FIBS-permis non invasive au profil métabolique

Résumé

Une description de la façon d'étalonner les capteurs de transfert Förster Resonance Energy intégrés biologiques (mensonges) pour le profilage métabolique in situ est présentée. Les FIBS peuvent être utilisés pour mesurer les niveaux de métabolites intracellulaires aider de manière non invasive dans le développement de modèles métaboliques et criblage à haut débit de conditions de bioprocédés.

Résumé

À l'ère de la biologie computationnelle, de nouveaux systèmes expérimentaux à haut débit sont nécessaires afin de remplir et d'affiner les modèles de sorte qu'ils peuvent être validées à des fins prédictives. Idéalement, de tels systèmes seraient faible volume, ce qui exclut d'échantillonnage et les analyses destructives lorsque des données de cours du temps doivent être obtenus. Ce qui est nécessaire est un outil de surveillance in situ qui peuvent rapporter les informations nécessaires en temps réel et de façon non invasive. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de concentrations intracellulaires à base de protéines. Une classe particulière de biocapteurs in vivo qui ont trouvé des applications dans métabolite quantification est basée sur le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) entre deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET capteurs biologiques intégrés (mensonges) sont constitutivement produites dans la lignée cellulaire, ils ont un temps de réponse rapide et leur cha spectraletiques changer en fonction de la concentration de métabolite dans la cellule. Dans le présent document, le procédé de construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS de glucose et de la glutamine et l'étalonnage des FIBS in vivo dans une culture cellulaire par lots afin de permettre la quantification future de la concentration en métabolite intracellulaire est décrite. Les données de fed-batch cultures de cellules CHO démontre que les FIBS a pu dans chaque cas, de détecter la variation résultante de la concentration intracellulaire. En utilisant le signal fluorescent à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, la concentration intracellulaire a été déterminée avec précision telle que confirmée par un essai enzymatique indépendante.

Introduction

suivi de métabolite a diverses applications dans les procédés biotechnologiques, y compris le processus de développement, les médias et la conception d'alimentation, et de l'ingénierie métabolique. Diverses méthodes sont disponibles pour la mesure de concentration à l'aide ^d'une enzymatique, chimique ^2, ou des dosages de liaison ^3. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de la concentration intracellulaire des métabolites principaux à base de protéines. Dans les essais de volume ultra-bas, la fluorescence est un outil pra....

Protocole

Une. Cell Line Revival et entretien

1. Ressusciter des cellules CHO dans 9 ml de milieu CD-CHO supplémenté avec 8 mM de L-glutamine et de 10 ml / L supplément 100x hypoxanthine / thymidine (milieu de croissance complet).
2. Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
3. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de croissance frais complet.
4. Retirer un échantillon de 1 ml et déterminer la concentration de cellules viables par microscopie optique en utilisant le procédé d'exclusion de colorant bleu trypan dans un hémocytomètre.
5. Initier une culture à une densité de semis de 3 x 10 ⁵ cellules / ml dans 125 ml ....

Résultats

Un aperçu de la méthodologie est présentée dans la figure 2. Dans le travail présenté ici, les cellules CHO ont été transfectées avec le vecteur d'FIBS et des lignées cellulaires stables ont été sélectionnées à un antibiotique pression de 400 pg / ml de zéocine. Deux lignées cellulaires stables exprimant de manière constitutive séparées de glucose et de glutamine capteurs ont donc été créés. Figure 1 représente les configurations des deux biocapteurs utilisés dans cette étude. Le ca.......

Discussion

Les FIBS permettent in vivo et la quantification in situ des molécules clés dans, dans ce cas des nutriments limitant la croissance, éliminer les incertitudes découlant de la trempe et de l'extraction des méthodes. Les résultats suggèrent qu'il existe une bonne corrélation entre le signal de FIBS et les concentrations intracellulaires de l'ordre de 1-5 mM pour le glucose et 0,3-2 mM pour la glutamine. Dans le lot CHO culture cellulaire, ces concentrations sont rencontrées dans les .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	La lignée cellulaire variera en fonction des objectifs de l’étude
vecteur pCDNA4/TO.	Life Tecnologies
TransIT-PRO Réactif de transfection	Mirus Bio	MIR 5700	transfections peuvent être réalisées à l’aide de n’importe quelle méthode adaptée à la lignée cellulaire étudiée
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	Le milieu de croissance cellulaire dépend des cellules étudiées
100x HT Supplement	Life Technologies	11067-030
L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Lecteur de plaques InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Tout lecteur de plaques à fluorescence à 96 puits capable d’accéder aux longueurs d’onde requises peut être substitué
Filtres pour lecteur de plaques	Tecan	30000463
Maxiprep Kit de purification de plasmides	Qiagen	12163	Tout kit approprié peut être substitué
Amplex Red kit de dosage du glucose/glucose oxydase	Invitrogen	A22189	Tout kit approprié peut être substitué
EnzyChrom  ; Kit de dosage de la glutamine	BioAssay Systems	EOAC-100	Tout kit approprié peut être substitué
Hémocytomètre Neubauer amélioré	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubateur  ;	Nuaire	NU-5510E

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