mais éviter les temps de culture de plus de 3 mois.

2. Préparation de suspension cellulaire

1. Décongeler Matrigel. Maintenir la température en dessous de4 ° C pour éviter d'accroître la viscosité du gel.
2. Trypsiniser les cellules à une confluence de 70% et de mettre en suspension dans un milieu de croissance normal.
3. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou compteur de cellules automatique.
4. Faire tourner la suspension de cellules pendant 5 min à 200 x g. Retirer le surnageant.
5. Ajouter le volume approprié de DMEM (FBS à 10%) et Matrigel (rapport 1:1) pour parvenir à la concentration cellulaire désirée qui dépend de la lignée cellulaire utilisée et la cinétique de croissance souhaités (8-15 x 10 ⁶ / ml). Le volume injecté de la tumeur suspension cellulaire sera de 40 ul.
6. Mélangez bien par aspiration et refoulement (P1000), éviter de créer des bulles d'air dans la suspension.

3. Préparation des animaux

Remarque: En raison de la nécessité éventuelle de cathétérisme endoscopique à l'étape 4.7, les souris femelles sont le genre préféré dans ce modèle animal.

1. Les souris domestiques selon gu institutionnel et les soins des animaux nationaleidelines. Obtenir l'approbation du comité d'éthique pour toutes les expériences sur des souris.
2. Anesthésier les souris avec de l'isoflurane mélange / oxygène de 3%. Confirmer le bon anesthésie des animaux (par exemple, l'absence de réponse à pincées d'orteil).

4. Expérimental

1. Couper la stabilisation de la vessie à partir de tout type de plat en matière plastique rigide [Figure 2 I]. Inspectez soigneusement la courroie et retirez les arêtes vives avant l'application sur les souris.
2. Montez l'animal sur la table d'imagerie chauffée [Figure 1 I] de la petite plate-forme d'imagerie animale avec un suivi continu des signes vitaux. Fixer les membres inférieurs avec une bande de caoutchouc [Figure 1 III].
3. Désinfecter l'abdomen avec 2% de gluconate de chlorhexidine et essuyer la peau avec un coton-tige stérile.
4. Immobiliser la vessie avec la sangle de stabilisation de la vessie [Figure 2 II]. Ainsi, une évasionde la vessie lors de l'injection intra-muros à l'étape 5.6 seront évités.
5. Appliquer le gel d'échographie stérile à l'abdomen inférieur.
6. Approchez lentement la tête de balayage à ultrasons (fréquence de 40 MHz) [figure 1 IV] de la peau (longitudinal avec un angle de 45-70 ° crânienne) et de visualiser la vessie sur l'écran de l'échographie [Figure 3 I].
7. Si la vessie est vide, remplissez-le avec 50 pi stérile, chaud salines de tampon phosphate (PBS) à un G angiocathéter transurétrale 24.

5. La séparation des couches de la vessie mur

1. Attacher une seringue 1,0 ml rempli avec du PBS et reliée à un 30 G, ¾ en aiguille (biseau dirigé en avant) de la bride de la seringue.
2. Positionner l'aiguille vers la peau juste au-dessus de l'os pubien dans un angle de 30-45 ° (80 à 90 ° par rapport à l'axe longitudinal de la tête de balayage ultrasonore [Figure 1]).
3. Détecter l'aiguillesur l'écran d'ultrasons.
4. Lentement perforer la peau et les muscles de la paroi abdominale [Figure 3 II].
5. Tourner le biseau de l'aiguille 180 ° (maintenant dirigé en arrière).
6. Insérer la pointe de l'aiguille dans la paroi de la vessie sans pénétrer la muqueuse [Figure 3 III]
7. Injecter lentement 50 pi de PBS entre la couche musculaire et la muqueuse afin de créer un espace artificiel [Figure 3 IV].
   Remarque: Si la muqueuse est accidentellement perforé lors de l'étape 5.6, tirez lentement l'aiguille et injecter 50 ul de PBS après la couche de muqueuse a basculé en arrière sur la pointe de l'aiguille.
8. Retirer l'aiguille.

6. Intra-muros inoculation de cellules cancéreuses de la vessie

1. Attacher une seconde seringue 1,0 ml (rempli avec des cellules cancéreuses mises en suspension dans du Matrigel) avec un 30 G, ¾ en aiguille à l'étrier de seringue.
2. Guider la pointe de l'aiguille à la mêmeEspace PBS-rempli qui a été créé à l'étape 5.7.
3. Injecter 40 ul de la suspension cellulaire dans cet espace [Figures 3 V et VI].
4. Retirer l'aiguille.

7. Soins de soutien post-interventionnelle

1. Démonter la souris à partir de la plate-forme d'imagerie.
2. Garder l'animal dans un environnement confortable et chaleureux sous surveillance continue lors de la récupération de l'anesthésie.
3. Après avoir repris conscience et de reprendre la marche normale, placez le dos de l'animal dans sa cage.

Injection intra-muros de trois lignées cellulaires de tumeurs différentes (UM-UC1 luc, UM-UC3 luc et UM-UC13 luc) a été réalisée dans 50 animaux sous échographie orientation sur trois jours consécutifs. L'inoculation a été réalisée avec l'efficacité (temps moyen de 5,7 min / animal) et n'a pas été associée à des complications intra-ou post-interventionnelles.

Le suivi de la croissance tumorale a été effectuée par imagerie par ultrasons et la bioluminescence. Le jour # 3 une tumeur a pu être détecté par échographie de la vessie antérieure de tous les 50 animaux [Figure 4 I]. 98% des souris ont montré une croissance tumorale constante au cours de la période de suivi [Figures 4 et 5]. Suite à l'inoculation de UM-UC3 luc, une souris a développé la dissémination tumorale intrapéritonéale et la tumeur involution après jour # 7 dans un deuxième animal [Tableau 1]. Il s'agissait du premier groupe de souris inoculées avec cette nouvelle technique.

Figure 1. L'image et l'illustration schématique du dispositif expérimental. L'souris est monté sur la table d'opération chauffée (I) et maintenu sous anesthésie (<strong> II) avec le mélange d'isoflurane / oxygène de 3%. Les membres inférieurs sont fixés avec une bande de caoutchouc (III). Après s'approchant de la tête de balayage à ultrasons (IV) sur la peau (d'alignement longitudinal avec un angle de 45-70 ° crânienne) la vessie (V) est visualisée sur l'écran de l'échographie. Une seringue avec une aiguille 30 G (VI) est guidé sur la peau sous un angle de 30 à 45 ° (de 80 à 90 ° par rapport à l'axe longitudinal de la tête de balayage à ultrasons).

Figure 2. L'immobilisation de la vessie. Dimensions illustration et de construire la sangle de stabilisation de la vessie (I) La sangle est attachée à l'abdomen inférieur et immobilise la vessie (II). Ainsi, une évasion de la la vessie lors de l'injection intra-muros est évitée.

Figure 3. Inoculation intra-muros de cellules tumorales. Visualisation de la vessie sur l'écran d'ultrasons (I). La perforation de la peau et des muscles de la paroi abdominale (II). l'insertion dans la paroi de la vessie de l'aiguille sans pénétration de la muqueuse (III). PBS (50 ul) entre la couche musculaire et la muqueuse après injection lente (IV). Les cellules tumorales en suspension dans Matrigel dans l'espace intra-muros créé artificiellement (V, VI).

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Figure 4. . Suivi par échographie suivi continu par ultrasons montré une augmentation significative du volume de la tumeur (I: jour # 3, II: jour # 7, III: jour # 13).

Figure 5. Suivi par bioluminescence. Continu suivi par bioluminescence montré une augmentation constante de la luminescence au cours de la période d'étude.

Figure 6. Histologie de xénogreffe tumorale et métastase ganglionnaire., En somme section H & E d'une xénogreffe représentant tu mor démontrant croissance invasive dans le muscle sans invasion dans les organes adjacents (I). 60% des souris portant des tumeurs de luc UM-UC13 et 20% des souris porteuses de UM-UC3 luc tumeurs métastases ganglionnaires rétropéritonéales présentés (II).

Tableau 1. Injection de cellules tumorales guidée par échographie - procédure et les résultats.

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