FIBS-permis non invasive au profil métabolique

Résumé

Une description de la façon d'étalonner les capteurs de transfert Förster Resonance Energy intégrés biologiques (mensonges) pour le profilage métabolique in situ est présentée. Les FIBS peuvent être utilisés pour mesurer les niveaux de métabolites intracellulaires aider de manière non invasive dans le développement de modèles métaboliques et criblage à haut débit de conditions de bioprocédés.

Résumé

À l'ère de la biologie computationnelle, de nouveaux systèmes expérimentaux à haut débit sont nécessaires afin de remplir et d'affiner les modèles de sorte qu'ils peuvent être validées à des fins prédictives. Idéalement, de tels systèmes seraient faible volume, ce qui exclut d'échantillonnage et les analyses destructives lorsque des données de cours du temps doivent être obtenus. Ce qui est nécessaire est un outil de surveillance in situ qui peuvent rapporter les informations nécessaires en temps réel et de façon non invasive. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de concentrations intracellulaires à base de protéines. Une classe particulière de biocapteurs in vivo qui ont trouvé des applications dans métabolite quantification est basée sur le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) entre deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET capteurs biologiques intégrés (mensonges) sont constitutivement produites dans la lignée cellulaire, ils ont un temps de réponse rapide et leur cha spectraletiques changer en fonction de la concentration de métabolite dans la cellule. Dans le présent document, le procédé de construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS de glucose et de la glutamine et l'étalonnage des FIBS in vivo dans une culture cellulaire par lots afin de permettre la quantification future de la concentration en métabolite intracellulaire est décrite. Les données de fed-batch cultures de cellules CHO démontre que les FIBS a pu dans chaque cas, de détecter la variation résultante de la concentration intracellulaire. En utilisant le signal fluorescent à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, la concentration intracellulaire a été déterminée avec précision telle que confirmée par un essai enzymatique indépendante.

Introduction

suivi de métabolite a diverses applications dans les procédés biotechnologiques, y compris le processus de développement, les médias et la conception d'alimentation, et de l'ingénierie métabolique. Diverses méthodes sont disponibles pour la mesure de concentration à l'aide ^d'une enzymatique, chimique ^2, ou des dosages de liaison ^3. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de la concentration intracellulaire des métabolites principaux à base de protéines. Dans les essais de volume ultra-bas, la fluorescence est un outil pratique que la miniaturisation améliore réellement le taux ^{de 4,5} signal-sur-bruit et des capteurs à base de protéines peut être génétiquement codé sens qu'aucun réactifs exogènes sont nécessaires pour l'analyse des métabolites. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biocapteurs sont constitués de deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET est un transfert non radiatif de l'énergie à partir d'un donneur de photo-excitation à un accepteur fluorescent molécule locat ed à proximité (<100). Le clivage de la liaison du ligand ou provoque un changement conformationnel dans le capteur, ce qui, à son tour, induit un changement dans la proximité des fluorophores, ce qui conduit à un changement de l'efficacité de FRET mesuré par le changement dans le spectre d'émission. Des capteurs biologiques intégrés (FRET) sont constitutivement FIBS produits dans la lignée de cellules et leurs caractéristiques spectrales changent en fonction de la concentration du métabolite dans la cellule. FIBS ont des temps de réponse rapide qui les rend idéales pour prendre des mesures pour les modèles dynamiques ^6. Applications précédentes comprennent la surveillance simples ^7-9 et plusieurs métabolites ¹⁰ et fournir des données sur la répartition spatio-temporelle ^11. FIBS peuvent être créés dans deux configurations: Apo-Max, où la liaison du ligand perturbe la proximité des fluorophores abaissement transfert d'énergie et Apo-Min, où la liaison du ligand apporte les deux fluorophores en contact plus étroit (figure 1).

_content "> Dans ce travail, un protocole est présenté pour la construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS pour un métabolite, le glucose ou la glutamine. Une méthodologie est établie pour l'étalonnage du capteur in vivo pour permettre à l'avenir quantitative des mesures de concentration de métabolite intracellulaire, tel que présenté dans la figure 2. Sur cette base, la concentration intracellulaire de glucose ou de la glutamine peuvent être déterminées en fed-batch CHO cultures de cellules, dans laquelle les deux éléments nutritifs ont été ajoutés à des concentrations élevées en cours de fabrication. Les résultats démontrent que l'utilisation du signal de fluorescence à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, avec précision la prédiction de la concentration intracellulaire est possible, comme l'a confirmé par un test enzymatique indépendante. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux technologies d'analyse de courant, car il est peu coûteux non invasive et rapide, donnant un signal en temps réel des FIBS qui peuvent être monitored tout au long de la culture.

Protocole

Une. Cell Line Revival et entretien

1. Ressusciter des cellules CHO dans 9 ml de milieu CD-CHO supplémenté avec 8 mM de L-glutamine et de 10 ml / L supplément 100x hypoxanthine / thymidine (milieu de croissance complet).
2. Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
3. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de croissance frais complet.
4. Retirer un échantillon de 1 ml et déterminer la concentration de cellules viables par microscopie optique en utilisant le procédé d'exclusion de colorant bleu trypan dans un hémocytomètre.
5. Initier une culture à une densité de semis de 3 x 10 ⁵ cellules / ml dans 125 ml secouer les flacons.
6. Maintenir la culture dans un incubateur à 37 ° C, une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2, sur une table d'agitation orbital tournant à 120 tours par minute.
7. Repiquer tous les 3-4 jours dans le milieu de croissance complet à une densité de semis de 2 x 10 ⁵ cellules / ml.

2. La transfection de la lignée cellulaire avec le plasmide Contenant le biocapteur Gene

1. Préparer l'ADN de plasmide en utilisant un kit de purification de plasmide à grande échelle.
2. Maintenir les cellules dans des conditions appropriées (37 ° C, 5% CO ₂₎ de 12 à 24 h avant la transfection afin d'assurer les cellules se divisent activement au moment de la transfection.
3. Compter les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion du colorant bleu trypan, puis préparer un volume de travail de 20 ml de culture cellulaire dans un flacon à secousses de 125 ml à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
4. Utilisation d'un kit de transfection approprié pour la lignée cellulaire utilisée. L'ADN plasmidique à ratio des réactifs de transfection sera fonction de la lignée cellulaire et le vecteur. Il est recommandé que cette est optimisée en testant une gamme de rapports au sein de la gamme spécifiées par le fabricant avant de procéder à des transfections finales. Maintenir en outre au moins une culture témoin négatif contenant les cellules, mais pas d'ADN.
5. Incuber pendant 4 jours en mode statique, puis les transférer à un Shakiplate-forme ng tournant à 125 rpm.
6. Ajouter l'antibiotique approprié pour la sélection de plasmide à une concentration appropriée telle que déterminée par une courbe de destruction. Dans cette étude, la zéocine a été ajouté à une concentration finale de 400 pg / ml pour la sélection des cellules transfectées.
7. Changer de support à un intervalle de temps approprié pour la lignée cellulaire, ajoutant antibiotique à chaque fois, jusqu'à ce que les cellules de contrôle et sont morts.
8. Utilisez les puits les plus confluentes de progresser vers les cultures agitées.
9. Établir une banque de cellules par congélation des cellules dans des flacons cryogéniques contenant 10 ⁷ cellules viables dans 1 ml de mélange gel. Dans ce travail, il s'agit d'un milieu de croissance de 92,5% et 7,5% de diméthylsulfoxyde.

3. Batch et Fed-batch croissance cellulaire Curve

1. Suivez les instructions pour l'entretien des cellules ci-dessus pour établir des cultures de cellules triple des cellules CHO transfectées dans des flacons de 250 ml secouer avec un volume de travail de 50 ml.
2. Maintenir la cultures dans un incubateur humidifié de cellule à 37 ° C, avec 5% de CO _2, sur une plate-forme orbitale secouant tournant à 125 tours par minute, et retirer 4,1 ml des échantillons de chaque culture de plus en plus à intervalles de 24 heures.
3. Utiliser 100 pl de l'échantillon pour déterminer la concentration cellulaire et la viabilité des cellules viables avec la méthode d'exclusion au bleu de trypan colorant.
4. Répéter jusqu'à ce que la concentration de cellules viables est réduit à zéro.
5. Répéter pour les cultures de cellules fed-batch en complétant avec la quantité appropriée de glucose ou de la glutamine au jour 6 de restaurer leurs concentrations à leurs valeurs initiales de 36 mm et 4 mm, respectivement. Il est recommandé que les cultures de contrôle supplémentaires sont également maintenues, qui doivent être alimentés avec le même volume (12 ml dans le cas présent) de l'eau pure.

4. FRET Ratio mesures

1. Prendre 2 ml des échantillons quotidiens retirées à l'étape 3.2 ci-dessus et centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C.
2. Resuspterminé le culot de cellules dans 2 ml de glace froide saline tamponnée au phosphate (PBS). Transférer cette dans une plaque à 6 puits et ajouter un échantillon témoin ne contenant pas de cellules pour un bien.
3. Mesurer les niveaux de fluorescence bleue et jaune immédiatement à une longueur d'onde d'excitation de 430/435 nm et d'émission des longueurs d'onde de 465/435 nm (bleu) et 520/510 nm (jaune).
4. Calculer les rapports de FRET (ratio de fluorescence jaune détecté sur fluorescence bleue détecté).

5. Métabolite dosages

1. Prendre 2 ml des échantillons quotidiens retirées à l'étape 3.2 ci-dessus et centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.
2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de PBS glacé et centrifuger à nouveau à 100 x g pendant 5 min.
3. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de PBS refroidi à la glace comme ci-dessus. Soniquer l'échantillon 5x pendant 3 min chacune à une impulsion de 15 secondes sur 15 secondes et éteint. À ce stade, la cellule supplémentairects peuvent être congelées si vous le souhaitez.
4. Utilisez un kit de dosage du glucose approprié selon les instructions du fabricant sur des échantillons d'extraits cellulaires pour déterminer la concentration intracellulaire de glucose (voir tableau des matériaux).
   Remarque: Utilisez des normes appropriées pour construire une courbe standard. Dans ce travail, la concentration de normes variait entre 0 à 100 mM.
5. À partir des valeurs pour les normes, construire la courbe d'étalonnage et de trouver l'équation linéaire de meilleur ajustement (dans ce cas: y = 1310.51x - 723,43 où y est la lecture de l'absorbance et x est la concentration de glucose).
6. Calculer les concentrations de glucose en utilisant la courbe d'étalonnage et en tenant compte de la dilution. La concentration intracellulaire de glucose peut alors être calculée en utilisant l'équation suivante:
   
   Pour les cellules CHO, le volume de la cellule unique a été calculée en utilisant un diamètre de cellule de 12 uM ¹²
7. Utilisez un kit de dosage de la glutamine appropriée selon les instructions du fabricant sur des échantillons d'extraits cellulaires pour déterminer la concentration de glutamine intracellulaire (voir tableau des matériaux).
   Remarque: Utilisez des normes appropriées pour construire une courbe standard. Dans ce travail, la concentration des normes variait entre 0-2 mM.
8. Comme dans 5.5 ci-dessus, la construction de la courbe d'étalonnage (dans ce cas y = + 17,1 203.1x où y est la mesure d'absorbance et x est la concentration de glucose)
9. En utilisant la courbe d'étalonnage, calculer la concentration de glutamine des échantillons, en tenant compte de la dilution. La concentration de glutamine intracellulaire peut être calculée en utilisant l'équation 1 ci-dessus.

Résultats

Un aperçu de la méthodologie est présentée dans la figure 2. Dans le travail présenté ici, les cellules CHO ont été transfectées avec le vecteur d'FIBS et des lignées cellulaires stables ont été sélectionnées à un antibiotique pression de 400 pg / ml de zéocine. Deux lignées cellulaires stables exprimant de manière constitutive séparées de glucose et de glutamine capteurs ont donc été créés. Figure 1 représente les configurations des deux biocapteurs utilisés dans cette étude. Le capteu...

Discussion

Les FIBS permettent in vivo et la quantification in situ des molécules clés dans, dans ce cas des nutriments limitant la croissance, éliminer les incertitudes découlant de la trempe et de l'extraction des méthodes. Les résultats suggèrent qu'il existe une bonne corrélation entre le signal de FIBS et les concentrations intracellulaires de l'ordre de 1-5 mM pour le glucose et 0,3-2 mM pour la glutamine. Dans le lot CHO culture cellulaire, ces concentrations sont rencontrées dans les ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	La lignée cellulaire variera en fonction des objectifs de l’étude
vecteur pCDNA4/TO.	Life Tecnologies
TransIT-PRO Réactif de transfection	Mirus Bio	MIR 5700	transfections peuvent être réalisées à l’aide de n’importe quelle méthode adaptée à la lignée cellulaire étudiée
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	Le milieu de croissance cellulaire dépend des cellules étudiées
100x HT Supplement	Life Technologies	11067-030
L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Lecteur de plaques InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Tout lecteur de plaques à fluorescence à 96 puits capable d’accéder aux longueurs d’onde requises peut être substitué
Filtres pour lecteur de plaques	Tecan	30000463
Maxiprep Kit de purification de plasmides	Qiagen	12163	Tout kit approprié peut être substitué
Amplex Red kit de dosage du glucose/glucose oxydase	Invitrogen	A22189	Tout kit approprié peut être substitué
EnzyChrom  ; Kit de dosage de la glutamine	BioAssay Systems	EOAC-100	Tout kit approprié peut être substitué
Hémocytomètre Neubauer amélioré	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubateur  ;	Nuaire	NU-5510E